安靜芳， 李 航， 楊 帆， 謝文杰， 李鵬飛， 劉 姣， 崔 迪， 周 剛

(湖南大學(xué)體育學(xué)院, 長沙 410082)

運(yùn)動性蛋白尿是體育運(yùn)動中常見的生理現(xiàn)象，即當(dāng)運(yùn)動強(qiáng)度超過機(jī)體所能承受最大負(fù)荷量時，極易引發(fā)腎臟組織損傷，出現(xiàn)蛋白尿、血尿等現(xiàn)象，是運(yùn)動量過大、運(yùn)動性疲勞發(fā)生的重要指征。盡管一過性尿蛋白的出現(xiàn)也被認(rèn)為是運(yùn)動后生理性表現(xiàn)，但運(yùn)動性尿蛋白的出現(xiàn)是腎功能損傷的早期表現(xiàn)，預(yù)示著腎臟濾過系統(tǒng)發(fā)生改變。諸多研究認(rèn)為蛋白尿與腎小球功能和結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，而運(yùn)動性尿蛋白發(fā)生機(jī)制尚不清楚。足細(xì)胞足突構(gòu)成的裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)是濾過屏障的最后一道防線，其裂孔隔膜蛋白(如ZO-1、nephrin、podocin、CD2AP等)表達(dá)下降可直接導(dǎo)致蛋尿白的發(fā)生[1, 2]。由于腎臟富含長鏈多不飽和脂肪酸，極易受到活性氧(reactive oxygen species，ROS)帶來的損害，進(jìn)而造成組織損傷[3]。我們前期的實驗已經(jīng)證明，一次性力竭運(yùn)動后大鼠腎臟ROS、iNOS增加，導(dǎo)致ONOO-生成增多，進(jìn)而SD蛋白nephrin表達(dá)下降，腎小球形態(tài)發(fā)生改變，毛細(xì)血管基底膜增厚變形，證明力竭運(yùn)動通過氧化應(yīng)激機(jī)制，導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷[4, 5]。腎臟組織中的ROS生成主要來源于NADPH氧化酶(Nox)，Nox的兩種亞型Nox2和Nox4在病理和生理狀態(tài)下ROS的生成中發(fā)揮重要作用[5-7]。然而，目前關(guān)于Nox上游機(jī)制仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，PKC(蛋白激酶C)抑制劑或PKCδ抑制劑可使大鼠腎臟Nox的活性降低約80%[8]。PKC和Nox2抑制劑可以阻止電刺激誘導(dǎo)的骨骼肌中ROS的產(chǎn)生[5, 9]。PKC可能是調(diào)控nephrin表達(dá)關(guān)鍵的胞內(nèi)信號，參與高糖誘導(dǎo)的nephrin丟失[10]。本研究采用大鼠跑臺力竭運(yùn)動模型，聯(lián)合使用PKC抑制劑，研究PKC在過度運(yùn)動對腎臟裂孔膜蛋白nephrin、podocin表達(dá)的影響中的調(diào)控作用，從PKC-Nox-ROS-SD途徑闡明運(yùn)動性尿蛋白的形成機(jī)制，對預(yù)防腎臟運(yùn)動性氧化損傷和緩解運(yùn)動性尿蛋白癥狀具有指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與運(yùn)動方案

