趙 洋,劉 振,楊培迪,成 楊,楊 陽

?

密碼子偏性分析方法及茶樹中密碼子偏性研究進展

趙 洋,劉 振,楊培迪,成 楊,楊 陽*

(湖南省農業(yè)科學院 茶葉研究所,國家茶樹改良中心湖南分中心,湖南 長沙 410125)

密碼子偏性指同義密碼子的非均衡使用.研究密碼子偏性模式、密碼子偏性的形成因素具有重要的生物學意義.本文主要闡述了密碼子偏性研究常用的衡量參數(shù)、密碼子使用模式的統(tǒng)計分析方法、影響密碼子偏性的因素及茶樹中密碼子偏性研究進展.

密碼子偏性;同義密碼子;遺傳密碼;茶樹

生物體內遺傳信息傳遞的一個步驟是mRNA通過翻譯合成蛋白質,這一步驟實現(xiàn)不可或缺的一環(huán)是以三聯(lián)體密碼子編碼蛋白質的氨基酸.編碼每一種氨基酸的密碼子數(shù)1～6個,這種密碼子即同義密碼子(synonymous codon).不同的物種偏好使用某類特定的同義密碼子,這種現(xiàn)象即密碼子偏性(codon bias),這些同義密碼子的使用次數(shù)多于其它同義密碼子,被稱作最優(yōu)密碼子(optimal codon).上世紀七十年代研究基因的異源表達時,發(fā)現(xiàn)了密碼子偏性的重要性[1].密碼子偏性在生物界是普遍現(xiàn)象,隨著分子生物學的發(fā)展和大量測序結果公布,以及大量數(shù)據(jù)庫的涌現(xiàn),對密碼子偏性的研究日益增多,涉及分子進化、 翻譯調控等研究領域.已有的研究結果表明,不同物種的密碼子使用模式不同[2-3],親緣關系越近的物種,密碼子使用模式有可能相似.密碼子偏性不僅可以探究基本的生物學問題,應用也較廣泛,可用于提高宿主中外源基因的表達量、預測基因功能以及評估基因的表達水平等.

本文主要闡述密碼子使用偏性的衡量參數(shù)、密碼子使用模式的統(tǒng)計分析方法、密碼子偏性成因及茶樹中密碼子偏性相關研究的進展.

1　密碼子偏性的衡量

1.1相對同義密碼子使用度

某密碼子使用的次數(shù)與其無偏性使用的次數(shù)的比值即相對同義密碼子使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU),無偏性使用次數(shù)為該密碼子編碼的氨基酸所有密碼子的平均使用次數(shù),該值排除了氨基酸組成對密碼子使用產生的影響,能直觀地反映密碼子偏性[4].RSCU為1,說明該密碼子沒有使用偏性; RSCU大于1,說明該密碼子使用頻率相對更高.這一指標計算簡單,對密碼子偏性的反映又很直觀,是應用最多的參數(shù).

1.2密碼子適應性指數(shù)

評價同義密碼子與密碼子最佳使用相符合的程度,常用密碼子適應性指數(shù)(Codon Adaptation Index,CAI)衡量,實際使用的密碼子與最優(yōu)密碼子的RSCU幾何平均數(shù)的比值即為CAI,使用該方法時需要一個高表達基因做參考[4].該值范圍0～1,值越大表示偏性越強,但如果已有的測試基因集合中某些密碼子缺乏相應的參考基因集,將會導致CAI值為0.CAI具有物種特異性,常用于預測物種內的基因表達水平,亦可用來估測外源基因表達水平、衡量翻譯效率、優(yōu)化DNA疫苗等,不能用于不同物種間密碼子偏性的比較.

1.3有效密碼子個數(shù)

評價密碼子偏離隨機選擇使用的程度可以采用有效密碼子個數(shù)(Effective Number of Codon,ENC),該參數(shù)反映同義密碼子使用的偏好程度[5-6].ENC值在20到61之間,每個氨基酸只使用1個密碼子,即密碼子偏性最強時, ENC=20;若所有同義密碼子都被平均使用,即無密碼子偏性時ENC=61.

1.4最優(yōu)密碼子頻率

計算最優(yōu)密碼子和同義密碼子數(shù)量的比值即為最優(yōu)密碼子頻率(Frequency of Optimal Codons,FOP).FOP有物種特異性,不適合對不同物種進行比較,最優(yōu)密碼子的確定需要參考基因集合及相應表達信息[7].FOP值0～l,沒有使用最優(yōu)密碼子時為0,只使用最優(yōu)密碼子即密碼子偏性程度最大時為1.FOP的使用是有限制的,當物種tRNA豐度信息不充分時不能使用.FOP在同一物種內還可反映基因的表達水平,但相關程度不如CAI.

