黃海寧， 汪 匯， 龍超良， 張 浩,△， 汪 海,3,△

(1. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 山東 濟(jì)寧 272029； 2. 北京賽德維康醫(yī)藥研究院， 北京 100039； 3. 江蘇師范大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院， 徐州 221116； 4. 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院， 北京 100853)

沙利度胺(thalidomide，Thal)又稱反應(yīng)停，化學(xué)名為α-酞胺哌啶酮，在1950年被德國(guó)藥物公司首先合成并作為一種鎮(zhèn)靜劑上市，后來(lái)由于沙利度胺能緩解妊娠期婦女的嘔吐癥狀而被用于孕婦早期嘔吐，但是很快發(fā)現(xiàn)沙利度胺有嚴(yán)重的致畸作用，造成大面積的畸形兒童的產(chǎn)生。因此，該藥物在1961年撤出市場(chǎng)[1]。然而，沙利度胺致畸作用的機(jī)制引起了科學(xué)家們的極大興趣，并進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了其重要的生物學(xué)作用，如抗血管生成[2-4]、抗炎[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]和氧化應(yīng)激[7, 8]， 2006年美國(guó)FDA批準(zhǔn)其用于多發(fā)性骨髓瘤的治療，在近幾年其在實(shí)體瘤的臨床治療中也取得了很好的成效[9, 10]。但沙利度胺的抗腫瘤作用機(jī)制尚不明確，有研究指出沙利度胺可能因抑制腫瘤血管新生從而抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)。

2010年，Takumi等人發(fā)現(xiàn)CRBN是沙利度胺結(jié)合蛋白，沙利度胺通過(guò)與CRBN結(jié)合并抑制相關(guān)的泛素連接酶活性來(lái)啟動(dòng)致畸作用，由此得出CRBN是沙利度胺致畸作用的主要靶點(diǎn)[11]。然而，CRBN是否參與調(diào)控沙利度胺抑制腫瘤血管生成罕見(jiàn)報(bào)道。腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF和bFGF被認(rèn)為是最重要的血管生成因子，可以啟動(dòng)腫瘤血管生成從而促進(jìn)實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[12-14]。本研究利用載體構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建CRBN-shRNA干擾質(zhì)粒敲低A549和HepG2細(xì)胞中CRBN，探討CRBN對(duì)沙利度胺抑制A549細(xì)胞及HepG2細(xì)胞分泌的VEGF和bFGF的影響，并進(jìn)一步研究其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肺腺癌A549細(xì)胞及人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)于美國(guó) ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)于美國(guó)HyClone Laboratory公司；沙利度胺由北京賽德維康醫(yī)藥研究院合成并提供，用二甲基亞砜 (DMSO)配制成100 mmol/L的母液并儲(chǔ)存在-20℃冰箱中以備用，為了保證含DMSO≤1‰，在使用前需用DMEM培養(yǎng)基稀釋1 000倍；TRIzol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green Real-time PCR Master Mix Plus和qPCR RT Master Mix購(gòu)于日本 TOYOBO 公司；限制性內(nèi)切酶和DNA聚合酶購(gòu)于日本TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染所用的試劑購(gòu)于北京威格拉斯公司；RNA干擾引物由Damacon公司設(shè)計(jì)；bFGF和VEGF ELISA試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)公司。

1.2 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

將A549細(xì)胞及HepG2細(xì)胞用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基制成5×104cells/ml的細(xì)胞混懸液，每孔加入100 μl細(xì)胞混懸液于96孔板中，隨機(jī)分為含1‰DMSO的l00 μl培養(yǎng)基的空白對(duì)照組，1 、10、50、100、500 μmol/L的沙利度胺組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將加入藥物的96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl MTS，放在酶標(biāo)儀上，調(diào)整到490 nm測(cè)吸光度 (A)值，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[15]，用抑制率(inhibition ratio，IR)間接表示藥物對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響，其計(jì)算公式如下：