8周齡雄性SD大鼠30只，體重240～260 g(購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK(湘)2019-0004)，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲水和飲食，自然光照，室溫25℃±1℃；適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成3組，分別為對照組(C組)，運(yùn)動組(E組)，運(yùn)動聯(lián)合PKC抑制劑組(EPI組)，每組10只。C組大鼠靜養(yǎng)，無運(yùn)動；E組和EPI組大鼠進(jìn)行3 d適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練(ZH-PT跑臺，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，速度5 m/min，訓(xùn)練時間5～10 min；休息1 d后進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動90～120 min。力竭運(yùn)動方案跑速從5 m/min開始，每5 min增加5 m/min，勻加速最終速度保持在25 m/min直至大鼠力竭；運(yùn)動過程中根據(jù)大鼠運(yùn)動情況適當(dāng)增加電刺激(1 mA以下)、光刺激和聲音刺激，強(qiáng)迫大鼠運(yùn)動。判斷大鼠力竭標(biāo)準(zhǔn)為外界刺激不能使其繼續(xù)運(yùn)動，且四肢癱軟無力，雙眼無神，翻轉(zhuǎn)后無翻正反射等。EPI組大鼠運(yùn)動前1 d及1 h分別進(jìn)行腹腔注射PKC抑制劑白屈菜紅堿(chelerythrine)(5 mg/kg)，C組和E組注射相應(yīng)體積生理鹽水。

1.2 樣品采集與處理

1.2.1 血液樣本 大鼠力竭運(yùn)動結(jié)束即刻腹腔注射10%水合氯醛水溶液(0.4 ml/100 g體重)，待其昏迷、心跳變緩、掐后爪無反射反應(yīng)后心臟取血：固定四肢，酒精擦拭腹部皮毛，沿胸腔解剖，暴露心臟，用5 ml無菌注射器自左心室取血，用于檢測血糖、血尿素、血尿酸水平。

1.2.2 尿液樣本 力竭運(yùn)動結(jié)束后用5 ml無菌注射器于膀胱取尿液，用于檢測尿蛋白、尿糖、尿酸水平。

1.2.3 腎組織樣本 心臟取血后解剖腹腔，取左、右腎臟，在培養(yǎng)皿內(nèi)去除多余組織，生理鹽水洗凈血跡，濾紙吸干水分后將腎組織放入樣品管，立即投入液氮冷凍，樣品采集結(jié)束后再轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存、待測。

1.3 血液和尿液生化指標(biāo)測定

尿蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法(CBB法)測定；尿糖、血糖采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定；尿酸、血清尿酸采用磷鎢酸法測定；血尿素氮采用脲酶法測定(所用試劑及試劑盒均購自于南京建成生物科技公司)。

1.4 腎臟ROS生成檢測

采用熒光探針法(DCFH-DA)檢測腎臟組織ROS生成情況。具體操作流程如下：1)稱取腎臟組織約0.5 g置于冰上剪碎，按10%(1 mg∶10 μl)的比例加入生理鹽水，在勻漿管內(nèi)以3 000 r/min進(jìn)行冰上勻漿，后在4℃離心機(jī)內(nèi)離心10 min，3 000 r/min，取上清液用于ROS測定。2)在96孔板的每孔中加入100 μg腎臟組織勻漿液，并加入100 μmol/L NADPH和10 μmol/L DCFH-DA，然后在其中一半孔中加入SOD(500 U/ml)，對應(yīng)的另一半孔中加同等量勻漿介質(zhì)，恒溫箱37℃孵育30 min，多功能酶標(biāo)儀(QM40-NIR，奧地利)設(shè)定激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm，讀取并記錄OD值。3)用測試孔OD值減去SOD孔的OD值來計算，ROS水平；BCA法測定勻漿液蛋白濃度作為定量參考(DCFH-DA購于美國Sigma-aldrich生物公司，NADPH、SOD、BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.5 腎臟PKC、Nox2、Nox4、nephrin、podocin蛋白表達(dá)檢測