1.5密碼子偏性指數(shù)

還有一個直接反映密碼子偏性的參數(shù)是密碼子偏性指數(shù)(Codon Bias Index,CBI),該參數(shù)的計算需事先設定一個最優(yōu)密碼子使用值為參考,由于不同物種中的最優(yōu)密碼子可能存在不同,所以與FOP一樣,需要高表達基因的最優(yōu)密碼子作為參考,也不適合在不同物種間進行比較[8].CBI值范圍0～1,CBI為1時表示密碼子偏性最大,為0時表示無密碼子偏性,同義密碼子被平均使用.若事先設定的最優(yōu)密碼子的使用次數(shù)少于平均使用次數(shù),CBI將為負值.

1.6GC和GC3

GC是指基因中所有密碼子G和C的總含量,GC3s是指編碼同一氨基酸的同義密碼子第3位上G和C的總含量.GC往往反映方向性突變壓力的強弱,GC3和密碼子偏性有密切關系.

以上方法各有特色,并適用于不同的情況,要特別注意的是CAI、CBI和FOP的計算需要各自的參考數(shù)據(jù)集,而參考數(shù)據(jù)集的建立需要已知一定數(shù)量的基因及其表達豐度信息.

2　密碼子使用模式的分析方法

2.1對應性分析

對應關系分析(Corresponding Analysis, COA)是從多維空間中提取最具影響的軸,將基因和密碼子呈現(xiàn)在低維度空間圖中,主軸上保留了基因間密碼子使用頻率的主要變量及信息,分析COA軸分離出的基因可以獲取密碼子偏性的主要影響因子[9].絕對同義密碼子使用頻率和相對同義密碼子使用頻率會被同時使用到,但在使用所有同義密碼子的平均值時,會生成與RSCU相對應的軸.使用該方法分析時氨基酸組成對密碼子使用的影響被化為主軸上密碼子使用變量的對應關系.

2.2ENC繪圖分析

研究ENC和GC3之間的分布關系時常使用ENC繪圖分析(ENC-plot).ENC-plot中的標準曲線表示當沒有選擇壓力時,密碼子偏性僅由突變壓力決定;若密碼子使用偏性由堿基組成決定,翻譯選擇壓力對密碼子偏性沒有影響或影響很弱時,代表該基因的點將落在標準曲線附近;若密碼子偏性強,而且與基因表達水平存在較強的關系時,ENC值偏小,點則會落在標準曲線下方遠處[5].僅憑ENC-plot還不能準確判斷選擇壓力和中性突變的影響,尤其是當選擇壓力在密碼子第3位存在時.

2.3PR2奇偶偏好分析

DNA的兩條互補鏈之間如果不存在選擇效應上的偏性或任何突變,則堿基含量A與T相等, G和C相等,這是PR2奇偶偏好分析(PR2-bias Plot Analysis)的理論基礎,該法用于分析密碼子第三位上發(fā)生的奇偶偏性,特別是有4個同義密碼子的氨基酸家族.圖的中心處A=T且G=C,縱、橫坐標均是0.5,從這個中心發(fā)出的矢量表示奇偶偏性的方向和程度.

2.4中性繪圖分析

除編碼精氨酸、亮氨酸、絲氨酸的密碼子外,在密碼子第1、2位上發(fā)生的突變多為非同義突變,會引起基因的功能和活性發(fā)生改變,故不常發(fā)生.若無選擇壓力影響,僅受隨機突變或者有一定方向的突變壓力影響,同義密碼子3個位置上的堿基含量相似;若受一定程度的選擇壓力影響,堿基組成在3個位置上則存在差異.中性繪圖分析(neutrality plot)以GC3為橫坐標,以GC12 (指編碼同一氨基酸的同義密碼子第1,2位上G和C的總含量)為縱坐標,每個基因用一個點表示.如果GC12和GC3的差異相似,則密碼子3個位置上無明顯差異,所有的點將沿著對角線分布,說明外界選擇壓力的影響沒有或很弱;如果選擇效應是基因最主要的進化約束力,GC12和GC3的變異差異將會較大.差異越大,回歸曲線的斜率就會越小甚至與橫坐標平行.

3　密碼子偏性的影響因素

密碼子偏性的影響因素很多,比如堿基組成差異[10]、tRNA豐度[11-12]、基因的表達水平[13]、翻譯效率[14]、蛋白質功能[15]、mRNA二級結構[16]等.密碼子偏性在進化過程中的形成原因,主要有 "選擇-突變-漂變"理論[17]和中性學說.中性學說提出密碼子第三位上的突變是中性的,不會對個體生存產生影響,自然選擇對它們不起作用."選擇-突變-漂變"理論認為突變并非隨機的發(fā)生而是有一定方向的,對最優(yōu)密碼子的選擇以及對非同義密碼子的突變-漂變兩方面的作用都在密碼子偏性上得到體現(xiàn).

