楚志剛，田云芳

(1.鄭州師范學(xué)院 信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450044；2.鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450044；3.鄭州市觀賞藥用特色資源植物重點(diǎn)實驗室，河南 鄭州 450044)

蕙蘭()，蘭科蘭屬，又稱夏蕙、九節(jié)蘭等，是傳統(tǒng)意義上中國蘭花的一大種類，是我國二級保護(hù)珍稀物種，觀賞和經(jīng)濟(jì)價值較高?，F(xiàn)階段蘭科植物研究在分子水平上多集中于觀賞蝴蝶蘭(ssp.)、藥用石斛(ssp.)及切花文心蘭(ssp.)等洋蘭。隨著分子生物學(xué)研究的深入，蘭花花發(fā)育及花期研究方面有了較大的進(jìn)步，但是蕙蘭花期調(diào)控相關(guān)基因的研究還不多見。

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding protein， PEBP)家族基因被認(rèn)為是調(diào)節(jié)植物營養(yǎng)階段轉(zhuǎn)向生殖階段的關(guān)鍵基因，決定植物的生殖生長和某些組織形態(tài)構(gòu)建。PEBP家族基因含3個亞家族：分別是FT-like(和)、TFL-like(1、和)和MFT-like。FT-like是非常重要的開花調(diào)控因子，被稱作“成花素”；TFL-like則功能相反，可以抑制花原基的形成，從而使開花延遲；MFT-like主要表達(dá)于種子，影響脫落酸(ABA)與赤霉素(GA)信號通路，調(diào)控種子發(fā)育和萌發(fā)。

在許多植物中已分離到PEBP家族基因，例如龍眼()、荔枝()、蝴蝶蘭()、菊花()、玫瑰()、矮牽牛()、向日葵()、郁金香()、春蘭()、萬代蘭()等。荔枝、蝴蝶蘭、玫瑰、矮牽牛等園藝植物的同源基因過表達(dá)都能使其出現(xiàn)早花現(xiàn)象，龍眼的1是晚花基因；向日葵的1基因和郁金香的1和3基因均是抑制成花的基因。

在種子進(jìn)入休眠狀態(tài)時，基因可以通過啟動()基因的反義 RNA-COOLAIR阻抑其表達(dá)，并改變?nèi)旧|(zhì)而破除休眠。梨的2基因過表達(dá)可以促進(jìn)蘋果的營養(yǎng)生長、延遲其休眠和葉片衰老。Gao等在研究藍(lán)莓時發(fā)現(xiàn)過表達(dá)基因會導(dǎo)致藍(lán)莓植株提前開花和矮化。在李樹中過表達(dá)楊樹的基因不僅可以使李樹提前開花，還能改變李樹的形態(tài)，使其分枝化情況更為嚴(yán)重。而洋蔥1和4對鱗莖形成的作用則相互拮抗。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)基因可以調(diào)控氣孔的開與關(guān)，比如過表達(dá)的基因轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為氣孔開放，而-1突變體則表現(xiàn)為氣孔關(guān)閉。

由于PEBP家族基因在植物發(fā)育特別是營養(yǎng)生長到生殖生長發(fā)育轉(zhuǎn)變過程中的調(diào)控作用及在植物育種中的應(yīng)用前景，其功能研究及作用機(jī)制成為目前研究熱點(diǎn)之一。不同植物中常常具有較多的PEBP家族基因，不同的基因很可能功能不同，因此要厘清植物PEBP家族基因的分子作用機(jī)制，首先要明確PEBP家族基因植物中的功能。

目前在花期和植物生長形態(tài)調(diào)控功能上，PEBP家族基因的研究較多，而蕙蘭開花及逆境脅迫中PEBP功能和作用機(jī)制有待清晰。本文利用同源克隆法得到基因的 cDNA序列，進(jìn)行時空表達(dá)，并對CfPEBP蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為深入探究蕙蘭PEBP家族基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用蕙蘭來自大別山，種植于鄭州師范學(xué)院觀賞、藥用蘭花河南省工程實驗室，用蕙蘭花蕾期葉片為材料進(jìn)行基因克隆。另取蕙蘭3個發(fā)育時期的13種器官和組織為試驗材料，包括成苗期的根和葉片，花蕾期的根、葉片和花葶，盛花期的根、葉片、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱、子房材料進(jìn)行實時熒光定量表達(dá)分析。材料取后迅速用液氮速凍，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

