張 伉,馮 穎,林鑫華,戚 昀

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438;2.溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院附屬眼視光醫(yī)院,浙江溫州 325027;3.溫州醫(yī)科大學(xué) 眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點實驗室,浙江 溫州 325027)

Hippo信號通路最早是通過果蠅的遺傳學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)的,后續(xù)在哺乳動物中進(jìn)行的大量研究證實其具有高度保守性。

早期在果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡實現(xiàn)對器官大小的控制[1-4]。果蠅中Hippo信號通路上游為Hippo(Hpo)/Salvador(Sav)-Warts(Wts)/Mats蛋白激酶鏈[1-11],下游為轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子Yorkie(Yki)和轉(zhuǎn)錄因子Scalloped(Sd)[12-16],上游激酶通過調(diào)節(jié)Yki的亞細(xì)胞定位來發(fā)揮作用。當(dāng)信號分子激活Hpo-Sav復(fù)合體后,活化的Hpo-Sav復(fù)合體磷酸化Wts-Mats復(fù)合體,進(jìn)而促使Yki的磷酸化[5-9]。磷酸化的Yki與細(xì)胞骨架蛋白14-3-3結(jié)合并滯留于細(xì)胞質(zhì)中,最終經(jīng)泛素化途徑被降解[12,15,17];當(dāng)Hippo信號通路關(guān)閉時,去磷酸化的Yki進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子Sd結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,激活靶基因的表達(dá)[13-16]。典型的靶基因有細(xì)胞凋亡抑制因子Diap1、細(xì)胞周期蛋白Cyclin E和促進(jìn)增殖抑制凋亡的microRNA bantam[3-4]。多項研究報道通路上游激酶Hpo、Wts的突變或者Yki的過表達(dá)均會引起細(xì)胞增殖和凋亡異常,造成果蠅眼睛、翅膀等器官的過度生長[3,5,7,9]。

哺乳動物Hippo信號通路由果蠅對應(yīng)的同源蛋白組成,上游為級聯(lián)激酶MST1/2/SAV1、LATS1/2/MOB1,下游為效應(yīng)因子YAP/TAZ和轉(zhuǎn)錄因子TEAD1-4[16]。已有大量研究在小鼠肝臟、心臟等器官中驗證了Hippo信號通路調(diào)控器官大小這一功能[17-23]。此外,Hippo信號通路對損傷后的組織再生也至關(guān)重要,其報道的功能包括調(diào)節(jié)腸損傷條件下的腸道再生,調(diào)節(jié)胚胎心臟以及損傷后的心臟再生等[19-21,24-27]。Hippo信號通路的失調(diào)和多種癌癥密切相關(guān),多個研究報道在小鼠多種組織中特異性敲除LATS1/2[28-29]、SAV1[24,30]、MST1/2[22,31-32]和MOB1[33]均可引起組織增生和癌癥發(fā)生,因此其在體內(nèi)受到嚴(yán)格的調(diào)控。

目前已知的Hippo信號通路的調(diào)控因子大多集中在上游級聯(lián)激酶的調(diào)控層面,這些調(diào)控因子能夠感知細(xì)胞極性、機械力、可溶性因子和應(yīng)激信號等多種環(huán)境和生理信號,主要包括以下幾類:(1)細(xì)胞頂端基底極性蛋白,如調(diào)控頂端 基底極性的Merlin(Mer)、Expanded(Ex)和Kibra蛋白,三者形成的復(fù)合物可以招募Hpo、Wts和Mats到頂端質(zhì)膜進(jìn)行磷酸化激活[34-37];(2)平面細(xì)胞極性蛋白,如建立平面細(xì)胞極性的關(guān)鍵分子Ft/Ds(Fat/Dachsous)蛋白異二聚體能夠直接調(diào)控Wts的磷酸化狀態(tài),或者通過影響Ex的穩(wěn)定性調(diào)控激酶活性[38-43];(3)G蛋白偶聯(lián)受體,不同亞型的G蛋白偶聯(lián)受體識別外界環(huán)境中不同的信號分子,進(jìn)而激活或抑制細(xì)胞內(nèi)的Hippo信號通路[44-46];(4)細(xì)胞骨架成分,如肌動蛋白微絲可通過Wts介導(dǎo)調(diào)控Yki的活性等[47-48]。