采用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測蛋白表達(dá)情況。稱取腎組織約0.5 g置于冰上剪碎，按10%(1 mg∶10 μl)的比例加入PBS勻漿液(pH為7.4，5 mmol/L磷酸、250 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF和1 mmol/L DTT)。勻漿后，勻漿管以12 000 r/min，離心25 min，取上清液，使用BCA法測定蛋白濃度。Western blot測定腎臟相關(guān)蛋白表達(dá)，以GAPDH作為蛋白內(nèi)參，具體步驟如下：1)配制10%～15% SDS-PAGE膠；2)加入蛋白樣品及蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量marker，電壓120 V電泳約1.5 h；3)固定電流300 mA在4℃緩沖液中轉(zhuǎn)膜至PVDF膜約1 h；4)使用TBST配制5%脫脂牛奶封閉30 min；5)4℃過夜孵育一抗；6)用1%TBS-T溶液洗膜；7)室溫下孵育二抗1 h；8)洗膜后ECL顯色；9)掃描成像；10)運(yùn)用ImageJ進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。一抗GAPDH購于杭州賢至，其余抗體均購于美國Santa Cruz生物公司：nephrin(F1019)、podocin(G2619)、Nox2(gp91-phox，K3018)、Nox4(L1019)、PKC(H2510)。HRP-羊抗小鼠二抗(BST13I07A50)，HRP-羊抗兔二抗(BST13I07A54)購于博士德生物公司。

利用ImageJ6.0計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值，用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值之比表示相對蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一次性力竭運(yùn)動及PKC抑制劑對大鼠血尿素氮、血糖、血尿酸水平的影響

如表1所示：與C組相比， E組大鼠血尿素氮、血尿酸含量明顯增高(P<0.01，P<0.05)，血糖水平顯著降低(P<0.01)；與E組相比，EPI組大鼠血尿素氮明顯降低(P<0.05)，血糖含量顯著增多(P< 0.01)。

Tab. 1 Blood urea nitrogen, blood glucose and blood uric acid levels (mmol/L, n=10)

2.2 一次性力竭運(yùn)動及PKC抑制劑對大鼠尿蛋白、尿糖、尿酸水平的影響

如表2所示：與C組比，E組大鼠尿蛋白、尿糖、尿酸含量都明顯增加(P<0.01)；與E組相比，EPI組大鼠尿蛋白和尿糖水平明顯降低(P<0.05)。

Tab. 2 Urine protein, urine sugar and uric acid levels n=10)

2.3 一次性力竭運(yùn)動及PKC抑制劑對大鼠腎臟ROS水平的影響

如表3所示：與C組相比，E組大鼠腎臟ROS生成顯著增多(P<0.01)；與E組相比，EPI組大鼠腎臟ROS生成明顯減少(P<0.01)。

2.4 一次性力竭運(yùn)動及PKC抑制劑對大鼠腎臟PKC、Nox2、Nox4蛋白表達(dá)的影響

如表3、圖1所示：與C組相比，E組大鼠腎臟PKC、Nox2、Nox4蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與E組相比，EPI組PKC、Nox2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

Fig. 1 Effects of one single bout of exhaustive exercise and PKC inhibitor on the protein expressions of PKC, Nox2 and Nox4 in kidney

2.5 一次性力竭運(yùn)動及PKC抑制劑對大鼠腎臟nephrin、podocin蛋白表達(dá)的影響

如表3、圖2所示：與C組相比，E組大鼠腎臟nephrin、podocin表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與E組相比，EPI組nephrin、podocin蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05，P<0.01)。

Tab. 3 The levels of ROS, PKC, Nox2, Nox4, podocin, Nephrin protein in n=10)

Fig. 2 Effects of one single bout of exhaustive exercise and PKC inhibitor on the protein expressions of podocin and nephrin in kidney

3 討論

本研究通過建立一次性力竭運(yùn)動大鼠模型，研究運(yùn)動氧化應(yīng)激條件下腎臟組織裂孔膜蛋白表達(dá)情況，主要發(fā)現(xiàn)：1)一次性力竭運(yùn)動誘導(dǎo)大鼠運(yùn)動性蛋白尿，該過程中腎臟裂孔膜蛋白nephrin、podocin蛋白表達(dá)水平降低；2)一次性力竭運(yùn)動導(dǎo)致大鼠腎臟Nox源ROS生成增加、PKC蛋白表達(dá)增加，抑制PKC可通過Nox/ROS途徑緩解運(yùn)動性蛋白尿。