方法參照田云芳等。蕙蘭不同器官和組織的總RNA采用TRIzol Reagent (Ambion)提取，蕙蘭花蕾階段葉總RNA用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)進(jìn)行合成cDNA，用于蕙蘭基因克隆。實時熒光定量PCR 所用cDNA 用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)進(jìn)行合成，稀釋10倍備用。

1.3 蕙蘭PEBP基因克隆

根據(jù)GenBank中已登錄AB052943(水稻)、AY705794(小麥)、AK376849(大麥)、NM_001112781(玉米)、GU324590(黑麥)等相關(guān)早花基因序列高度保守區(qū)，采用Primer Premier5.0設(shè)計引物(表1)，用于克隆基因片段序列。PCR反應(yīng)程序： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，59.5 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。凝膠回收，連接到pMD19-T，轉(zhuǎn)化DH5α，鑒定送測。

根據(jù)中間片段設(shè)計3′端巢式引物3F1和3F2、5′端巢式引物5R1和5R2(表1)，分別結(jié)合3′-RACE(TaKaRa)試劑盒引物3′-RACE Inner Primer和3′-RACE Outer Primer、5′-RACE(Clontech)試劑盒引物NUP和UPM進(jìn)行目的基因的RACE擴(kuò)增。

按3′-RACE(TaKaRa)說明將蕙蘭總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，分別于57 ℃(PCR程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min)和57.2 ℃(PCR程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，57.2 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min)進(jìn)行PEBP 3′-RACE巢式PCR反應(yīng)，回收PCR產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化、測序。

按5′-RACE(Clontech)說明將蕙蘭總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，分別于65 ℃(PCR程序： 94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min)和54.2 ℃(PCR程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，54.2 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min)進(jìn)行PEBP 5′-RACE巢式PCR反應(yīng)，回收目的片段、轉(zhuǎn)化、測序。

將保守片段、3′端和5′端序列在DNAMAN中進(jìn)行拼接，得到該基因的cDNA全長，并查找ORF及推導(dǎo)氨基酸序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

NCBI比對查找ORF (www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，進(jìn)行BLAST比對(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)；將序列登錄至GenBank；利用ProtParam (web.expasy.org/protparam/)預(yù)測分子式、pI、分子量與不穩(wěn)定指數(shù)；利用PROSITE (prosite.expasy.org/)預(yù)測其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能域；通過Protscale (web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行疏水性分析；信號肽通過SignalP-5.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測；用NetPhos 3.1 Server (www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測蛋白磷酸化位點(diǎn)；TMHMM Server v.2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)跨膜預(yù)測；輸入PSORT (psort1.hgc.jp/form.html)、Plant-PLoc (www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/) 和WoLF PSORT網(wǎng)站 (wolfpsort.hgc.jp/) 進(jìn)行亞細(xì)胞定位；應(yīng)用PRABI (npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_ gor4.html)和PredictProtein (predictprotein.org/)預(yù)測卷曲螺旋；通過SWISS-MODEL (swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html)三維建模。利用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 CfPEBP基因擴(kuò)增和表達(dá)引物

1.5 密碼子偏好性分析

本研究利用EMBOSS軟件包中CodonW計算有效密碼子數(shù)(effective number of codon，ENC)、GC含量、GC3s (第3位堿基GC含量)等；CHIPS計算同義密碼子相對使用度(Relative synonymous codon usage， RSCU)；CUSP計算密碼子使用頻率(Frequency)。分別采用Excel、SPSS和R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 CfPEBP基因時空表達(dá)

