周 藏，孫曉霞，王金鳳，付 琦，王愷睿，劉立兵,*，王建昌,*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050051；3.河北省環(huán)境與人群健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017）

快節(jié)奏的現(xiàn)代生活中，速凍食品因其種類繁多、滋味豐富、烹飪方式簡單、省時(shí)等優(yōu)勢，已成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡囊环N食品類型。但隨著人們對速凍食品的需求日益增多，速凍食品市場變得魚龍混雜，有關(guān)速凍食品肉類摻假或標(biāo)注肉的種類與實(shí)際不符的報(bào)道層出不窮，給市場監(jiān)管帶來了極大挑戰(zhàn)，如牛肉風(fēng)味的撒尿肉丸未添加牛肉，6 元/kg的豬肉水餃實(shí)際上內(nèi)餡為雞架泥等。目前，主要的肉類摻假方式為以價(jià)格低廉的雞肉、鴨肉和豬肉代替市場價(jià)格更高的牛羊肉，這種摻假售假的行為不僅侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益，還存在導(dǎo)致消費(fèi)者違背民族飲食習(xí)慣和發(fā)生過敏的可能，給消費(fèi)者的身心健康帶來了極大的安全隱患。因此，亟需一種快速、有效的檢測手段來鑒別速凍食品的動(dòng)物源性成分，促進(jìn)監(jiān)管部門對速凍食品生產(chǎn)原材料的品質(zhì)和食品標(biāo)簽的真實(shí)性進(jìn)行有力監(jiān)管，維護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益。

肉制品中動(dòng)物源性成分的檢測方法主要有基于特征結(jié)構(gòu)檢測的光譜和質(zhì)譜分析、基于蛋白質(zhì)檢測的免疫學(xué)方法和基于核酸檢測的分子生物學(xué)方法。與其他方法相比，分子生物學(xué)方法受加工處理方式的影響較小，且方法特異性、靈敏性高，操作簡單，因此成為肉制品中動(dòng)物源性成分檢測方法的研究熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外學(xué)者針對動(dòng)物源性成分核酸檢測建立了等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一種新興技術(shù)，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法和重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）法等，其中LAMP方法引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，假陽性率較高；RPA方法引物、探針設(shè)計(jì)較為困難，成本高，不適合大量樣品多種源性成分的同時(shí)檢測。熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reation，PCR）方法、實(shí)時(shí)熒光PCR方法、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）法和微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）法等，RFLP方法重復(fù)性較差，不適用于復(fù)雜成分的肉制品分析；ddPCR是一種絕對定量檢測技術(shù)，但該方法所用試劑昂貴、檢測成本較高，對操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，不適用于大范圍推廣；而基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立的動(dòng)物源性成分檢測方法克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)易造成交叉污染的缺點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于肉制品中動(dòng)物源性成分的摻假鑒別。但我國應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立的多種動(dòng)物源性成分檢測的國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，主要是針對單一物種成分的定性鑒定，不能同時(shí)檢測多種源性成分。在實(shí)際檢測工作中，往往需要在短時(shí)間內(nèi)對一種食品完成多種源性成分檢測，以鑒別是否摻假；然而，目前單一物種的定性檢測方法耗時(shí)較長，已經(jīng)不能滿足市場檢測需求。

目前，市面上速凍食品的種類主要包括速凍水餃、餛飩（云吞）、小籠包和餡餅等，成分表中肉類以雞肉、鴨肉、豬肉和牛肉為主。雞轉(zhuǎn)化生長因子β-3（transforming growth factor beta-3，）基因、豬朊蛋白（prion protein，）基因和鴨、牛生長激素（growth hormone，）基因是雞、鴨、豬和牛源性成分檢測中常用的單拷貝基因，不僅在源性成分定性檢測方面表現(xiàn)出良好的靈敏性，而且由于單拷貝基因在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)固定的優(yōu)勢，在后續(xù)源性成分定量檢測方面也具有極大應(yīng)用潛力。故本研究基于雞基因、豬基因和鴨、?；?，設(shè)計(jì)合成特異性引物和Man探針，建立同時(shí)檢測速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)4 種源性成分的快速檢測。進(jìn)一步運(yùn)用所建立的方法對市售不同種類的速凍食品進(jìn)行雞、鴨、豬和牛源性成分檢測，驗(yàn)證該方法的有效性和實(shí)用性。

