崔海超, 鄭文藝，張智慧，傅岳峰，李欣悅，付玉杰,2，顧成波*

(1.東北林業(yè)大學 森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室, 林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心，黑龍江省林源活性物質生態(tài)利用重點實驗室， 哈爾濱 150040； 2.北京林業(yè)大學 林學院，北京 100083)

0 引言

紅豆杉屬植物為常綠喬木或灌木，全世界有11種。我國有4種和1個變種，分別是中國紅豆杉(Taxuschinensis)、云南紅豆杉(Taxusyunnanensis)、西藏紅豆杉(Taxuswallichiana)、東北紅豆杉(Taxuscuspidata)、南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)(變種)。此外，還有引種我國的雜交品種曼地亞紅豆杉(Taxus×mediacv.hicksii)，其母本為東北紅豆杉，父本為歐洲紅豆杉(Taxusbaccata)[1]。

紅豆杉是我國的一級珍稀瀕危保護樹種，含有多種藥用成分。紅豆杉葉可以入藥，具有治療痛經、利尿的功效，主治腎炎浮腫、小便不利和糖尿病等癥。紫杉醇(Paclitaxel)是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中分離得到的一種四環(huán)二萜類生物堿，自1992 年美國FDA批準上市以來，已成為世界上公認的抗癌用藥[2]。

紫杉烷類化合物是與紫杉醇合成代謝相關的二萜類化合物的總稱，目前從紅豆杉屬植物中分離出的紫杉烷類化合物已有500余種[3]。除了紫杉醇，三尖杉寧堿(Taxol B)、巴卡亭Ⅲ(Baccatin Ⅲ)、10-去乙?；涂ㄍ?10-DAB)、10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)、7-木糖-10-去乙?；仙即?7-xyl-10-DAT)和7-表-10-去乙酰基紫杉醇(7-epi-10-DAT)也均是紫杉烷化合物。由于一些紫杉烷類化合物與紫杉醇的結構相似，可作為紫杉烷類藥物的半合成原料，通過結構修飾改造成紫杉醇，甚至藥效更好的化合物，在抗癌藥物合成中具有重要應用[4-5]。

紅豆杉屬植物中紫杉烷類成分含量極低，同時分析檢測多種紅豆杉中紫杉烷類化合物較困難。紅豆杉不同品種、不同年齡，甚至同一品種的不同提取部位，紫杉烷類化合物的含量均有明顯的差異[6-8]。為分析比較不同紅豆杉屬植物中紫杉烷類物質含量的差異，本研究以3種紅豆杉屬植物(東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉)為研究對象，在建立7種紫杉烷類化合物(紫杉醇、10-去乙?；涂ㄍ?、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、10-去乙?；仙即肌?-木糖-10-去乙?；仙即己?-表-10-去乙?；仙即?的高效液相色譜(HPLC)檢測方法的基礎上，對3種紅豆屬植物中紫杉烷類化合物含量進行了比較分析[9-13]，旨在為紅豆杉屬植物的質量控制、種源選育、資源的保護與合理開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉主干樹皮樣品，來源于東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室科研溫室內7年生盆栽苗。

標準品紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭、7-木糖-10-去乙?；仙即己?-表-10-去乙?；仙即紝φ掌?四川省維克奇生物科技有限公司)，純度均大于98%。色譜級乙腈大于等于99.9%(迪馬科技有限公司)，色譜級甲醇大于等于99.9%(迪馬科技有限公司)，分析純甲醇大于等于99.5%(天津市天力化學試劑有限公司)；水為超純水。

1.2 儀器

Agilent Technologies 1290 infinityⅡ高效液相色譜(美國Agilent公司)，HiQsil C18色譜柱(日本KYATECH公司)，1290VWD紫外吸收檢測器(美國Agilent公司)； AB104型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)；RFA-02L型旋轉蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)。

1.3 色譜條件

色譜柱為 HiQsil C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1%體積分數(shù)乙酸水溶液和乙腈-1%體積分數(shù)乙酸水溶液4種不同流動相體系及4種不同檢測波長(227、250、273、228 nm)下各紫杉烷類成分的色譜行為。根據基線分離效果，采用乙腈-水作為流動相；梯度洗脫程序為：0～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈；流速為1 mL/min；檢測波長為227 nm(篩選了4種檢測波長，最終確定227nm為最佳檢測波長)；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

1.4 對照品溶液制備

分別稱取7種紫杉烷類化合物的標準品10 mg，添加質量分數(shù)100%色譜級甲醇溶液溶解并將其定容到10 mL的容量瓶中，使樣品溶液均成質量濃度為1 mg/mL的標準貯備液。使用0.22 μm微孔濾膜過濾，置入-20 ℃待用。

