鮰魚肌肉組織中不動桿菌的分離及鑒定

趙 奎，汪 蘭，孫衛(wèi)青，熊光權，喬 宇，吳文錦，李 新，丁安子

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術重點實驗室，湖北 武漢 430064；2.長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025）

斑點叉尾鮰（）俗名美國鮰魚、溝鲇，屬叉尾鮰科、叉尾鮰屬。1984年，斑點叉尾鮰從美國引進，由于其易飼養(yǎng)、肉質鮮美、蛋白質含量較高，具有很大的營養(yǎng)價值和商品價值，因而成為我國優(yōu)良的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，同時也在世界范圍內被廣泛接受，美國、日本等國家已對養(yǎng)殖斑點叉尾鮰進行了不同方面的研究。

近年來，很多文獻報道不動桿菌屬（）是肉類食品中的優(yōu)勢腐敗菌之一。史云嬌等研究發(fā)現(xiàn)，冷藏藏羊肉優(yōu)勢腐敗菌為不動桿菌屬、陰溝腸桿菌屬（）、溶酪大球菌屬（）、糞腸球菌屬（）和氣單胞菌屬（）等；于美娟等對風味小龍蝦的研究表明，冷藏鮮蝦中以嗜水氣單胞菌屬（）、巨形球菌屬（）、弧菌屬（）、不動桿菌屬、檸檬酸桿菌屬（）和腸桿菌屬（）為主；胡秀彩等從草魚體內分離得到致病性廈門不動桿菌；羅土炎等從澳洲墨瑞鱈魚體中分離得到寄魚不動桿菌。為豐富不同來源不動桿菌的分離鑒定和低溫條件下鮰魚腐敗菌的相關研究，本研究以斑點叉尾鮰為原料，在4 ℃冷庫中取其背部肌肉組織進行真空包裝，4 ℃冰箱中貯藏7 d，然后分離得到2 株細菌，分別編號為by 7-2、bs 7-3，進行細菌形態(tài)學觀察、革蘭氏染色及鏡檢、生化鑒定、16S rDNA測序及負染等方面研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑點叉尾鮰 湖北省武漢市某海鮮批發(fā)市場。

MAC培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司；細菌微量生化鑒定管 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；2×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 天一輝遠生物科技有限公司；PCR板 愛思進生物技術（杭州）有限公司。

1.2 儀器與設備

Mikro 120臺式離心機 廣州市華粵行儀器有限公司；DL-CJ-2NDH超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Thermal Cycler 2720 PCR儀、3730XL測序儀美國ABI公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；BPC-150F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；Gel DocTM XR+紫外分析儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 腐敗菌的分離純化

在4 ℃無菌冷庫（使用紫外燈照射30 min）中將鮰魚進行宰殺，去除鱗片、魚頭及內臟，進行無菌取樣，取背鰭附近肌肉組織約20 g，真空包裝后4 ℃冷藏7 d。在超凈工作臺上取適量冷藏樣品切碎，然后放入裝有200 mL生理鹽水的錐形瓶中振蕩均勻，制成菌懸液。將菌懸液進行一系列梯度稀釋，取適當濃度梯度的菌懸液1 mL于LB瓊脂培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑選各個平板上白色圓形菌落，用平板劃線法分離純化菌株，選取形成菌落形狀穩(wěn)定的菌株并分別編號為by 7-2、bs 7-3。

1.3.2 革蘭氏染色、生化鑒定及負染

分離得到的菌種進行革蘭氏染色，然后鏡檢觀察細菌的形態(tài)、大小及顏色等。將分離菌種接種至生化微量鑒定管中，然后在37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄生化鑒定結果。參考朱艷等的方法加以修改，取菌株by 7-2、bs 7-3的菌懸液置于以福爾瓦為膜的銅網(wǎng)上，用質量分數(shù)4%（pH 7.0）磷鎢酸溶液負染2～3 min，然后自然干燥，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察、拍照。