IR(%)=(A空白-A藥物)/A空白×100%

1.3 構(gòu)建shRNA穩(wěn)定敲低CRBN的腫瘤細(xì)胞株

1.3.1 CRBN短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)慢病毒載體的構(gòu)建 登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取人CRBN基因序列，利用Damacon公司的shRNA靶序列分析軟件針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)RNA干擾引物，針對(duì)的靶序列：5’- CGCTGGCTGTATTCCTTATAT-3’；熒光素酶(luciferase) shRNA(對(duì)照組)的靶序列為：5’- CTTCGAAATGTCCGTTCGGTT-3’。將合成好的正義鏈與反義鏈RNA干擾引物置于1/10 TE(Tris鹽酸和EDTA的混合液)分開(kāi)溶解，按照等比例混勻后以90℃加熱3 min，待降溫至37℃后便得到雙鏈的寡核苷酸；shRNA慢病毒表達(dá)載體(pLKO)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Age I進(jìn)行雙酶切后，跑膠并回收目的片段，回收產(chǎn)物與前面退火得到的引物進(jìn)行連接，通過(guò)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，送至北京華大生物技術(shù)公司測(cè)定基因序列。

1.3.2 CRBN shRNA慢病毒表達(dá)載體的包裝 將HEK293T細(xì)胞接種于6孔板中(轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為80%)，第2日包裝前1 h更換新鮮的完全培養(yǎng)基，然后用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將已克隆好的CRBN shRNA序列的慢病毒表達(dá)載體和相應(yīng)的病毒包裝質(zhì)粒(慢病毒shRNA表達(dá)載體1.25 μg，PLP1 1 μg，PLP2 0.5 μg和VSVG 0.7 μg)共同轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染36 h后收集包含病毒的上清，4℃ 3 000 r/min的離心10 min，離心好的病毒上清于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 獲取穩(wěn)定表達(dá)CRBN shRNA 腫瘤細(xì)胞株 A549及HepG2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，取2×105cells/well于6孔板中，加入100 μl病毒上清和終濃度8 μg/ml的聚凝胺(Polybrene)，實(shí)驗(yàn)分為CRBN shRNA組(相應(yīng)病毒上清+Polybrene)、luciferase shRNA組(相應(yīng)病毒上清+Polybrene)，6 h后換液，24 h后加入2 μg/ml的嘌呤霉素(puromycin)，3 d后觀察空白對(duì)照細(xì)胞狀態(tài)(理論上應(yīng)該全部死亡)，此時(shí)將CRBN shRNA和luciferase shRNA組中存活的細(xì)胞傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定整合可表達(dá)CRBN shRNA及l(fā)uciferase shRNA慢病毒載體的混合細(xì)胞克隆，隨后分別提取2種細(xì)胞RNA及總蛋白進(jìn)行進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效果。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將 A549細(xì)胞及HepG2細(xì)胞按照 3×105cells/well接種到6孔板中，隨機(jī)分為以下幾組，將A549細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(A549luciferase)、CRBN低表達(dá)組(A549CRBN)；HepG2細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(HepG2luciferase)、CRBN低表達(dá)組(HepG2CRBN)，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，分別加入1 ml含100 μmol/L沙利度胺(thalidomide組)和1 ml 1‰ DMSO(control組)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

取A549luciferase細(xì)胞、A549CRBN細(xì)胞、HepG2luciferase細(xì)胞及HepG2CRBN細(xì)胞，分別加200 μl RIPA裂解液，冰上裂解30 min，收集上清液。使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣品取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。利用半干轉(zhuǎn)膜法將細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，將膜置于5 %脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋過(guò)的一抗4℃過(guò)夜，TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。TBST洗膜后再加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影并拍照。采用Image J軟件分析蛋白相對(duì)灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)相對(duì)量，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time PCR)檢測(cè)基因表達(dá)

采用 TRIzol試劑盒提取各組的總RNA，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，每個(gè)樣品重復(fù)三次，引物見(jiàn)下表1。依照2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)水平，△△Ct=(Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因)樣品組-(Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。