除了上游激酶受到的調(diào)控,下游轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子Yki作為從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核傳遞信號的關(guān)鍵分子,也受到磷酸化、泛素化等翻譯后修飾的調(diào)控。例如,細(xì)胞質(zhì)中Hippo信號通路上游Wts激酶對Yki的磷酸化修飾使Yki滯留在細(xì)胞質(zhì)中從而抑制Yki的活性[12]。細(xì)胞核內(nèi)CRL4蛋白質(zhì)復(fù)合體能夠泛素化降解Yki,而CDK7對Yki的磷酸化則抑制CRL4蛋白質(zhì)復(fù)合體的招募,維持核內(nèi)Yki的穩(wěn)定[49]。此外,Yki還受到蛋白 蛋白相互作用的調(diào)控,如生長抑制因子Tgi可以直接與Yki競爭和Sd的結(jié)合,從而抑制Hippo信號通路靶基因的表達(dá)[50]。

組蛋白去乙?；?Histone Deacetylase,HDAC)通過調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白的乙?；絽⑴c基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳調(diào)控。果蠅中共有5種HDAC,根據(jù)蛋白序列和結(jié)構(gòu)分為3類:Ⅰ類HDAC包括HDAC1和HDAC3,Ⅱ類HDAC包括HDAC4和HDAC6,Ⅲ類HDAC為Sirt2。其中僅有HDAC1和HDAC3具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。果蠅中缺失HDAC3會引起由促凋亡基因hid表達(dá)增加而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[51]。在多種惡性腫瘤中,HDAC3都呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平,其抑制劑表現(xiàn)出抗腫瘤活性[52-54],但是HDAC3通過什么機制參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展仍有待研究。

在本文中,為了尋找Hippo信號通路新的調(diào)控因子,我們以過表達(dá)Yki造成果蠅眼睛過度增生的表型為基礎(chǔ),進(jìn)行修飾因子篩選,鑒定出HDAC3能夠特異性地靶向Hippo信號通路參與調(diào)控果蠅眼睛大小。

1 材料和方法

1.1 果蠅品系和質(zhì)粒

果蠅品系GMR＞Yki,UAS-Dcr2/S-T、GMR＞Yki/CyO;UAS-Dcr2,Diap1-GFP/TM6B為作者雜交重組獲得;果蠅品系GMR＞Yki、GMR＞InRCA和GMR＞Yki;Diap1-GFP均來源于美國得克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心蔣進(jìn)教授實驗室;果蠅品系hh＞ex-lacZ、GMR＞SdGA和質(zhì)粒p UAST-Myc-Yki、p UAST-HA-Sd、3xSd2-Luc均來源于中科院生化細(xì)胞所張雷教授實驗室,果蠅品系UAS-HDAC3RNAi購于清華大學(xué)果蠅中心,其他果蠅品系If/Cyo;UAS-Dcr2/Tm6B、If/Cyo;MKRS/TM6B、Da-Gal4(Ⅲ)、GMR-Gal4(Ⅱ)品系和質(zhì)粒Renilla-Luc均源于本實驗室。

1.2 果蠅S2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

果蠅S2細(xì)胞在添加10%胎牛血清的Schneider培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng),培養(yǎng)箱溫度為25℃。使用HighGene Transfection reagent(ABclonal)對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 免疫熒光染色

在1×PBS中解剖3齡幼蟲,放入1 m L PBS溶液中;去上清,加入1 mL 4%PFA溶液,在室溫條件下,搖床固定20 min;用PBST溶液清洗3次;加入100μL 5%FBS溶液,在室溫條件下,搖床封閉15 min;去上清,加入100μL按一定比例配制的一抗,在4℃條件下,搖床孵育過夜;用PBST溶液清洗3次;加入100μL按1∶400(5%FBS)比例配制的二抗和適量DAPI,在室溫避光條件下,搖床孵育1 h;用PBST溶液清洗3次;在載玻片中間滴加適量Vectashield mounting medium(Vector Laboratories),在顯微鏡下剝離幼蟲成蟲盤,放入Vectashield mounting medium中,封片;激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。使用的抗體為:Rabbit anti-LacZ antibody(DSHB)、Rat anti-Cubitus interruptus(Ci)antibody(DSHB)。

1.4 RT-qPCR

向離心管中加入500μL TransZol up,放入3齡果蠅幼蟲,充分研磨。使用TranZol Up Plus RNA Kit(TransGen)提取總RNA,使用All-in-One cDNA Synthesis Super Mix(Bimake)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用2×SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake)進(jìn)行實時熒光定量PCR,檢測基因mRNA水平。引物序列為HDAC3(5′-CCTGGTAATGAACTACGGACTG-3′,5′-TTGCACAGAAGTCGAAGAGG-3′),rp49基因作 為內(nèi)參。