4　密碼子偏性在茶樹中的研究現(xiàn)狀

密碼子偏性研究在茶樹中的研究近幾年才起步,報道很少.目前的研究結果表明G/C結尾的密碼子在單子葉植物中使用得更多,A/T結尾的密碼子則在雙子葉植物中更受歡迎[18-23].對茶樹基因組密碼子偏性的研究結果表明茶樹偏愛A/T結尾的密碼子[19].茶樹抗寒轉錄調控基因ICE1偏好A/T結尾的密碼子,該基因基于CDS的聚類不能正確反映物種間的進化關系,而基于RSCU的聚類則更適合作為系統(tǒng)發(fā)育分析的參考[24].茶樹低溫響應基因 CsCBF1偏好使用G/C結尾的密碼子,CsCBF1基因的密碼子使用頻率與雙子葉植物中該基因的差異小于與單子葉植物的差異[25].茶樹肌動蛋白基因CsActin1對A/T或G/C結尾的密碼子無偏性.基于RSCU的聚類結果為三類,雙子葉植物為一類,單子葉植物被聚為二類;基于CDS的聚類則將單、雙子葉植物分別各自聚為一類[26].

茶樹ICE1偏愛A/T結尾的密碼子[24], CsCBF1偏愛G/C 結尾的密碼子[25],CsActin1則基本無偏好,推測其原因可能是每個基因受密碼子偏性的進化因素及影響程度不同有關.如看家基因和組織特異性基因、低表達基因和高表達基因間的密碼子偏性受選擇、突變等的影響程度有明顯差異,導致密碼子偏性有所不同[27];另外基因功能的不同,也有可能會對密碼子偏性產生影響,說明茶樹基因的密碼子偏性有可能受多種因素影響.

從基于RSCU和CDS兩種方法的聚類結果差異來看,茶樹ICE1基因的差異較大,而CsActin1基因兩種方法的結果比較一致.這兩種方法的結果存在差異,在其它植物中亦有過報道[24-25,28-30].有學者認為根據(jù)密碼子偏性得到的聚類分析結果并不一定和真實的系統(tǒng)發(fā)育完全一致,在小的分類單元里的結果比大的分類單元里的結果更準確可靠[31].

由于茶樹基因克隆起步較晚,也無基因組數(shù)據(jù)庫,為密碼子偏性研究提供的數(shù)據(jù)有限.目前,茶樹密碼子偏性研究仍處于起步階段,隨著更多茶樹基因序列的獲得,茶樹密碼子偏性的研究將會進一步深入.

[1] Gustafsson C,Govindarajan S,Minshull J.Codon bias and heterologous protein expression[J].Trends Biotech nol, 2004, 22(71)∶346-353.

[2] Chiapello H, Lisacek E, Caboche M, et al. Codon usage and gene function are related in sequences ofArabidopsis thaliana[J]. Gene, 1998, 209(1-2)∶ GC1-GC38.

[3] Powell J R, Sezzi E, Mofiyama E N, et al.Analysis of a shift in cod on usage in Drosophila[J]. J Mol Evol, 2003, 57 (Supp1.1)∶S214-S225.

[4] Sharp P M, Li W H. The codon adaptation index-a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications[J]. Nucleic Acids Res, 1987, 15(3)∶ 1281-1295.

[5] Wright F. The 'effective number of codons' used in a gene[J]. Gene, 1990, 87(1)∶ 23-29.

[6] Fuglsang A. The 'effective number of codons' revisited[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 317(3)∶ 957-964.

[7] Ikemura T. Correlation between the abundance of Escherichia. coli transfer RNAs and the occurrence of the respectivecodons in its protein genes∶ a proposal for a synonymous codon choice that is optimal for the E. coli translational system[J]. J Mol Biol, 1981, 151(3)∶ 389-409.

[8] Morton B R.Chloroplast DNA codon use∶ evidenee for se1ection at the psbA locus based on tRNA availability[J]. J Mol Evo1, 1993, 37(3)∶ 273-280.

[9] Grantham R, Gautier C, Gouy M. Codon frequencies in 119 individual genes confirm consistent choices of degenerate bases according to genome type[J]. Nucleic Acids Res, 1980, 8 (9)∶1893-1912.

[10] Romero H, Zavala A, Musto H. Codon usage in chlamydia trochomatis is the result of strand-specificmutational biases and a complex pattern of selective forces[J]. Nucleic Acids Res, 2000, (28)∶ 2084-2090.

[11]Hambuch T M, Parsch J. Patterns of synonymous codon usage in drosophila melanogaster genes with sex-biased expression [J]. Genetics, 2005, 170(4)∶ 1691-1700.