Tab. 1 Sequences of primers for real-time PCR

1.7 ELISA檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集按照上述分組進(jìn)行干預(yù)的各組細(xì)胞上清液，各取100 μl加入抗體包被的96孔板中，37℃反應(yīng)90 min，甩去液體，將提前稀釋好的抗體100 μl/well加入96孔板中，37℃ 60 min。用PBS洗滌1 min/3次，將在37℃預(yù)熱的ABC工作液100 μl/well加入，37℃30 min。再用PBS洗滌1 min/5次，加入90 μl/well的顯色液，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應(yīng)20～25 min，再加入100 μl/well終止液，在酶標(biāo)儀450 nm中測(cè)定吸光度(OD)值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTS法檢測(cè)沙利度胺對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響

1、10、50、100和500 μmol/L沙利度胺對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組比較， 500 μmol/L沙利度胺能顯著抑制 A549及HepG2 細(xì)胞的增殖活力(P<0.05)，而其它濃度對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著抑制作用，該結(jié)果與報(bào)道一致。

Tab. 2 The inhibition rate of thalidomide on A549 and HepG2 cells at different n=3)

2.2 獲得穩(wěn)定敲低CRBN 的A549及HepG2細(xì)胞

運(yùn)用慢病毒介導(dǎo)的 shRNA方法(pLKO shRNA 質(zhì)粒)，構(gòu)建敲低CRBN的A549CRBN及HepG2CRBN細(xì)胞。Real-time PCR及Western blot法檢測(cè)其敲低效果，與A549luciferase及HepG2luciferase細(xì)胞比較，A549CRBN及HepG2CRBN細(xì)胞的CRBN 基因水平顯著降低(P<0.01，表3)，蛋白表達(dá)水平也顯著降低(P<0.01，圖1)。

Tab. 3 The expression levels of CRBN mRNA determined by real-time n=3)

Fig. 1 Proteinexpressions of CRBN detected by Western blot n=3)

2.3 敲低CRBN對(duì)A549及HepG2細(xì)胞VEGF和bFGF表達(dá)的影響

與A549luciferase及HepG2luciferase比較， A549CRBN及HepG2CRBN組VEGF和bFGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低 (P<0.05，表4，5)，表明CRBN與VEGF或bFGF表達(dá)同步下調(diào)。

Tab. 4 Effects of CRBN on the expressions of VEGF and bFGF at the mRNA level n=3)

Tab. 5 Effects of CRBN on the expressions of VEGF and bFGF at the protein level (pg/ml， n=3)

2.4 CRBN調(diào)控沙利度胺抑制細(xì)胞VEGF和bFGF的表達(dá)

沙利度胺抑制A549和HepG2細(xì)胞VEGF、bFGF的表達(dá)，當(dāng)敲低CRBN后，抑制作用消失 (P< 0.05，表6，7)，說(shuō)明沙利度胺對(duì)A549或HepG2細(xì)胞中VEGF和bFGF表達(dá)的影響是由CRBN調(diào)控的。

Tab. 6 Effects of thalidomide on the expressions of VEGF at the mRNA level regulated by n=3)

Tab. 7 Effects of thalidomide on the expressions of VEGF at the protein level regulated by CRBN(pg/ml, n=3)

2.5 敲低CRBN對(duì)VEGF和bFGF轉(zhuǎn)錄因子(c-Jun)基因表達(dá)的影響

c-Jun是VEGF和bFGF共同的轉(zhuǎn)錄因子。為了確定CRBN對(duì)c-Jun表達(dá)的影響，我們檢測(cè)了c-Jun的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，在A549細(xì)胞及HepG2細(xì)胞中，敲低CRBN c-Jun mRNA的表達(dá)水平降低 (P<0.05，表8)，表明CRBN和c-Jun的表達(dá)同步下調(diào)。

Tab. 8 The expressions of c-jun mRNA detected by real-time n=3)