1.5 RNA干擾

以果蠅cDNA為模板,合成dsDNA,引物序列為5′-TAATACGACTCACTATAGGGACCTTACGGACCGAGTGATG-3′,5′-TAATACGACTCACTATAGGGACCACCAATGTGGGTACGTT-3′。使 用MEGAscript T7 Transcription Kit(Thermo Fisher)將dsDNA體外轉(zhuǎn)錄為RNA,使用Direct-zolTMRNA MiniPrep(Zymo Research)純化RNA,將純化后的RNA在95℃孵育5 min,使RNA退火以形成雙鏈dsRNA。GFP dsRNA作為對照。

1.6 雙螢光素酶報告系統(tǒng)分析

向96孔板每孔中加入200μL已添加血清的Schneider培養(yǎng)基(Gibco),接種S2懸浮細(xì)胞,控制細(xì)胞密度為2×10/5m L;向孔中滴加1μg dsRNA,重復(fù)3次;2 d后,將p UAST-Myc-Yki、p UAST-HA-Sd、p Ac-Gal4、Renilla-Luc和3×Sd2-Luc質(zhì)粒按照比例(共200 ng)加入到10μL Schneider培養(yǎng)基(Gibco)中,加入0.4μL轉(zhuǎn)染試劑后,混合均勻,滴加到S2細(xì)胞中;轉(zhuǎn)染60 h后,收集細(xì)胞,向細(xì)胞中加入適量5×Cell Lysis Buffer(Vazyme),吹打均勻,室溫靜置5 min使細(xì)胞裂解;吸取20μL細(xì)胞裂解液,使用Dual Luciferase Reporter Assay Kit(Vazyme)檢測螢光素酶報告基因的活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

利用Image J對果蠅成蟲眼睛大小和3齡幼蟲眼睛成蟲盤免疫熒光強度進(jìn)行定量測定。數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Graph Pad Prism進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。檢驗計算P值,*表示P＜0.05,**表示P＜0.01,***表示P＜0.001。

2 結(jié) 果

2.1 敲除HDAC3抑制由過表達(dá)Yki引起的果蠅眼睛過度增生

為了發(fā)現(xiàn)和鑒定Hippo信號通路新的調(diào)控因子,我們在果蠅中進(jìn)行了修飾因子篩選。篩選策略如下:利用在果蠅眼睛中特異性表達(dá)的GMR-Gal4驅(qū)動Yki過表達(dá)(GMR-Gal4,UAS-Yki,簡稱為GMR＞Yki),造成Hippo信號通路失調(diào),引起果蠅眼睛過度增生(圖1(a))。將此基因型的果蠅和RNAi品系的果蠅雜交,根據(jù)果蠅眼睛大小的變化,篩選能夠增強或抑制組織增生表型的修飾因子。我們初步篩選了近3 000個不同的RNAi品系,發(fā)現(xiàn)與對照相比,敲低HDAC3能夠抑制由過表達(dá)Yki引起的果蠅眼睛增生,使果蠅眼睛明顯變小(圖1(a,b))。同時,為了檢測基因的敲降效率,我們利用在果蠅全身表達(dá)的Da-Gal4驅(qū)動UAS-HDAC3RNAi,發(fā)現(xiàn)HDAC3的m RNA水平顯著降低(圖1(c)),證明該HDAC3 RNAi品系能夠有效地敲低HDAC3基因。

2.2 敲低HDAC3不影響其他信號通路

組織生長發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,涉及到多個基因和信號通路,為了排除Hippo信號通路之外的非特異性因素的干擾,我們將GMR-Gal4的果蠅和UAS-HDAC3RNAi果蠅品系雜交,發(fā)現(xiàn)僅敲低HDAC3對眼睛大小沒有影響(圖2(a,b))。胰島素受體信號通路也和組織生長發(fā)育相關(guān),過表達(dá)持續(xù)性激活形式的胰島素受體(GMR-Gal4,UAS-InRCA,簡稱為GMR＞InRCA)引起果蠅眼睛組織增生,敲低HDAC3同樣不能夠抑制此表型(圖2(c,d)),說明HDAC3特異性地調(diào)控Hippo信號通路參與的組織生長發(fā)育過程。