1.5 供試品溶液的制備

參考文獻[10]的方法并稍做改動，將東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉主干樹皮洗凈，于60 ℃干燥后粉碎樣品。每種紅豆杉樣品取粉末1.0 g于50 mL的錐形瓶中，加入30 mL 80%乙醇，超聲提取30 min，過濾，重復此操作2次，收集3次樣品溶液濾液，合并3次濾液。濾液經過濃縮后加入甲醇溶液溶解定容到一定體積，分離液加入等量等比例脫脂溶液(乙酸乙酯)脫脂，放置過夜，對其離心去上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到3份不同紅豆杉屬植物制得的樣品，各取2 mL不同樣品混合均勻，之后進行紫杉烷類化合物的檢測。

1.6 線性關系及精密度、重現(xiàn)性試驗

取7種紫杉烷類化合物的混合對照品溶液，使用100%甲醇逐級稀釋，按1.3確定的色譜條件檢測，根據上述的對照品質量濃度及測定的峰面積分別繪制出各紫杉烷類化合物的標準曲線，每條標準曲線由6個不同質量濃度組成，峰面積為3次重復進樣測得的平均值。

取7種混合對照品溶液，按1.3確定的色譜條件，分別將同一對照品溶液重復測定6次，分析每次測定的對照品的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)，考察檢測方法的精密度。

取同一批3種紅豆杉樹皮適量，每批平行制備6份供試溶液，在設定的液相色譜條件下進樣，測定其中所含7種紫杉烷類化合物的含量，對紫杉烷類化合物的含量進行比較，考察試驗方法的重現(xiàn)性。

1.7 加樣回收率試驗

取14份配制好的東北紅豆杉樣品溶液，分別加入對照品，2種標準品質量不同，在所設定的色譜條件下進樣測定，計算加樣回收率。

加樣回收率計算公式為

(1)

式中：C1為所測功能成分總量；C2為樣品中功能成分質量；M為加入標準品后功能成分質量。

1.8 數(shù)據處理

應用 Excel 進行數(shù)據整理和繪圖，用 SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 HPLC檢測結果分析

2.1.1 不同高效液相色譜條件下檢測結果

已有研究中對紫杉烷的檢測方法較多[11-14]，但多限于3～5種物質的同時檢測，且基線分離效果差，由于紫杉烷類化合物具有相近的極性和化學結構，導致同時分析多組分紫杉烷類成分難度較大[15-17]。為了使7種紫杉烷類化合物完全分離、色譜圖基線平穩(wěn)，本研究考察了7種紫杉烷類化合物在228、250、273、227 nm 波長下的出峰情況，以及4種不同流動相(乙酸-甲醇、乙酸-乙腈、水-甲醇和水-乙腈)體系對各紫杉烷類化合物色譜出峰行為的影響[18-19]，圖1為不同波長下檢測的出峰情況。最終確定為分離條件為乙腈-水，梯度洗脫(0～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈)；紫外檢測波長為227 nm。液相分析方法的建立主要考察流動相體系、檢測波長、流動相比例；本實驗分別采用4種流動相體系及4種檢測波長，根據7種紫杉烷類化合物的基線分離效果對流動相體系和檢測波長進行優(yōu)化，確定最佳流動相和檢測波長。流動相比例是采用梯度洗脫，逐級摸索流動相的比例確定，在液相方法的建立中通常給定最佳條件即可，因為是梯度洗脫，流動相比例是逐級改變的。

1.10-去乙酰基巴卡亭，2.巴卡亭Ⅲ，3.7-木糖-10-去乙?；仙即迹?.10-去乙?；仙即迹?.三尖杉寧堿，6.7-表-10-去乙?；仙即?，7.紫杉醇

圖2為在檢測波長227 nm、流動相為水-乙腈優(yōu)化條件下各紫杉烷標準品與樣品色譜圖，7種紫杉烷類化合物出峰順序為：10-去乙?；涂ㄍ?、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙?；仙即肌?0-去乙?；仙即肌⑷馍紝帀A、7-表-10-去乙?；仙即?、紫杉醇。

1.10-去乙酰基巴卡亭,2.巴卡亭Ⅲ,3.7-木糖-10-去乙?；仙即?4.10-去乙?；仙即?5.三尖杉寧堿,6.7-表-10-去乙?；仙即?7.紫杉醇

2.1.2 線性回歸分析

吸取對照品溶液2 mL，使用質量分數(shù)100%甲醇依次進行2倍稀釋，在所設定的色譜條件下測定各紫杉烷類化合物含量。以各成分質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，結果見表1。結果表明，7種紫杉烷類化合物在所測定的線性范圍內均具有良好的線性關系，決定系數(shù)均在0.995 2以上。

表1 各紫杉烷類化合物各成分線性回歸結果

2.1.3 精密度和重現(xiàn)性分析

精密度試驗取對照品溶液，在所設定的色譜條件下進行6次測定。精密度試驗結果顯示，在本試驗檢測條件下，10-去乙?；涂ㄍぁ涂ㄍあ?、7-木糖-10-去乙?；仙即?、10-去乙?；仙即肌⑷馍紝帀A、7-表-10-去乙?；仙即己妥仙即嫉纳V峰出峰時間相對標準偏差(RSD)分別為0.94%、0.33%、0.49%、0.64%、1.09%、1.59%、2.33%，表明儀器精密度良好。