根據(jù)所獲得蕙蘭PEBP家族基因序列設(shè)計1對特異引物PEBP-QF和PEBP-QR，以蕙蘭(JN177718)和3(KC794503)為內(nèi)參基因，引物為ACT-QF、ACT-QR和UBQ3-QF、UBQ3-QR，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ kit(TaKaRa)進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。反應(yīng)在熒光定量PCR儀(Eppendorf)上進(jìn)行。實驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù)。相對表達(dá)量按照2-ΔΔC法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 CfPEBP基因克隆

以蕙蘭花蕾期的葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以PEBP-F和PEBP-R為引物(表1)，獲得300 bp的基因中間產(chǎn)物片段(圖1-A)。結(jié)合5′-RACE和3′-RACE，分別獲得850 bp 的5′端序列(圖1-B)和3′端620 bp序列(圖1-C)，兩端產(chǎn)物與基因中間序列均有重合。三段核苷酸序列經(jīng)DNAMAN軟件拼接，獲基因cDNA序列全長，長度為768 bp，其中，3′-UTR為160 bp，5′-UTR為77 bp，ORF為 531 bp，推測的氨基酸176個(圖2)。在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLASTN分析，發(fā)現(xiàn)此序列與春蘭()的基因(HM106985) 有100%的相似性，與春蘭()、墨蘭()、建蘭()和蕙蘭()的基因(HM120863、HM120862、HM803115、HQ164434)有99%以上的相似性。因該基因具有PEBP功能結(jié)構(gòu)域(圖3)，故將此基因命名為，登錄號為MT795710，蛋白登錄號為AHB86975。

A.CfPEBP基因片段 B.5′-RACE C.3′-RACEM， DL 2000分子量標(biāo)記物； 1-3， PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。M， DL 2000 marker； 1-3， PCR product.圖1 CfPEBP基因克隆Fig.1 Cloning of CfPEBP gene

圖2 CfPEBP基因序列和推測的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide acid sequence and deduced amino of CfPEBP

2.2 CfPEBP氨基酸序列比對

用BLASTX將CfPEBP翻譯成氨基酸，功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列包含一個PEBP功能域(圖3)。序列比對分析表明，的氨基酸序列與春蘭FT(ADI58462) 具有100%的相似性，與蕙蘭FT(ADW76861)具有99%的相似性，與石斛FT(AVW83070)的同源性有96%、文心蘭FT(QLM02196)同源性為92%、杜鵑茶FT(QII80827)同源性為86%，保守性較強(qiáng)。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 蛋白質(zhì)序列理化參數(shù)及親疏水性

利用 ProtParam分析發(fā)現(xiàn)該蛋白包括176個氨基酸，分子式為CHNOS，分子量為19 848.39 u；等電點(diǎn)pI為6.42；精氨酸(10. 2%)和纈氨酸(10.8%)含量較高，不穩(wěn)定參數(shù)為43.37，脂溶指數(shù)為80.74，GRAVY值為-0.311。利用 Protscale進(jìn)行疏水性分析，10、120、125氨基酸位點(diǎn)附近有3 處高分值(Score>1.5) 峰，屬于疏水性區(qū)域；而75、80、140、170 氨基酸位點(diǎn)附近有5處低分值(Score<-1.5) 峰，屬于高親水性區(qū)域，是蛋白質(zhì)進(jìn)化中氨基酸的主要插入位點(diǎn)。

2.3.2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位

利用PRABI網(wǎng)站預(yù)測，該蛋白由6.82%的α-螺旋、30.68%的延伸鏈和62.50%的無規(guī)則卷曲所組成。利用PredictProtein預(yù)測，該蛋白包含無規(guī)則卷曲67.61%、螺旋結(jié)構(gòu)7.95%和片層結(jié)構(gòu)24.43%。

利用NetPhos 3.1 Server預(yù)測磷酸化位點(diǎn)有絲氨酸(Ser) 9個，蘇氨酸(Thr)5個，酪氨酸(Tyr)1個。TMHMM Server v. 2.0跨膜預(yù)測表明，CfPEBP 跨膜肽鏈位于膜外側(cè)，無跨膜結(jié)構(gòu)域。SignalP-5.0分析顯示該蛋白不具有信號肽結(jié)構(gòu)域。