圖2 HDAC3特異性地影響Yki引起的組織增生Fig.2 HDAC3 specifically modulates eye tissue growth driven by Yki

2.3 HDAC3的缺失激活Hippo信號通路

接下來,為了探究HDAC3的缺失是否能夠激活Hippo信號通路,我們在不同器官中敲低HDAC3,觀察Hippo信號通路靶基因Diap1的表達(dá)變化。在眼睛成蟲盤中,利用GMR-Gal4驅(qū)動Yki在形態(tài)溝(Morphogenetic Furrow,MF)的后部(P區(qū))過表達(dá),造成P區(qū)靶蛋白Diap1-GFP的表達(dá)顯著升高(圖3(a))。

圖3 HDAC3在果蠅成蟲盤調(diào)控Hippo信號通路靶基因的表達(dá)Fig.3 HDAC3 regulates Hippo target genes expression in Drosophila imaginal discs

在此背景下,敲低HDAC3使Diap1-GFP的表達(dá)水平顯著降低(圖3(a,b)),說明HDAC3的缺失激活了Hippo信號通路。

為了驗證HDAC3對Hippo信號通路的調(diào)控作用,我們又在翅膀成蟲盤中檢測Diap1和另一個靶基因Ex的表達(dá)水平。將基因型為hh-Gal4的果蠅與UAS-HDAC3RNAi果蠅雜交,后代中hh-Gal4驅(qū)動UAS-HDAC3RNAi在翅膀成蟲盤的P區(qū)表達(dá),結(jié)果造成翅膀成蟲盤發(fā)育嚴(yán)重缺陷(圖3(c,d))。以上結(jié)果說明在果蠅眼睛和翅膀的發(fā)育過程中,HDAC3的缺失都能夠激活Hippo信號通路,進(jìn)而調(diào)控器官發(fā)育。

2.4 敲低HDAC3不能改變由過表達(dá)Sd引起的果蠅眼睛過度增生

Yki作為轉(zhuǎn)錄共激活因子,進(jìn)入細(xì)胞核后需要與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體才能發(fā)揮功能,果蠅中Yki結(jié)合的最典型的轉(zhuǎn)錄因子是Sd,為探究HDAC3的作用位點是否在Sd上游,我們進(jìn)行了遺傳學(xué)上位性實驗。將基因型為GMR＞SdGA(GMR-Gal4,UAS-SdGA)的果蠅和UAS-HDAC3RNAi果蠅品系雜交,GMR-Gal4驅(qū)動眼睛中特異性表達(dá)持續(xù)激活形式的Sd,在此背景下敲低HDAC3不能改變由過表達(dá)Sd引起的眼睛過度增生(圖4),說明HDAC3的作用位點可能在Sd上游,通過作用于Yki來發(fā)揮調(diào)控功能。

圖4 敲低HDAC3不能改變過表達(dá)Sd引起的果蠅眼組織增生Fig.4 Knockdown of HDAC3 has no effect on overgrowth in eye tissue of Drosophila caused by overexpression of Sd

2.5 HDAC3失活抑制Sd-Yki轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性

上述實驗結(jié)果表明HDAC3可能作用于Yki,影響Yki和Sd的結(jié)合或者Sd-Yki復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性。為了初步探究HDAC3對Sd-Yki復(fù)合體的調(diào)控作用,我們在果蠅S2細(xì)胞中進(jìn)行了雙螢光素酶報告系統(tǒng)分析。首先構(gòu)建了靶向HDAC3的dsRNA,并對HDAC3dsRNA的RNAi效率進(jìn)行了驗證(圖5(a),見第400頁)。果蠅S2細(xì)胞經(jīng)HDAC3dsRNA處理后,轉(zhuǎn)染Myc-Yki質(zhì)粒、HA-Sd質(zhì)粒、Myc-Yki和HASd質(zhì)粒以及3×Sd2-Luc報告基因質(zhì)粒。3×Sd2-Luc報告基因質(zhì)粒含有Sd靶基因dSRF的增強子序列,細(xì)胞中表達(dá)的有功能活性的Sd-Yki轉(zhuǎn)錄復(fù)合體可以結(jié)合到此增強子序列上,驅(qū)動下游螢光素酶報告基因的表達(dá)。結(jié)果表明,和轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒相比,單獨表達(dá)Yki使Sd-Yki轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性有輕微的上升,單獨表達(dá)Sd或者共表達(dá)Yki和Sd使Sd-Yki轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性大幅上升。在此背景下,失活HDAC3則顯著抑制了Sd-Yki轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性(圖5(b),見第400頁)。

