趙 琳,王 菁,楊金龍,陸盼盼,王亞楠,楊辛毅,姜正濤,潘晗雨,沈曉婷,粱智銘,朱煥章

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438;2.復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438)

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告最新數(shù)據(jù)顯示,肺癌在36種常見(jiàn)癌癥中死亡率高居第一,發(fā)病率高居第二[1],5年總生存率僅為21%[2]。非小細(xì)胞肺癌(Non-Small-Cell Lung Cancer,NSCLC)是肺癌的主要類型,占肺癌病例的76%[3]。對(duì)于NSCLC的治療手段,其中包括手術(shù)、化療和放療,都未能達(dá)到預(yù)期的效果,因此亟需更有效的治療方法。近年來(lái),免疫檢查點(diǎn)阻斷已成為包括NSCLC等許多實(shí)體瘤的常規(guī)治療方法[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,免疫檢查點(diǎn)抑制劑(Immune Checkpoint Inhibitor,ICI)治療NSCLC是一種很有前景的選擇[5]。目前,美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的3種癌癥ICI藥物用于治療NSCLC,其平均客觀反應(yīng)率為20%[6]。這些藥物最初用于二線NSCLC轉(zhuǎn)移瘤治療方案[7-9]。現(xiàn)在其作用已擴(kuò)展到一線轉(zhuǎn)移瘤的治療方案[10]。在腫瘤免疫治療中,與免疫檢查點(diǎn)療法一起迅速發(fā)展的另一種療法是嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric Antigen Receptor T cell,CAR-T)療法。除了奇跡般地從急性白血病中幸存下來(lái)的Emily,還有兩名慢性白血病患者被CAR-T療法治愈[11-12]。然而,CAR-T在具有更復(fù)雜腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenvironment,TME)的實(shí)體腫瘤中前景并不樂(lè)觀[13]?？乖碳さ腡細(xì)胞的活化伴隨著程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(PD-1)表達(dá)的上調(diào)。而在炎性腫瘤環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞也有PD-L1上調(diào)的反應(yīng)機(jī)制,與PD-1結(jié)合導(dǎo)致免疫逃逸[14]。PD-1檢查點(diǎn)阻斷和CAR-T細(xì)胞療法分別顯示出很有前景的療效,并已被FDA批準(zhǔn)用于治療血液病[15]。許多研究人員已經(jīng)考慮將CAR-T細(xì)胞治療與PD-1檢查點(diǎn)阻斷治療相結(jié)合,試圖攻克實(shí)體腫瘤。PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑與CART細(xì)胞結(jié)合的策略已被廣泛應(yīng)用[16-18]。然而,這種策略可能導(dǎo)致副作用,如全身毒性[18]。在一種更安全的方法中,CAR-T細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞并分泌PD-1/PD-L1 scFv,這增強(qiáng)了PD-1/PD-L1 scFv的特異性和CAR-T細(xì)胞在TME中的持久性[19-20]。本研究為了緩解PD-1/PD-L1對(duì)CAR-T的抑制作用,設(shè)計(jì)構(gòu)建了靶向間皮素(MSLN)并分泌PD-1 scFv E27的E27-MesoCAR-T細(xì)胞,并探究其抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料與動(dòng)物

細(xì)胞系HEK293-17購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。過(guò)表達(dá)螢光素酶和人間皮素的NSCLC細(xì)胞株A549-ML之前由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并進(jìn)行凍存[21]。通過(guò)慢病毒感染A549-ML細(xì)胞構(gòu)建過(guò)表達(dá)PD-L1的細(xì)胞系A(chǔ)549-MPL。它們都培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中。

免疫缺陷雌性NSG小鼠購(gòu)自上海南模生物公司,并在無(wú)特定病原體(Specific Pathogen-Free,SPF)條件下生存。所有動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)皆通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)而進(jìn)行。