利用PSORT分析亞細(xì)胞定位的可能性是：細(xì)胞質(zhì)45%、微體39.2%、溶酶體30.3%、線粒體基質(zhì)空間10%，該蛋白極可能是一種細(xì)胞質(zhì)或者微體蛋白。利用WoLF PSORT分析顯示該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為55.14%。同時利用Plant-PLoc定位分析表明該蛋白定位于細(xì)胞核。

2.3.3 三級結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)預(yù)測

通過同源建模(模板：6igj.1.A；同源性：76.07%) ，發(fā)現(xiàn)CfPEBP所編碼蛋白左側(cè)主要是α-螺旋結(jié)構(gòu)，右側(cè)主要是β-折疊，兩區(qū)域通過長鏈卷曲連接(圖4)。利用PROSITE預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有PEBP功能域。

2.3.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹

系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)構(gòu)建表明，與春蘭、建蘭、墨蘭的親緣關(guān)系較近，與文心蘭、石斛的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，與綠竹、毛竹的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。說明PEBP亞家族成員存在種屬特異性，同時也可以看出同一物種的同一類PEBP亞家族成員序列存在較大差異。

圖3 CfPEBP蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 CfPEBP conservative protein domain structure

圖4 CfPEBP蛋白Swiss-model 建模(左)及功能位點(diǎn)預(yù)測(右) Fig.4 Swiss-model modeling (left) and functional site prediction results (right) of CfPEBP

圖5 CfPEBP基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of CfPEBP sequences

2.3.5 密碼子偏好性分析

物種進(jìn)化中，會出現(xiàn)對密碼子選擇不平衡，即密碼子使用偏好性 (codon usage bias，簡稱密偏性)。利用CodonW 計算蕙蘭基因 ENC值為57.37，GC含量為0.513，GC3s 值為0.497。當(dāng)ENC≤35時該基因密偏性較強(qiáng)，CfPEBP的ENC值偏大，密偏性較弱，各密碼子使用頻率較為一致；且密碼子適應(yīng)指數(shù) (CAI) 為 0.161，小于1，說明的密偏性較弱。密碼子末位為 T(U)、C、A、G 的頻率分別為0.296 8、0.354 8、0.305 3、0.238 1。

CHIPS 在線計算蕙蘭基因密碼子的RSCU值，結(jié)果表明，除AUG起始密碼子和UGA、UAG、UAA終止密碼子外，的密碼子中RSCU>1的有22種，偏性較強(qiáng)的有GGC、AGA、AGU、AAG、CCA、CUC (RSCU≥2)。

在線NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取18個PEBP基因的 CDS樣本。統(tǒng)計表明(表2)，GC為54.07%、密碼子第1、2和3位上的GC含量即GC1s、GC2s、GC3s分別為57.80%、45.90%、58.51%，呈現(xiàn)GC3s>GC1s>GC2s。18個CDS編碼的蛋白使用頻率最高的密碼子為GGC(甘氨酸)，最低的為 AAA(賴氨酸)。

表2 PEBP基因密碼子特性參數(shù)

表3表明，18個物種PEBP家族基因的CAI值范圍為0.138～0.241，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，說明密偏性較弱。ENC均值50.38，均在35以上，說明密偏性有差異且基因表達(dá)水平不同，與基于CAI的分析結(jié)果相似?；赗SCU，蕙蘭HQ164434、文心蘭KJ909968、文心蘭EU583502、石斛MF063061、香蕉KF853468、牽牛AB154823的密偏性較強(qiáng)，均有25個以上RSCU值>1的密碼子。

采用 R語言進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，GC與C3s、G3s、CAI、FOP、GC3s在<0.01水平上正相關(guān)，與U3s、A3s、ENC在<0.01水平上負(fù)相關(guān)；ENC與C3s、G3s、CAI、FOP、GC3s、GC負(fù)相關(guān)，與 U3s、A3s均在<0.01水平上正相關(guān)，說明不同物種基因所編碼的氨基酸組成較為相似(圖6)。