圖5 HDAC3失活抑制Sd-Yki轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性Fig.5 Inactivation of HDAC3 suppresses the transcription activity of Sd-Yki complex

3 討 論

21世紀(jì)初,Hippo信號通路作為抑制果蠅器官生長的機制被發(fā)現(xiàn)[1-2],隨后的研究證實其在組織再生和癌癥發(fā)生中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-33]。長期以來,大量研究報道Hippo信號通路在體內(nèi)受到多種調(diào)控因子的嚴(yán)格調(diào)控[34-48],但研究的內(nèi)容主要側(cè)重于通路上游,關(guān)于通路下游關(guān)鍵效應(yīng)因子Yki的調(diào)控機制,尚未得到很好的解答。由于在不同的動物模型中突變或者過表達(dá)Yki,都可造成Hippo信號通路失調(diào),引起器官大小的改變這一可被修飾的表型[12,18],已有研究以此表型為基礎(chǔ),在果蠅中通過靶向激酶和E3泛素連接酶的篩選發(fā)現(xiàn)和鑒定了Hippo信號通路中作用于Yki的調(diào)控因子[49,55]。因此,本研究旨在通過大規(guī)模的遺傳學(xué)篩選,進(jìn)一步探索Hippo信號通路下游的調(diào)控機制,加深對Hippo信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)知。

我們基于“過表達(dá)Yki導(dǎo)致果蠅眼睛過度增生”這一表型進(jìn)行修飾子篩選,獲得了有明顯抑制作用的修飾因子HDAC3。為了證明HDAC3對Hippo信號通路調(diào)控的特異性,我們又考察了HDAC3對其他組織生長發(fā)育相關(guān)信號通路的作用,發(fā)現(xiàn)敲低HDAC3并不能影響由胰島素受體信號通路激活引起的眼睛過度增生表型。隨后,我們通過Hippo信號通路靶基因的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在不同組織成蟲盤中敲低HDAC3都能調(diào)控Hippo信號通路的活性,而對成蟲盤發(fā)育產(chǎn)生的影響存在差異,可能是因為各個組織涉及的Hippo信號通路的元件不盡相同導(dǎo)致它們對通路的響應(yīng)也有所不同。另外,有研究報道果蠅翅膀成蟲盤中HDAC3的缺失會引起促凋亡基因hid表達(dá)增加,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,造成翅膀成蟲盤體積減小[51],這與我們的實驗結(jié)果一致。進(jìn)一步地,我們通過遺傳上位性分析明確了HDAC3在Hippo信號通路中的作用節(jié)點位于Sd的上游,通過Yki-Sd這一途徑發(fā)揮作用。最后,我們通過體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)HDAC3的缺失可以抑制Sd-Yki轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制Hippo信號通路靶基因的表達(dá)。

總的來說,我們通過遺傳學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶HDAC3參與Hippo信號通路的調(diào)控。蛋白質(zhì)去乙?；鳛槌Ｒ姷姆g后修飾,通過影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白 蛋白相互作用和蛋白亞細(xì)胞定位等來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能[56]。HDAC3作為蛋白質(zhì)去乙?；?被報道在多種腫瘤中起到致癌作用[57],而HDAC3抑制劑能夠競爭性地結(jié)合HADC3,起到緩解氧化應(yīng)激、調(diào)控免疫響應(yīng)、影響細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡的功能[58-61]。臨床上已開發(fā)多種HDAC3抑制劑作為抗腫瘤藥物[52-54,61],因此,進(jìn)一步闡述HDAC3調(diào)控Hippo信號通路的作用機制,將為開發(fā)HDAC3抑制劑靶向Hippo信號通路的癌癥治療提供思路。有研究表明HDAC3抑制劑CG200745能夠誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞表達(dá)miR-509-3p,進(jìn)而下調(diào)YAP和TEAD4的蛋白水平[61]?；谖覀兊难芯拷Y(jié)果,我們猜想HDAC3可能直接作用于Yki/YAP,介導(dǎo)Yki/YAP的去乙酰化修飾從而增強Yki/YAP和Sd/TEAD的結(jié)合,并促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄活性,但這一猜想仍有待進(jìn)一步研究。