1.2 CAR慢病毒載體構(gòu)建

PD-1 scFv的序列借鑒了文獻(xiàn)[22],將原有的小鼠Ig K分泌信號(hào)調(diào)整為人IgG分泌信號(hào)后由金唯智公司合成。MesoCAR的結(jié)構(gòu)是由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(CD8 leader,anti-MSLN scFv P4和CD8 hinge)、CD8跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域和CD3ζ)組成的,序列同樣由金唯智公司合成。兩部分用T2A連接子連接后,再克隆到慢病毒載體p TRPE中。

1.3 CAR-T細(xì)胞的制備

首先從長(zhǎng)海醫(yī)院采集健康獻(xiàn)血者的血液樣本,然后按照倫理和安全標(biāo)準(zhǔn)使用。采用密度梯度離心法純化外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs),并通過(guò)Pan T細(xì)胞純化試劑盒(MiltenyiBiotec)從PBMCs中分離得到CD3+T細(xì)胞,培養(yǎng)于含5%胎牛血清(Gibco)、人IL-2和IL-15(R&D)的X-VIVO15(Lonza)培養(yǎng)基中,用CD3/CD28偶聯(lián)微珠(Thermo Fisher)激活。將CAR載體、p MD2.G和pSPAX2三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-17細(xì)胞制備慢病毒。CD3+T細(xì)胞活化48 h后,上述慢病毒感染過(guò)夜。感染后,T細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增12天,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR+T細(xì)胞比例。

1.4 CAR-T細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子釋放和增殖試驗(yàn)

CAR-T細(xì)胞和A549-MPL細(xì)胞效靶比NCAR-T/NA549-MPL分別為1∶1、5∶1和10∶1,共孵育6 h后,釋放的乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)含量作為檢測(cè)CAR-T細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性的指標(biāo)。共培養(yǎng)24 h的上清通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)定量細(xì)胞因子的釋放。

在增殖實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間A549-MPL細(xì)胞的刺激后,CAR-T細(xì)胞以5×10/3孔的密度加入96孔板中。在48 h和72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),加入CCK-8溶液(Dojindo),孵育4 h后檢測(cè)光密度(Optical density,OD)值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

在本研究中,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)一些細(xì)胞表面分子的表達(dá)。具體操作為,與抗體共孵育15 min后,收集細(xì)胞并洗滌兩次,然后用流式細(xì)胞儀(Beckman)收集細(xì)胞數(shù)據(jù)。

本研究中使用的抗體包括FITC標(biāo)記的人間皮素蛋白(Acro BioSystems)、PE標(biāo)記的小鼠抗人CD279單克隆抗體(BD)、PE標(biāo)記的小鼠抗人CD274單克隆抗體(BD)、生物素標(biāo)記的抗人間皮素單克隆抗體(Bio Legend)、APC標(biāo)記的鏈霉親和素(BD)等流式抗體。

1.6 Western blot

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-17細(xì)胞后,收集1×106細(xì)胞并離心。分離細(xì)胞沉淀和上清,分別作為E27表達(dá)和分泌的Western blot檢測(cè)樣品。上清液和全細(xì)胞裂解液加載到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。E27條帶通過(guò)兔抗HA一抗(CST)和羊抗兔IgG二抗(TransGen)標(biāo)記。β-actin條帶通過(guò)小鼠抗人β-actin一抗(TransGen)和山羊抗小鼠IgG二抗(TransGen)標(biāo)記。

1.7 NSCLC CDX小鼠模型的建立及CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性探究

采用A549-MPL細(xì)胞建立NSCLC CDX小鼠模型。按照5×10/6鼠的量計(jì)算所需A549-MPL細(xì)胞總數(shù),用PBS進(jìn)行3～4次清洗,最終用PBS按照5×10/6(100μL·鼠)的細(xì)胞密度重懸,注射到6周的雌性NSG小鼠皮下。7天后,腹腔注射麻醉劑(1%戊巴比妥鈉的使用劑量為50 mg/kg),待5～10 min后麻醉劑起效,尾靜脈輸入體內(nèi)用Luciferase底物(Promega);3 min后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(IndiGO)拍照,曝光時(shí)間120 s,將圖像背景值調(diào)為6 500 cps,觀察每只小鼠的成瘤情況。小鼠隨機(jī)分為Mock組、MesoCAR組和E27-MesoCAR組(n=5)。每7天進(jìn)行一次活體成像,監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。