隧道工程支護(hù)施工技術(shù)科學(xué)合理準(zhǔn)確的使用是保證隧道安全施工作業(yè)的基礎(chǔ)性條件。大家知道，隧道內(nèi)部的排水系統(tǒng)的施工難度是非常大的，而且施工的綜合性比較強(qiáng)，因此隧道結(jié)構(gòu)防水技術(shù)的合理準(zhǔn)確的應(yīng)用要根據(jù)施工現(xiàn)場的實(shí)際情況而定。通常隧道結(jié)構(gòu)防水的基本原則是“防水、排水、堵水相結(jié)合”，常用的施工方法就是在隧道洞的兩側(cè)挖掘排水渠、在隧道洞口上方建造截水溝，在隧道內(nèi)部水溝的出水位置安裝保溫包頭。同時(shí)還要密切關(guān)注隧道施工縫、變形縫處的排水系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和建造工作。

[26] David Lawder, “China will Get Better U. S. Trade Deal If It Solves North Korea Problem: Trump”, The Reuters, April 11, 2017, http://www.businessinsider.com/r-china-will-get-better-us-trade-deal-if-it-solves-north-korea-problem-trump-2017-4.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞、鴨、豬、牛、狐貍、水貂、鵝、驢、羊、馬幾種不同動(dòng)物肉粉由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；速凍水餃、餛飩（云吞）、小籠包和餡餅等34 份速凍食品，均購于石家莊市不同農(nóng)貿(mào)市場或超市。

將購買的34 份速凍水餃、餛飩（云吞）、小籠包和餡餅解凍至室溫，使用無菌剪刀將待測樣品的面皮和肉餡分離，挑取適量肉餡置于研缽中，加入液氮充分研磨成粉末。取50 mg樣品粉末于1.5 mL離心管中，每份樣品取2 管，分別按照1.3.2節(jié)提取基因組DNA。樣品處理和核酸提取過程中應(yīng)避免樣品之間或與其他動(dòng)物源性成分的交叉污染。采用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對所有樣品同時(shí)檢測雞、鴨、豬和牛源性成分。將檢出的動(dòng)物源性成分與樣品外包裝標(biāo)注的成分進(jìn)行比對，對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，進(jìn)一步驗(yàn)證所建立方法的準(zhǔn)確性和實(shí)際應(yīng)用效果。

主成分分析圖可以直觀地反映出各樣品的相對位置及與感官特征的相關(guān)關(guān)系，樣品之間、樣品與感官特征之間的相對位置越近，表明它們在風(fēng)味特征上，關(guān)系越密切[27]，16種怪味胡豆樣品與風(fēng)味特征在F1/F2坐標(biāo)中的分布，見圖1。

線下：分類教學(xué)+課堂精講+小班研討+應(yīng)用實(shí)驗(yàn)+結(jié)課考核。學(xué)生在教師引導(dǎo)下，開展研討式、探索式和協(xié)作式的學(xué)習(xí)活動(dòng)，開展“大班授課，小班討論”的教學(xué)方式，為學(xué)生課內(nèi)交流和展現(xiàn)成果提供機(jī)會(huì)。

1.2 儀器與設(shè)備

1-14臺式離心機(jī) 德國Sigma公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Scientific公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國ABI公司；SL 202電子天平 德國賽多利斯公司；BT-20T恒溫金屬浴 上海安亭儀器有限公司。

食品基因組DNA提取試劑盒 美國Promega公司；探針法熒光PCR預(yù)混液（2×） 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針

參考文獻(xiàn)[25-26]合成雞基因和鴨基因特異性引物和探針；參照GB/T 25165—2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》，合成豬基因及?；蛱禺愋砸锖吞结?；所有引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如表1所示。