[12] Moriyama E N, Powell J R. Codon usage bias and tRNA abundance in Drosophila [J]. J Mol Evol, 1997, 45(5)∶514-523. [13] Duret L. 2000. tRNA gene number and codon usage in the C.elegans genome are co-adapted for optimal translation of highly expressed genes[J]. Trends Genet, 2000, 16∶ 287-89.

[14]Stenstrom C M, Jin H N, Major L L, et al. Codon bias at the 3`side of the initiation codon is correlated with translation initiation eficiency in Escherichia coli [J]. Gene, 2001, 263(1-2)∶ 273-284.

[15]Najafabadi H , Goodarzi H, Salavati R. Universal functionspecificity of codon usage [J]. Nucleic Acids Res, 2009, 37 (21)∶ 7014-7023.

[16] Carlini D B, Chen Y, Stephan W. The relationship between third codon position nucleotide content, codon bias, mRNA secondary structure and gene expression in the drosophilid alcohol dehydrogenase genes Adh and Adhr [J]. Genetics, 2001, 159(2)∶ 623-633.

[17]Bulmer M. The selection-mutation-drift theory of synonymous codon usage[J]. Genetics, 1991, 129(3)∶ 897-907.

[18]Kawabe A, Miyashita N T. Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species[J]. Genes & Genetic Systems, 2003,78(5)∶343-352.

[19] 趙洋, 楊陽, 劉振, 等. 茶樹密碼子用法分析[J]. 茶葉科學, 2011, 31(4)∶ 319-325.

[20] Zhou M, Tong C F, Shi J S. A preliminary analysis of synonymous codon usage in poplar species[J]. Plant Physiol Mol Biol, 2007, 33(4)∶285-293.

[21] Liu H M, He R, Zhang H Y, et al. Analysis of synonymous codon usage in Zea mays[J]. Mol Biol Rep, 2010, 37(2)∶677-684.

[22] Wang L, Roossinck M J. Comparative analysis of expressed sequences reveals a conserved pattern of optimal codon usage in plants[J]. Plant Mol Biol., 2006, 61(4-5)∶ 699-710.

[23]Tatarinova T V, Alexandrov N N, Bouck J B, et al. GC3 biology in corn, rice, sorghum and other grasses[J]. BMC Genomics, 2010, (11)∶ 308.

[24]時惠, 王玉, 楊路成,等. 茶樹抗寒調控轉錄因子ICE1密碼子偏性分析[J]. 園藝學報,2012,39(7)∶1341-1352.

[25]郭秀麗,王玉,楊路成,等. 茶樹CBF1基因密碼子使用特性分析[J]. 遺傳,2012,34(12)∶1614-1623.

[26]趙洋, 劉振, 楊培迪,等. 茶樹CsActin1基因密碼子偏性分析[J]. 茶葉通訊, 2014, 41(4)∶13-17.

[27]Mukhopadhyay P, Basak S, Ghosh T C. Differential selective constraints shaping codon usage pattern of housekeeping and tissue-specific homologous genes of rice and Arabidopsis[J]. DNA Res, 2008, 15(6)∶347-356.

[28]馮慧穎, 梁云, 徐雷鋒,等. 百合甘油-3-磷酸?；D移酶(GPAT)基因密碼子偏性分析及其表達受體選擇[J].分子植物育種, 2014, 12(1)∶127-137.

[29]晁岳恩, 吳政卿, 楊會民,等. 11種植物psbA基因的密碼子偏好性及聚類分析[J]. 核農學報, 2011, 25(5)∶ 927-932.

[30]楊春亮,王良,武斌,等. 大豆GmRAV基因的密碼子偏好性分析[J]. 東北農業(yè)大學學報, 2012, 43(7)∶ 34-41.

[31]Christianson M. L. Codon usage patterns distort phylogenies, from or of DNA sequences[J]. Am J Bot, 2005, 92(8)∶1221-1233.

Codon Bias Analysis Method and Research Progress on Codon Bias in Camellia sinensis

ZHAO Yang,LIU Zhen,YANG Pei-di,CHENG Yang,YANG Yang*
(Tea Research Institute of Hunan Academy of Agricultural Science, National Tea Cultivar Improvement Center Hunan Branch, Changsha 410125, China)

Codon bias refers to the nonrandom usage of synonymous codons in organisms. The research on the pattern of codon bias and the formation of codon bias has important biological significance. In this review, we summarize the measurement index about codon bias and analysis methods about usage patterns. The research progress on codon bias in Camellia sinensis are also introduced.

Codon bias, Synonymous codon, Genetic codon, Camellia sinensis

S571.1

A

1009-525X(2016)02-03-07

2015-11-11

2016-03-18

國家茶葉產業(yè)技術體系建設專項(CARS-23)

趙洋(1979-),女,湖南長沙人,副研究員,主要從事茶樹資源與遺傳育種研究.

楊陽,yangyangsir@126.com