1.8 腫瘤的稱重和抑瘤率的計(jì)算

從死亡的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)小鼠身上取出腫瘤組織,并用電子天平稱重。腫瘤抑制率η=(m對(duì)照組-m實(shí)驗(yàn)組)/m對(duì)照組×100%,其中m對(duì)照組為對(duì)照組腫瘤平均重量,m實(shí)驗(yàn)組為實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均重量。

1.9 免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)

小鼠皮下剝離的完整腫瘤組織塊,切取中間截面制作石蠟切片,進(jìn)行免疫組化染色,詳細(xì)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[21]的材料方法部分。

2 結(jié) 果

2.1 過(guò)表達(dá)PD-L1肺癌細(xì)胞系的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)間皮素的A549-ML細(xì)胞系為對(duì)象,設(shè)計(jì)并構(gòu)建含PD-L1(CD274)和篩選標(biāo)記的慢病毒載體(圖1(a)),制備病毒并感染上述MSLN+的A549-ML細(xì)胞,用潮霉素篩選一段時(shí)間,待細(xì)胞可以在較高濃度潮霉素培養(yǎng)條件下穩(wěn)定生長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)其PD-L1的表達(dá)情況,撤掉潮霉素,大規(guī)模擴(kuò)增凍存,獲得A549-MSLN-PD-L1(A549-MPL)細(xì)胞系。結(jié)果表明MSLN和PD-L1表達(dá)都在90%以上(圖1(b)、圖1(c)),可以作為靶細(xì)胞用于下游實(shí)驗(yàn)。并且在底物存在的情況下,A549-MPL可以催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光(圖1(d)),使實(shí)時(shí)報(bào)告動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況成為可能。

圖1 過(guò)表達(dá)PD-L1肺癌細(xì)胞系的構(gòu)建Fig.1 Construction of PD-L1-overexpressed NSCLC cell line

2.2 分泌型PD-1單鏈抗體E27的設(shè)計(jì)、構(gòu)建以及驗(yàn)證

我們從免疫原性、分泌效率方面對(duì)分泌信號(hào)進(jìn)行優(yōu)化,分別選擇了鼠IgKSS、人IL-2SS和人IgGSS 3種常用的分泌信號(hào)串聯(lián)在PD-1單鏈抗體E27和HA標(biāo)簽的前面,構(gòu)建到慢病毒載體骨架p TRPE上(圖2(a),見(jiàn)第408頁(yè))。3種分泌信號(hào)的序列從NCBI官網(wǎng)獲得,分別為:(1)Ig KSS(ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC);(2)IL-2SS(ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT);(3)IgGSS:ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACCGCAACCGGAGTGCACAGC。

經(jīng)過(guò)EcoRV單酶切位點(diǎn)酶切和NcoⅠ三酶切位點(diǎn)酶切驗(yàn)證載體并進(jìn)一步測(cè)序,將序列正確的重組質(zhì)粒標(biāo)記為IgGSS-E27、IL-2SS-E27和Ig KSS-E27,并進(jìn)行保種。

將3種質(zhì)粒分別瞬轉(zhuǎn)HEK293-17細(xì)胞,收集48 h胞內(nèi)總蛋白和培養(yǎng)基上清,通過(guò)抗HA標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)E27的表達(dá)和分泌(圖2(b));并且在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒質(zhì)量、細(xì)胞起始數(shù)量、培養(yǎng)體系相同和上樣量相同的情況下,可通過(guò)條帶顯色情況判斷3種分泌信號(hào)的分泌效率。由圖可以看出,3種分泌信號(hào)都可以成功地表達(dá)并分泌E27,根據(jù)條帶OD值可以分辨出IgGSS-E27載體的分泌效率稍有優(yōu)勢(shì),且是人源序列,不會(huì)引起潛在的免疫反應(yīng),因此我們選擇IgGSS-E27序列進(jìn)行下游載體的構(gòu)建。