由運(yùn)動引起的蛋白尿是體育訓(xùn)練中常見的生理現(xiàn)象，其臨床表現(xiàn)與病理性蛋白尿具有相似的表現(xiàn)，運(yùn)動后腎臟缺血/再灌注產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，腎小球濾過系統(tǒng)遭到破壞，由此出現(xiàn)“類病理性”現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在尿蛋白、尿酸、尿素氮等生化指標(biāo)發(fā)生改變[11]，其生理性主要表現(xiàn)為“一過性”。在運(yùn)動實踐中，運(yùn)動性尿蛋白的產(chǎn)生是運(yùn)動者身體疲勞的重要指標(biāo)，如果癥狀嚴(yán)重，則可能是過度運(yùn)動導(dǎo)致的腎臟損傷的后果。而延緩或者減輕此現(xiàn)象在一定程度上可幫助運(yùn)動員提高運(yùn)動表現(xiàn)，延緩腎臟機(jī)能失調(diào)，避免運(yùn)動員在疲勞狀態(tài)下出現(xiàn)運(yùn)動損傷。運(yùn)動性尿蛋白在臨床上的表現(xiàn)與腎臟疾病早期癥狀相似，因此對于運(yùn)動性尿蛋白形成機(jī)制的研究可能為病理性尿蛋白的研究提供思路。

有研究指出，尿酸可以作為抗氧化劑，被ROS氧化成尿囊素。因此運(yùn)動產(chǎn)生過量ROS的同時，也有大量尿酸可用于抗氧化[12]。本研究中大鼠在力竭運(yùn)動后，尿酸水平明顯增高。PKC抑制劑組大鼠運(yùn)動后尿液尿酸水平無明顯降低，推測可能是由于PKC抑制劑抑制ROS過量產(chǎn)生，而尿酸在抗氧化中沒有過多的可用性，因此在尿液檢測中出現(xiàn)大量尿酸。尿素氮是反映運(yùn)動負(fù)荷和身體機(jī)能狀況的有效指標(biāo)。運(yùn)動負(fù)荷過大可導(dǎo)致機(jī)體尿素排泄率降低，體內(nèi)潴留的非蛋白氮增多，血尿素氮含量增加[13]。尿蛋白與尿糖排泄量反映腎臟濾過系統(tǒng)的改變程度，在足細(xì)胞損傷，裂孔膜結(jié)構(gòu)異常時增高，出現(xiàn)尿蛋白與尿糖現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，nephrin表達(dá)降低導(dǎo)致小鼠足細(xì)胞中NF-κB表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而發(fā)生腎小球硬化和蛋白尿[14]。大強(qiáng)度運(yùn)動后發(fā)生蛋白尿提示可能是裂孔膜蛋白表達(dá)下降所致。本研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動導(dǎo)致裂孔膜蛋白nephrin和podocin表達(dá)同時降低，且腎臟ROS生成水平明顯提高，提示運(yùn)動刺激腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腎臟功能發(fā)生改變。Nephrin、podocin在SD中高度表達(dá)，這些跨膜蛋白的表達(dá)降低可能會直接導(dǎo)致白蛋白透過腎小球進(jìn)入尿液[15]。在大負(fù)荷導(dǎo)致大鼠運(yùn)動性蛋白尿的研究中指出運(yùn)動性蛋白尿發(fā)生的同時裂孔膜蛋白表達(dá)持續(xù)降低[16]。本實驗室前期的腎臟實驗中報道了關(guān)于力竭運(yùn)動對大鼠腎臟的影響，結(jié)果均呈現(xiàn)一致性[4, 5]。也有研究指出，血漿晚期蛋白氧化產(chǎn)物(AOPPs)的積累通過激活ROS依賴的p38 MAPK降低足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin和podocin的表達(dá)，導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生[17]。