1.3.3 細菌DNA提取、16S rDNA測序及PCR擴增

因傳統(tǒng)的生化檢驗方法對微生物進行正確分類鑒定存在困難，而且容易出錯。王恒安等用革蘭氏陰性細菌檢測實驗卡鑒定某一菌種為醋酸不動桿菌，而16S rDNA序列分析結果和進化樹分析結果顯示為約翰遜不動桿菌。革蘭氏染色是鑒別微生物的重要手段之一，但并不能準確鑒定微生物的物種，故進行菌種鑒定時有必要運用核酸雜交和序列分析進行鑒定。參照趙欣宇等的方法提取細菌總DNA，然后將純化的DNA進行測序。PCR擴增體系（30 μL）為：2×PCR Mix 15 μL、DNA 1 μL、上、下游引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492R：TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT，濃度均為10 mmol/L）各1 μL、ddHO 12 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃復性30 s、72 ℃延伸45 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保溫。將PCR反應產(chǎn)物送至天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)對菌株by 7-2、bs 7-3提取獲得的16S rDNA序列進行相同序列檢索，選取合理且相似性高的DNA序列，然后使用MEGA 7.0.26軟件（美國MEGA公司）的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株菌落形態(tài)、革蘭氏染色及負染結果

從鮰魚背鰭肌肉組織中分離純化得到2 株菌株，分別編號為by 7-2、bs 7-3。細菌形態(tài)學觀察、革蘭氏染色鏡檢及負染結果為：菌株by 7-2在LB瓊脂培養(yǎng)基上為圓形、濕潤、白色菌落，進行革蘭氏染色鏡檢結果為革蘭氏陰性短桿菌，取菌懸液進行負染結果顯示為短桿菌且無鞭毛（圖1A～C）；菌株bs 7-3在LB瓊脂培養(yǎng)基上為圓形、濕潤、乳白色菌落，進行革蘭氏染色鏡檢結果為革蘭氏陰性短桿菌，取菌懸液進行負染顯示為長桿菌且無鞭毛（圖1A～C）。

圖1 by 7-2、bs 7-3菌株菌落（A）、革蘭氏染色（B）及負染后TEM圖（C）Fig. 1 Bacterial colonies (A), Gram staining (B) and negative staining (C)of strains by 7-2 and bs 7-3

2.2 菌株生化鑒定結果

分別將菌株by 7-2、bs 7-3接種至微量生化鑒定管中，然后在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。由表1可知：菌株by 7-2的硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、乙酰胺酶、分解木糖、分解麥芽糖、分解甘露醇、利用檸檬酸鹽、DNA酶、O-F實驗和氧化酶實驗均為陰性；菌株bs 7-3的硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、乙酰胺酶、分解木糖、分解麥芽糖、分解甘露醇、DNA酶和氧化酶實驗均為陰性，而利用檸檬酸鹽和O-F實驗為陽性。與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》比對分析可知，菌株by 7-2和菌株bs 7-3均與不動桿菌屬的生化特性基本相同。

表1 菌株by 7-2、bs 7-3生化鑒定實驗結果Table 1 Biochemical test results of strains by 7-2 and bs 7-3

2.3 菌株16S rDNA基因測序、系統(tǒng)發(fā)育樹構建及分析

分別以菌株by 7-2、bs 7-3細菌基因組DNA為模板，使用PCR擴增16S rDNA片段。由圖2可知，2 個菌株均在約1 500 bp處有明顯目的條帶。進一步對16S rDNA測序表明，菌株by 7-2目的片段大小為1 398 bp，菌株bs 7-3目的片段大小為1 408 bp。

圖2 純化菌種16S rDNA電泳圖Fig. 2 16S rDNA electropherogram of purified strains

將各個菌落的16S rDNA片段通過BLAST檢索系統(tǒng)進行序列比對分析及構建系統(tǒng)進化樹，由圖3～4可知，菌株by 7-2與約翰遜不動桿菌親緣關系最近，相似度達99.90%，菌株bs 7-3與抗輻射不動桿菌親緣關系最近，相似度達99.79%。