圖2 分泌型PD-1單鏈抗體E27的慢病毒載體示意圖和E27的分泌Fig.2 Schematic diagram of E27 lentiviral vector and secretion of E27

2.3 E27-MesoCAR慢病毒載體的構(gòu)建與慢病毒制備

首先構(gòu)建MesoCAR,將CD8 leader、P4 scFv、CD8 hinge、CD8TM、4-1BB以及CD3ζ克隆到p TRPEGFP-T2A-m RFP上(圖3(a))。然后根據(jù)前期的優(yōu)化構(gòu)建帶有分泌型PD-1單鏈抗體元件的新型MesoCAR,將MesoCAR序列用T2A重組到Ig GSS-E27上,即p TRPE-MesoCAR-T2A-E27,簡(jiǎn)稱為E27-MesoCAR(圖3(b))。以MesoCAR和E27-MesoCAR質(zhì)粒作為目的載體,利用三質(zhì)粒慢病毒包裝體系制備慢病毒,抽提病毒基因組,在WPRE區(qū)域設(shè)計(jì)引物,qPCR檢測(cè)病毒單位體積的顆粒數(shù)。

用已知濃度的MesoCAR大提質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品擬定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3(c)),MesoCAR病毒的循環(huán)數(shù)閾值(Cycle Threshold,CT)為22,E27-MesoCAR病毒的CT值為22.92,代入回歸方程Y=-3.19X+37.08(R2=0.999 9),將得到的單位體積所含有的病毒顆粒數(shù)(N病毒)換算為滴度,分別為5.01×107/m L和2.75×107/m L。

圖3 CAR慢病毒載體示意圖及病毒滴度檢測(cè)Fig.3 Schematic diagram of CAR lentiviral vector and detection of virus titer

2.4 E27-MesoCAR-T細(xì)胞的制備及E27的表達(dá)

從血站獲取的健康人外周血中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞后,分選得到CD3+T細(xì)胞,CD3/CD28 Beads活化48 h后,用制備好的慢病毒感染T細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)為15),制備CAR-T效應(yīng)細(xì)胞。將慢病毒感染并培養(yǎng)擴(kuò)增12 d后的CAR-T細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象,對(duì)其CAR受體的表達(dá)以及E27的分泌情況進(jìn)行了測(cè)定。以人源間皮素重組蛋白作為抗體標(biāo)記CAR陽(yáng)性T細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示MesoCAR和E27-MesoCAR陽(yáng)性率都在50%以上(圖4(a))。以收集細(xì)胞培養(yǎng)基離心后得到的上清為樣品,免疫印跡結(jié)果表明E27在原代T細(xì)胞中也能夠成功地表達(dá)并且分泌到胞外(圖4(b))。

圖4 CAR-T細(xì)胞的CAR陽(yáng)性率以及E27的表達(dá)Fig.4 Proportion of CAR-T cells and expression of E27

2.5 E27-MesoCAR-T細(xì)胞的體外殺傷功能及細(xì)胞因子分泌

在scFv識(shí)別到腫瘤相關(guān)抗原后,CAR-T細(xì)胞將分泌細(xì)胞因子并脫顆粒。將Mock T、MesoCAR-T和E27-MesoCAR-T細(xì)胞與A549-MPL細(xì)胞共孵育,以CD107α、激活表面分子標(biāo)志物CD25/CD69以及IL-2、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子作為指標(biāo),驗(yàn)證其體外殺傷功能。再通過(guò)共孵育前后腫瘤細(xì)胞含量的變化以及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間死細(xì)胞釋放的LDH含量的比較,觀察CAR-T細(xì)胞殺傷效率。使CAR-T∶A549-MPL=2∶1,混合均勻并共同培養(yǎng),24 h后收集混合細(xì)胞并分為3份分別進(jìn)行CD25/CD69、CD107α表達(dá)以及兩種細(xì)胞組成比例變化的流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5,見(jiàn)第410頁(yè))顯示,實(shí)驗(yàn)組CD25表達(dá)上調(diào)(圖5(a)),說(shuō)明CART細(xì)胞被特異性激活。實(shí)驗(yàn)組特異性表達(dá)CD107α(圖5(b)),說(shuō)明CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了脫顆粒。圖5(c)流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞比例降低、T細(xì)胞比例升高,說(shuō)明CAR-T細(xì)胞特異性殺死了腫瘤細(xì)胞。