中性分析發(fā)現(xiàn)(圖7-A)，密碼子第3位平均GC含量(GC3)的范圍為0.390～0.866，密碼子第1、2位平均GC含量(GC12)在0.49～0.53，大部分基因分布于回歸線兩側(cè)，線性回歸系數(shù)為0.1249，其堿基組成差異不大，尤其是剛好分在對角線的少數(shù)基因，主要受突變壓力影響。

表3 不同物種間PEBP家族基因的偏好性參數(shù)分析

**表示達(dá)極顯著水平(P<0.01)。** represented the significant difference (P<0.01).圖6 PEBP家族基因密碼子特性參數(shù)之間的相關(guān)性Fig.6 The correlation coefficient between the codon usage parameters of PEBP gene family

圖7 PEBP中性繪圖(A)、ENc-plot(B)和PR2-plot(C)分析Fig.7 Neutrality plot (A)， ENc-plot (B) and PR2-plot (C) analysis of PEBP

從ENC對 GC3s的分布圖7-B中可以看出，18個物種PEBP家族基因分布范圍不大，表明PEBP基因密偏性不僅受突變壓力的影響，且受突變壓力影響程度相近。

PR2分析(PR2 bias plot analysis) (圖7-C)，從橫坐標(biāo)來看，分布于0.5區(qū)域的左右兩側(cè)表明密碼子對G、C沒有顯著的偏性。從縱坐標(biāo)來看，分布集中在<0.5的區(qū)域說明密碼子對A、T具有一定的偏性。由此推斷突變壓力與自然選擇等其他壓力在不同物種PEBP家族進(jìn)化過程中均發(fā)揮一定作用。

R語言構(gòu)建不同物種PEBP家族基因RSCU的層次聚類分析(圖8)結(jié)果表明，不同物種對于GGC、AGG、AGA、AGC、AGU、UGC、GAG、AAG、UAC、GCC、CCA、CUC的偏好性超過其他密碼子。

以蕙蘭成苗期、花蕾期、盛花期的根、葉、花等組織的總RNA做為模板，分析了蕙蘭基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明(圖9)，基因在蕙蘭盛花期葉中表達(dá)量最高，在花蕾期花蕾中表達(dá)量次之，在盛花期花葶中也有表達(dá)，在花蕾期葉、花葶和盛花期的花被片、合蕊柱中輕微表達(dá)，在苗期和子房中幾乎不表達(dá)；在3個生長階段的表達(dá)量順序是盛花期>花蕾期>成苗期。

3 討論

植物中，PEBP家族基因主要參與種子發(fā)育、萌發(fā)、休眠和花期調(diào)控等生理過程。本研究從蕙蘭花蕾期葉片中克隆了1個PEBP家族基因，對應(yīng)176個氨基酸，具典型PEBP結(jié)構(gòu)功能域。氨基酸序列比對表明，該基因?qū)儆?like亞家族，與許多單子葉植物的類基因具有90%以上的同源性，其中與春蘭、墨蘭等的類基因具有99%以上的相似性； 氨基酸序列保守性強(qiáng)。而該基因與曾報道的蝴蝶蘭、石斛的序列差異相對較大。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CfPEBP具有15個磷酸化位點(diǎn)，Corbit等研究表明，PEBP也具多個磷酸化位點(diǎn)，二者預(yù)測結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明該蛋白極可能是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白或微體蛋白，也可能定位于細(xì)胞核。前人研究中，陸地棉1、2以及大豆1均位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，這與本研究預(yù)測結(jié)果一致。