表1 所需引物和探針序列信息Table 1 Information about the primers and probe used in this study

1.3.2 動(dòng)物肉粉基因組DNA的提取

將實(shí)驗(yàn)室保存的不同物種肉粉各取50 mg，分別置于1.5 mL離心管中，按照食品基因組DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA，最終以100 μL ddHO溶解基因組DNA。使用超微量分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量濃度，再分別稀釋至1.0×10pg/μL，置于-20 ℃貯存，備用。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立及優(yōu)化

月季(Rosa chinensis Jacq.)是薔薇科薔薇屬植物，原產(chǎn)于我國，在我國有 2000 多年的栽培歷史[1]。由于其極強(qiáng)的觀賞性和適應(yīng)性，廣泛應(yīng)用于園林綠化中，成為我國北方城市北京、天津等多個(gè)城市市花，建立了多處月季品種齊全、集中的專類公園。

瑪麗的困境可以理解為生活困境和心理困境?，旣惖恼煞虻峡私?jīng)營著一個(gè)農(nóng)場，由于迪克自身的經(jīng)營理念，農(nóng)場相當(dāng)?shù)牟痪皻猓钏绞艿酵{，瑪麗整日只能待在破舊的鐵皮屋里，異常窘迫。與此同時(shí)，瑪麗的心理也在遭受著折磨，在殖民主義的環(huán)境下秉承著白人和黑人有別的觀念，跟土人摩西產(chǎn)生了曖昧關(guān)系......筆者將從“自我”、“本我”和“超我”的角度分析造成瑪麗困境的原因。

以雞、鴨、豬、牛、狐貍、水貂、驢、羊、鵝、馬基因組DNA為模板，無菌水為空白對照，分別按照1.3.3節(jié)優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對雞、鴨、豬和牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性進(jìn)行分析。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏性實(shí)驗(yàn)

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性實(shí)驗(yàn)

1.3.6 市售速凍食品檢測

將1.0×10pg/μL的雞、鴨、豬、?；蚪MDNA按照10 倍梯度稀釋的方法依次稀釋至1.0×10pg/μL，取1 μL為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，通過熒光信號的有無和擴(kuò)增曲線的趨勢，對所建立方法的靈敏性進(jìn)行評價(jià)。

數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)是大數(shù)據(jù)背景下數(shù)據(jù)庫技術(shù)中的“基礎(chǔ)篇”，因此，高等院校應(yīng)當(dāng)增加對數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)講授經(jīng)典的關(guān)系數(shù)據(jù)模型及相應(yīng)的數(shù)據(jù)管理技術(shù)的課時(shí)，將其作為必修課程，每周必須要安排3個(gè)課時(shí)。經(jīng)典數(shù)據(jù)庫技術(shù)主要包括數(shù)據(jù)庫學(xué)科中重要和通用的基礎(chǔ)理論和思路。課程重點(diǎn)應(yīng)當(dāng)包括關(guān)系數(shù)據(jù)模型、數(shù)據(jù)庫邏輯設(shè)計(jì)、ER模型、查詢優(yōu)化、數(shù)據(jù)庫表設(shè)計(jì)和事務(wù)管理等。同時(shí)還要簡單地介紹關(guān)系代數(shù)、函數(shù)依賴、規(guī)范化的基本理念和思想及SQL語句、視圖、存儲(chǔ)過程、觸發(fā)器等基本思想。這些理論知識在學(xué)期末采取閉卷考試的方式對學(xué)生的掌握情況進(jìn)行考核。

不對！他突然覺得似乎哪里有些不對勁，于是再次望向了那尊白玉骸骨，這才發(fā)現(xiàn)，骸骨原先那種白玉般的光澤已然不見，干巴巴的，像從土里剛剛挖出來一樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀系統(tǒng)分析軟件（v1.5.1）對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，獲得樣品Ct值；再利用Excel軟件對平行實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立及優(yōu)化