ROS生產(chǎn)與抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡會誘發(fā)氧化應(yīng)激，Nox是已知主要產(chǎn)生ROS的功能酶[18]。有研究表明，腎皮質(zhì)中ROS生成的主要來源是Nox[19]。Hiroshi Kono等人指出在敲除Nox的小鼠中，ROS的生成不再增多[20]。本研究結(jié)果顯示，PKC抑制劑的干預(yù)降低腎臟Nox2表達(dá)，而Nox4表達(dá)無明顯下降，說明PKC并不直接介導(dǎo)運(yùn)動導(dǎo)致的骨骼肌Nox4的蛋白表達(dá)。小鼠實驗中，夾竹桃素對Nox的慢性干預(yù)通過降低ROS生成下調(diào)nephrin和podocin蛋白表達(dá)，減少尿蛋白含量[17]。Günnur Kocer 等人的研究表明力竭運(yùn)動引起的Nox活性增加是運(yùn)動過程中氧化應(yīng)激水平升高的重要來源，是導(dǎo)致運(yùn)動后蛋白尿發(fā)生的原因之一[21]。本實驗研究顯示，一次性力竭運(yùn)動刺激Nox源ROS水平增加，PKC抑制劑阻止了這一現(xiàn)象，說明PKC可能參與蛋白尿形成的上游調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究還發(fā)現(xiàn)一次性力竭運(yùn)動增強(qiáng)腎臟Nox2和Nox4 蛋白表達(dá)，PKC抑制劑可有效抑制Nox2的表達(dá)上調(diào)，提示高強(qiáng)度運(yùn)動刺激腎臟氧化應(yīng)激機(jī)制可能是通過PKC/Nox2途徑實現(xiàn)的。謝文杰等人指出高強(qiáng)度游泳訓(xùn)練可通過上調(diào)PKCδ蛋白表達(dá)及磷酸化水平導(dǎo)致心肌ROS過量生成[22]。劉姣等人通過建立一次性力竭運(yùn)動模型，發(fā)現(xiàn)PKC可通過Nox2調(diào)控大鼠骨骼肌中ROS產(chǎn)生[23]。有研究指出高糖水平和游離脂肪酸刺激二酰基甘油(DAG)-PKC通路，進(jìn)而通過PKC依賴的Nox激活刺激ROS的生成[24]。J.Menne等人在糖尿病腎病的實驗中指出高糖條件下小鼠腎小球裂孔膜蛋白nephrin表達(dá)明顯減低，而podocin和CD2AP的表達(dá)保持不變，在阻斷PKC-α的小鼠中nephrin表達(dá)保持不變，證明抑制小鼠體內(nèi)PKC-α的信號通路可以減少腎臟中nephrin的丟失，同時對蛋白尿的發(fā)生有抑制作用，本研究得出一致結(jié)果[25]。

綜上所述，一次性力竭運(yùn)動應(yīng)激激活Nox/ROS信號途徑，造成腎臟裂孔膜蛋白nephrin和poodocin表達(dá)下降引發(fā)運(yùn)動性蛋白尿；PKC作為Nox上游調(diào)控因子，抑制其表達(dá)可作用于Nox/ROS途徑緩解運(yùn)動性蛋白尿發(fā)生。氧化應(yīng)激機(jī)制在運(yùn)動性腎臟損傷研究中已有大量文獻(xiàn)支持，本研究在此基礎(chǔ)上，重點關(guān)注氧化應(yīng)激的上游分子PKC，研究PKC抑制劑對于nephrin和poodocin蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討腎臟氧化應(yīng)激信號通路提供新的思路。鑒于PKC有幾種分型，未來有必要深入研究不同PKC分型對Nox的作用以及PKC調(diào)節(jié)Nox不同分型的具體機(jī)制，同時PKC的上游激活機(jī)制也是未來研究關(guān)注的焦點之一。