密碼子是生物體內(nèi)遺傳信息傳遞的基本環(huán)節(jié)，密碼子偏好性分析可用于進(jìn)一步理解物種的遺傳進(jìn)化。本研究通過計算RSCU確定了GGC、AGG、AGA、AGC、AGU、UGC、GAG、AAG、UAC、GCC、CCA、CUC密碼子為PEBP家族基因中的高頻密碼子。前人研究認(rèn)為，基于密偏性的聚類分析未必能確切反映物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，也有研究表明，利用密碼子偏好性聚類分析可以一定程度上的反映基因特殊個體進(jìn)化規(guī)律，是物種關(guān)系進(jìn)化分析對系統(tǒng)發(fā)育分析的有益補(bǔ)充。此研究中，基于不同植物PEBP ORF核苷酸序列的聚類，比基于密偏性的聚類更符合植物學(xué)分類。前者將同科同屬的物種聚在一起，同源關(guān)系最近。兩種聚類分析有差異，后者可以作為前者聚類分析的補(bǔ)充?；贠RF序列和密偏性相結(jié)合的聚類方法更利于提高分析結(jié)果的可靠性，更能客觀地表示物種的進(jìn)化。根據(jù)密碼子偏好性的改造利用研究也比較普遍，柏錫等根據(jù)馬鈴薯密偏性及高表達(dá)優(yōu)越密碼子分析結(jié)果， 對組織型纖溶酶原激活劑基因(t-PA，GenBank登錄號M15518) 核苷酸序列進(jìn)行改造， 使其在密碼子使用上具有馬鈴薯基因的特點(diǎn)。楊江科等將脂肪酶基因(lipA-syn)經(jīng)密碼子優(yōu)化后在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)表達(dá)72 h后，發(fā)酵液酶活達(dá)176.0 U·mL，蛋白質(zhì)含量為143.7 mg·L，較出發(fā)基因分別提高了10.8倍和5.6倍，實現(xiàn)了該基因的高效表達(dá)。

圖8 PEBP基因的同義密碼子相對使用度(RSCU)的層次聚類分析Fig.8 Hierarchical cluster analysis of relative synonymous codon usage (RSCU) of PEBP genes

G0：成苗期根，Y0：成苗期葉，G1：花蕾期根，Y1：花蕾期葉，T1：花蕾期花葶，L1：花蕾期花蕾，Y2：盛花期葉，E2：盛花期花萼，B2：盛花期花瓣，C2：盛花期唇瓣，R2：盛花期合蕊柱，F(xiàn)2：盛花期子房，T2：盛花期花葶。G0： Root at adult seedling stage，Y0： Leaf at adult seedling stage，G1： Root at bud stage，Y1：Leaf at bud stage，T1： Inflorescence rachis at bud stage，L1：Bud at bud stage，Y2：Leaf at full-blossom stage，E2：Calyx ，B2：Petal ，C2：Lip petal ，R2：Gynostemium，F(xiàn)2：Ovary，T2： Inflorescence rachis at full-blossom stage.圖9 CfPEBP在蕙蘭各組織器官中的表達(dá)Fig.9 Expression of CfPEBP in the tissues of Cymbidium faberi

基因?qū)儆?lik亞家族，-like亞基因家族基因參與春化、自主、光周期、赤霉素、年齡和光敏等多條調(diào)控途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。該基因在表達(dá)較高的部位是盛花期的葉和花蕾期的花蕾，其次是盛花期的花葶。黑喉石斛在盛花期的葉片中表達(dá)量也特別高。孫崇波等研究表明，蕙蘭在幼嫩子房中的表達(dá)量較高，在側(cè)瓣中的表達(dá)量次之，在唇瓣、萼片和蕊柱中的表達(dá)量則很少。與之相比，本研究更全面地探討了基因在不同時期不同組織中的相對表達(dá)。FT同源基因在植物中過表達(dá)能夠阻抑營養(yǎng)生長，從而使?fàn)I養(yǎng)芽轉(zhuǎn)向花芽分化，從而將植物花期提前，在煙草中異源表達(dá)蕙蘭中的基因能促進(jìn)煙草提前開花。蕙蘭中的PEBP基因的功能需要進(jìn)一步研究，本文蕙蘭基因的生物信息學(xué)分析也為其功能研究提供了很好的理論基礎(chǔ)。