以雞、鴨、豬和?；蚪MDNA為模板，根據(jù)Ct值、熒光強(qiáng)度和擴(kuò)增效率確定實(shí)時(shí)熒光PCR方法最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測雞、鴨、豬和牛源性成分的最佳反應(yīng)體系為：2×探針法熒光PCR預(yù)混液12.5 μL，上、下游引物終濃度均為400 nmol/L，探針終濃度400 nmol/L，模板DNA 1 μL，無菌水8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸35 s，40 個(gè)循環(huán)，在退火延伸時(shí)采集熒光信號。

分別以提取的雞、鴨、豬、?；蚪MDNA作為模板，采用矩陣實(shí)驗(yàn)分別對引物和探針的濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系為25 μL：2×探針法熒光PCR預(yù)混液12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）終濃度分別為160、240、320、400、600 nmol/L，探針（10 μmol/L）終濃度分別為240、320、400、600 nmol/L，模板DNA 1 μL，再用ddHO補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，退火溫度分別設(shè)置為55、58、60、63 ℃，退火延伸35 s，40 個(gè)循環(huán)，在退火延伸時(shí)采集熒光信號。在其他條件相同的情況下，以雞、鴨、豬和牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR方法中，循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值最低、熒光信號最強(qiáng)且擴(kuò)增效率最高的組合為最佳的引物、探針濃度和反應(yīng)條件。

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，空白對照組未出現(xiàn)擴(kuò)增，說明反應(yīng)體系未受污染，只有雞、鴨、豬和牛源性成分出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，其他物種均未擴(kuò)增，表明雞、鴨、豬和牛源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法具有良好的特異性。

圖1 雞、鴨、豬、牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Specificity of real-time PCR for chicken-, duck-, swine- and bovine-derived ingredients

2.3 靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將1.0×10～1.0×10pg/μL的雞、鴨、豬、?；蚪MDNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測。由圖2可知，當(dāng)雞、豬、?；蚪MDNA質(zhì)量濃度為10.0 pg/μL、鴨基因組DNA質(zhì)量濃度為1.0 pg/μL時(shí)，實(shí)時(shí)熒光PCR方法仍出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。表明本研究所建立的同時(shí)檢測雞、鴨、豬、牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏性分別為10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL。

圖2 雞、鴨、豬、牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR方法靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Sensitivity of real-time PCR for chicken-, duck-, swine- and bovine-derived ingredients

2.4 市售速凍食品的檢測結(jié)果

使用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，對34 份速凍食品同時(shí)進(jìn)行雞、鴨、豬、牛源性成分檢測，并將檢出的成分與食品外包裝上標(biāo)識的成分進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明，所建立的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對34 份樣品中4 種動(dòng)物源性成分的有效檢測，進(jìn)一步分析表明，有15 份速凍食品檢出的動(dòng)物源性成分與食品外包裝上標(biāo)注的成分不一致，其中12 份未標(biāo)注雞肉成分的速凍食品檢出雞源性成分，3 份未標(biāo)注鴨肉成分的速凍食品檢出鴨源性成分，1 份未標(biāo)注牛肉成分的速凍食品檢出牛源性成分（表2）。

表2 市售速凍食品動(dòng)物源性成分檢測結(jié)果Table 2 Results of real-time PCR for animal-derived ingredients in quick-frozen food

3 討 論

肉類摻假現(xiàn)象的存在不利于市場環(huán)境的公平、健康發(fā)展，涉及摻假售假的肉制品也將損害消費(fèi)者的合法權(quán)益。眾所周知，有宗教信仰人士和健身愛好者因自身需求會(huì)對牛肉、豬肉和雞肉等肉制品進(jìn)行嚴(yán)格的選擇；過敏體質(zhì)和疾病患者等特殊人群也需明確產(chǎn)品成分來規(guī)避誤食風(fēng)險(xiǎn)。因此，對肉制品進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定意義重大，已被列入我國食品安全風(fēng)險(xiǎn)的常規(guī)監(jiān)測計(jì)劃。