2.6 CRBN調(diào)控沙利度胺抑制c-Jun的表達(dá)

沙利度胺處理A549細(xì)胞及HepG2細(xì)胞48 h后，在mRNA水平上檢測(cè)c-jun的表達(dá)。沙利度胺抑制VEGF和bFGF轉(zhuǎn)錄因子c-jun的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，敲低CRBN，在HepG2細(xì)胞中沙利度胺對(duì)c-jun的抑制作用消失 (P<0.05，表9)，而在A549細(xì)胞中抑制作用反而增強(qiáng)，提示c-Jun可能是HepG2細(xì)胞中介導(dǎo)沙利度胺抑制VEGF和bFGF的轉(zhuǎn)錄因子之一。

Tab. 9 Effects of thalidomide on the expressions of c-jun at the mRNA level regulated by n=3)

3 討論

腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF和bFGF是最重要的血管生成因子，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙利度胺可下調(diào)骨髓瘤細(xì)胞、食管癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中VEGF和bFGF的表達(dá)[16-18]。這些結(jié)果表明，沙利度胺的抗腫瘤活性可能部分通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞中VEGF和bFGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，但沙利度胺調(diào)控VEGF和bFGF的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究采用RNA干擾技術(shù)敲低A549及HepG2細(xì)胞中CRBN的表達(dá)，探討沙利度胺對(duì)敲低CRBN的 A549細(xì)胞及HepG2細(xì)胞分泌VEGF/bFGF的影響。本研究顯示100 μmol/l沙利度胺對(duì)A549細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯的抑制作用，也就是說(shuō)沙利度胺在該濃度下不影響細(xì)胞的增殖能力，排除沙利度胺通過(guò)抑制細(xì)胞增殖來(lái)降低VEGF/bFGF的表達(dá)。接下來(lái)我們的研究發(fā)現(xiàn)，在A549和HepG2細(xì)胞中，VEGF和bFGF的分泌與CRBN的表達(dá)顯著相關(guān)，而CRBN的下調(diào)可以顯著降低VEGF和bFGF的表達(dá)。沙利度胺可抑制A549和HepG2細(xì)胞中VEGF和bFGF的表達(dá)[10]，這與我們的結(jié)果是一致的，而敲低CRBN后對(duì)A549和HepG2細(xì)胞中VEGF和bFGF的表達(dá)的抑制作用消失，表明CRBN在沙利度胺抑制A549和HepG2細(xì)胞分泌VEGF/bFGF中發(fā)揮重要作用。沙利度胺對(duì)血管生成因子的影響是抗血管生成的觸發(fā)因子，可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。前期研究表明沙利度胺可能通過(guò)CRBN抑制A549細(xì)胞的遷移[19]。

c-Jun是VEGF和bFGF的共同的轉(zhuǎn)錄因子[20]。沙利度胺同時(shí)抑制VEGF和bFGF的分泌，它們是否受到其共同的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控？因此，我們下一步研究的重點(diǎn)是探討沙利度胺對(duì)c-Jun的影響。結(jié)果表明在HepG2和A549細(xì)胞中，沙利度胺都能抑制c-jun的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，并且敲低CRBN后c-jun表達(dá)都降低，但是只有在HepG2細(xì)胞中，敲低CRBN，沙利度胺對(duì)c-jun的抑制作用消失，因此HepG2細(xì)胞中，c-Jun可能是CRBN介導(dǎo)沙利度胺抑制VEGF和bFGF的轉(zhuǎn)錄因子之一。

綜上所述，沙利度胺抑制A549和HepG2細(xì)胞中VEGF和bFGF的分泌與CRBN有關(guān)，在HepG2細(xì)胞中，c-jun可能是CRBN介導(dǎo)沙利度胺抑制VEGF和bFGF表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。這一發(fā)現(xiàn)提示CRBN可能是沙利度胺抑制VEGF/bFGF分泌的潛在靶點(diǎn)，但CRBN如何介導(dǎo)沙利度胺抑制VEGF/bFGF分泌的機(jī)制及其下游信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究，研究結(jié)果為沙利度胺抑制腫瘤血管生成因子提供新的思路。