圖3 純化菌種by 7-2系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain by 7-2

圖4 純化菌種bs 7-3系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain bs 7-3

3 討 論

不動桿菌屬是需氧、不發(fā)酵、氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌，極易產(chǎn)生抗藥性，一般認為是條件致病菌。不動桿菌屬被認為是重要的醫(yī)院病原菌，特別是鮑氏不動桿菌，由于其具有較強抗藥性，故難以治療，且已發(fā)現(xiàn)由鮑曼不動桿菌引起的疑似新型冠狀病毒肺炎。Visca、Wang Tian等在進行不動桿菌病例分析時，對其進行革蘭氏染色，結果呈現(xiàn)出假陽性，本次實驗同樣也曾將不動桿菌染成陽性。具體分析原因，可能是部分不動桿菌屬菌株具有保留結晶紫并抵抗脫色的能力，從而誤將該菌認為是革蘭氏陽性菌。抗輻射不動桿菌除了抗輻射外，還能抵抗一定劑量的過氧化氫和紫外照射，因此很容易從醫(yī)院等環(huán)境中分離出。不動桿菌屬作為致病菌，因其容易產(chǎn)生泛耐藥性并在醫(yī)院內引起醫(yī)療保健相關感染暴發(fā)而受到越來越多的關注。不動桿菌不止感染人類，也是魚類致病菌，從而導致魚類患病或死亡，其中約翰遜不動桿菌是導致斑點叉尾鮰腸套疊的致病菌之一，約翰遜不動桿菌的感染也會導致短須裂腹魚大量死亡。

目前研究顯示，不動桿菌屬的分離源在食物中非常普遍，在果蔬、肉類、魚類、乳和乳制品及飲用水中均有分離。不動桿菌還是一種常見的腐敗菌，雖然其致腐能力較低，且不會產(chǎn)生有臭味的副產(chǎn)物，但是能增強假單胞菌和希瓦氏菌的腐敗能力，主要是由于希瓦氏菌無法產(chǎn)生酰基高絲氨酸內酯（acyl homoserine lactones，AHLs）群體感應信號，但可以利用不動桿菌產(chǎn)生的3 種AHLs（C-HSL、O-C-HSL、O-C-HSL），尤其是C-HSL可以促進希瓦氏菌的生長，且希瓦氏菌利用不動桿菌產(chǎn)生的AHLs可產(chǎn)生4 倍多的胞外蛋白酶，而O-C-HSL可以增強希瓦氏菌硫氧化蛋白還原酶trxB mRNA的表達，從而加快魚類的腐敗變質。不動桿菌屬是斑點叉尾鮰的優(yōu)勢腐敗菌之一，可以利用氨基酸生長繁殖同時產(chǎn)生酯類、酸類等物質，造成食品變酸、腐敗?？馆椛洳粍訔U菌可生活在偏堿性的環(huán)境中，因而其產(chǎn)生的脂肪酶在堿性條件下具有較強的活性，對中長鏈脂肪具有較好的選擇性。釀酒酵母能夠刺激不動桿菌屬某些細菌的生長，其促進因子為乙醇，原因在于部分不動桿菌缺乏生成乙醇的乙醇脫氫酶，低劑量的乙醇不僅能促進菌株生長，還可以改變其生理功能，增強不動桿菌對鹽的抵抗力及致病性，從而加快魚類腐敗，增強對人的致病能力。Wang Xinyun等通過超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法評估大眼金槍魚腐敗中約翰遜不動桿菌和熒光假單胞菌共同培養(yǎng)的代謝變化，結果表明，由于戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、苯丙氨酸代謝和氨基酸變化，使得共同培養(yǎng)產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物，從而加快了腐敗進程。趙丹丹等研究真菌發(fā)酵魚糜中鮑氏不動桿菌腐敗能力及其群體感應現(xiàn)象，結果表明，鮑氏不動桿菌具有較強的蛋白水解酶活性，在其繁殖過程中會產(chǎn)生大量有機酸和揮發(fā)性鹽基氮。綜上表明，不動桿菌屬是食品中常見的腐敗菌和致病菌，因而應得到廣泛的重視。

4 結 論

通過平板分離純化，從冷藏鮰魚肌肉組織中分離、鑒定得到2 株菌株，分別編號為by 7-2、bs 7-3，經(jīng)革蘭氏染色、生化鑒定、16S rDNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結果表明，by 7-2與約翰遜不動桿菌親緣關系最近，相似度達99.90%，bs 7-3與抗輻射不動桿菌親緣關系最近，相似度達99.79%。冷藏是魚類運輸?shù)闹饕绞街?，本實驗通過對鮰魚肌肉組織進行真空包裝，并在4 ℃冷藏條件下貯藏7 d，分離出不動桿菌，表明不動桿菌具有一定抗低溫及在缺氧時仍能存活的能力，結果為研究魚類腐敗、豐富魚源不動桿菌及研究不動桿菌提供了參考。