高溫、復(fù)雜的加工方式會(huì)造成源性成分DNA碎片化，從而降低檢出率，導(dǎo)致誤判，故現(xiàn)有大量肉源性成分檢測方法主要針對熱加工肉制品。然而，隨著人們生活節(jié)奏的改變，速凍食品在肉類市場中的占比逐漸增大；且已有研究表明，長時(shí)間的冷凍保存也會(huì)導(dǎo)致源性成分DNA降解，因此針對速凍食品檢測方法的研究至關(guān)重要。目前針對速凍食品中動(dòng)物源性成分檢測的報(bào)道較少，因此，本研究建立了一種可以同時(shí)對速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分進(jìn)行檢測的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。

在動(dòng)物源性成分的檢測方法中，基于DNA擴(kuò)增的分子生物學(xué)方法種類繁多且各有優(yōu)勢，然而實(shí)際檢測工作中更需要一種簡單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)的方法。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)成本低，能在DNA部分降解的情況下獲得足以進(jìn)行擴(kuò)增的片段基因，檢測快速，因此被廣泛應(yīng)用于肉制品中動(dòng)物源性成分的鑒定。本研究基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立的同時(shí)檢測雞、鴨、豬和牛源性成分的檢測方法，操作簡單、檢測時(shí)間較短，與常規(guī)的單一源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法相比，檢測時(shí)間從4 h減少到1 h，大大縮短了檢測周期；使用異源性DNA來驗(yàn)證各對引物和相應(yīng)探針的特異性，結(jié)果表明，本研究建立的雞、鴨、豬和牛源性成分檢測方法特異性強(qiáng)，能有效區(qū)分雞、鴨、豬、牛和其他動(dòng)物源性成分；對雞、鴨、豬和牛源性成分的檢測靈敏性可分別達(dá)到10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL，靈敏性良好。René等建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法可檢測到100.0 pg/μL的豬和牛源性DNA；Cheng Xin等建立的同時(shí)檢測雞、鴨、豬成分的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對每種目標(biāo)源性DNA的靈敏性為150.0 pg/μL，上述研究中檢測方法的靈敏性均低于本研究。

根據(jù)石家莊市內(nèi)不同農(nóng)貿(mào)市場和超市速凍食品的銷售情況，本研究選擇涵蓋市面上主要速凍食品品牌和種類的34 份樣品，包括速凍水餃、餛飩（云吞）、小籠包和餡餅等。應(yīng)用本研究建立的方法對市售34 份速凍食品進(jìn)行雞、鴨、豬和牛源性成分檢測，結(jié)果表明，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對不同種類速凍食品中4 種肉類成分的有效檢測，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中15 份速凍食品中檢出的動(dòng)物源性成分與食品外包裝上標(biāo)注的成分不一致，驗(yàn)證了該方法的實(shí)際應(yīng)用效果。但本研究在檢測過程中無法排除生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸和銷售等過程中樣品交叉污染或原料混入造成的“假陽性”結(jié)果，考慮到生產(chǎn)線同時(shí)生產(chǎn)含其他肉類的產(chǎn)品，無法準(zhǔn)確判斷此次檢測樣品的情況屬于“無意沾染”還是“惡意摻假”。因此，后續(xù)將進(jìn)行動(dòng)物源性成分的定量分析，以進(jìn)一步準(zhǔn)確判斷。

踐行“雙重領(lǐng)導(dǎo)”。湖南電信紀(jì)委緊緊圍繞“查辦案件以上級紀(jì)委領(lǐng)導(dǎo)為主”這個(gè)核心，牢牢把握“線索處置和案件查辦在向同級黨委報(bào)告的同時(shí)必須向上級紀(jì)檢組報(bào)告”這個(gè)重點(diǎn)，每個(gè)季度向上級紀(jì)檢組和同級黨委匯報(bào)工作。

4 結(jié) 論

本研究以雞基因、豬基因和鴨、?；?yàn)榘谢蚪⒘艘环N能夠同時(shí)檢測速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，特異性強(qiáng)、靈敏性高，能夠應(yīng)用于速凍食品中雞、鴨、豬和牛源性成分的檢測。該方法操作簡單、適用范圍廣，檢測周期短，可為食品監(jiān)管部門對速凍食品中肉類摻假檢測提供有力的技術(shù)支持。