取同一批3種紅豆杉樹皮適量，每批平行制備6份供試溶液，在所設定的色譜條件下進行重復性試驗。結果表明，色譜峰面積RSD分別為2.14%、2.82%、3.14%、1.27%、2.38%、3.22%、3.79%，說明方法的重現(xiàn)性良好。

重復性試驗結果顯示，東北紅豆杉樣品中10-去乙?；涂ㄍ?、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙?；仙即?、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉寧堿、7-表-10-去乙?；仙即己妥仙即己科骄捣謩e為0.376、0.395 、0.266 、0.157 、0.092 、0.053 、0.234 mg/g，RSD值為1.74%、1.25%、1.20%、1.39%、1.09%、1.55%、1.58%，表明該方法重復性良好。

2.1.4 加樣回收率

對不同添加量下7種紫杉烷類化合物的加樣回收率進行分析，結果見表2。由表2可得巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰基紫杉醇的平均加樣回收率最高，分別為107.43%和104.88%，其中在樣品添加量為5 μg的時候效果最好，回收率分別為109.27%和108.31%。10-去乙?；涂ㄍ?、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙?；仙即肌?0-去乙?；仙即?、三尖杉寧堿、7-表-10-去乙?；仙即己妥仙即嫉钠骄厥章史謩e為94.62%、107.43%、96.28%、104.88%、96.23%、95.41%和95.96%，相對標準偏差(RSD)值分別為1.43%、2.09%、1.06%、2.23%、1.52%、1.43%和1.4%，均小于4%，表明1.3所確定的檢測方法回收率較好。

表2 7種紫杉烷類化合物加樣回收率試驗結果(n=5)

2.2 紅豆杉屬中7種紫杉烷類化合物含量分析與對比

影響紅豆杉植株中紫杉烷類物質積累的因素十分復雜，不同品種、年限等因素均對其成分產生影響[6]。盆栽7年生3種紅豆杉屬植物(東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉)主干樹皮中7種紫杉烷類化合物含量測定結果見表3。

表3 不同品種紅豆杉中各紫杉烷類成分含量 (n = 5) Tab.3 Taxanes contents in different Taxus species (n = 5) mg·g-1

東北紅豆杉、南方紅豆杉、曼地亞紅豆杉樹皮中紫杉醇含量分別為0.234、0.043、0.167 mg/g，三尖杉寧堿含量分別為0.092、0.034、0.053 mg/g，10-去乙?；涂ㄍず糠謩e為0.376、0.158、0.063 mg/g，10-去乙?；仙即己糠謩e為0.157、0.113、0.126 mg/g，巴卡亭Ⅲ含量分別為0.395、0.116、0.074 mg/g，7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量分別為0.053、0.027、0.033 mg/g，7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇含量分別為0.266、0.564、0.315 mg/g。

因植物活性成分含量往往受地域、土壤、氣候、樹齡和品種等多種因素影響，為準確比較不同紅豆杉品種中紫杉烷類成分含量差異，本研究采用溫室控制條件下培育的不同品種紅豆杉為實驗材料，重點考慮品種因素對植物活性成分含量的影響，避免了其他因素對實驗結果的干擾。本研究所建立的檢測方法，不僅適用于溫室盆栽或林地紅豆杉樣品分析，也適用于其他生物樣品(動物/人體血液、組織等)中紫杉烷類化合物的含量檢測，是一種廣譜性的高通量紫杉烷類化合物分析檢測方法。

不同種紅豆杉紫杉烷類化合物含量差異較大，紫杉醇和三尖杉寧堿含量以東北紅豆杉最高，其次是曼地亞紅豆杉，二者含量遠高于南方紅豆杉。10-去乙?；涂ㄍず桶涂ㄍあ蟮暮柯貋喖t豆杉最低，東北紅豆杉中最高，其中10-去乙酰基巴卡亭在曼地亞紅豆杉中的含量不足其他2種紅豆杉的一半。10-去乙?；仙即己?-表-10-去乙酰基紫杉醇的含量在3種紅豆杉中差異較小。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇在南方紅豆杉中含量最高。7種紫杉烷類化合物總含量在東北紅豆杉中最高，南方紅豆杉其次，曼地亞紅豆杉中最低。

3 結 論

本研究開發(fā)了一種高效、可同時測定紅豆杉屬植物中7種紫杉烷類化合物的HPLC的檢測方法：色譜柱HiQsil C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-水，梯度洗脫(0～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈)；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃；紫外檢測波長為227 nm。

7種紫杉烷類化合物的總含量在東北紅豆杉中最高，南方紅豆杉次之，曼地亞紅豆杉中最低。通過對紅豆杉屬植物中主要紫杉烷類成分含量的對比分析，為紅豆杉屬植物的質量控制、種源選育、資源的保護與合理開發(fā)利用提供依據。