按照1∶1、5∶1和10∶1的比例,將CAR-T細(xì)胞和A549-MPL細(xì)胞共孵育。6 h后吸取50μL上清,檢測(cè)釋放的LDH與顯色試劑作用下的吸光值。結(jié)果如圖5(d)所示,隨著效靶比例的逐漸增加,CAR-T細(xì)胞裂解腫瘤細(xì)胞越來(lái)越充分,最高可達(dá)到60%,MesoCAR與Mock以及E27-MesoCAR與Mock之間都存在顯著性差異(P＜0.01)。以效靶比為10∶1共孵育,24 h培養(yǎng)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)IL-2、TNF-α和IFN-γ3種細(xì)胞因子釋放,圖5(e)的ELISA結(jié)果顯示CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)基所含3種細(xì)胞因子的濃度從300～6 000 pg/m L不等,但均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),說(shuō)明CAR-T細(xì)胞可以針對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性大量分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子。

圖5 CAR-T細(xì)胞在體外對(duì)A549-MPL的特異性殺傷Fig.5 Specific lysis of CAR-T cells against A549-MPL in vitro

2.6 分泌型PD-1單鏈抗體E27增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞增殖活性

CAR-T細(xì)胞在腫瘤表面抗原的反復(fù)刺激下會(huì)呈現(xiàn)出耗竭的狀態(tài),主要表現(xiàn)為PD-1等免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)上調(diào),T細(xì)胞活性與增殖能力下降,導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞逐漸失去殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。為了模擬浸潤(rùn)瘤體的CAR-T細(xì)胞反復(fù)被抗原刺激的狀態(tài),將CAR-T和A549-MPL細(xì)胞共孵育,在48 h和72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)MesoCAR-T和E27-MesoCAR-T細(xì)胞的活力和增殖能力。第0天時(shí),取等量CAR-T細(xì)胞,一組不做處理單獨(dú)培養(yǎng)即A549-MPL(-)組,一組與A549-MPL細(xì)胞共培養(yǎng)即A549-MPL(+)組。MesoCAR-T細(xì)胞在48 h時(shí),共同孵育組T細(xì)胞數(shù)量略微領(lǐng)先于未處理組,但在72 h時(shí)共同孵育組T細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)落后于未處理組(圖6(a)左)。E27-MesoCAR-T細(xì)胞在48 h和72 h時(shí),共同孵育組T細(xì)胞數(shù)量明顯多于未處理組(圖6(b)左),猜測(cè)是在腫瘤相關(guān)抗原刺激下CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增效率提高。我們又比較了兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)OD值的改變倍數(shù),相較于MesoCAR-T細(xì)胞,A549-MPL(-)組和A549-MPL(+)組之間存在顯著性差異(圖6(a)右),E27-MesoCAR-T細(xì)胞兩組之間無(wú)明顯差異(圖6(b)右),表明在PD-L1+的A549-MPL反復(fù)刺激下,MesoCAR-T細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P＜0.01),而E27-MesoCAR-T細(xì)胞分泌的E27緩解了這種抑制。流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)過(guò)腫瘤細(xì)胞共孵育后的CAR-T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)(圖6(c))和凋亡(圖6(d))情況,MesoCAR組44.0%的T細(xì)胞檢測(cè)到PD-1的表達(dá),且34.4%的細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài);E27-MesoCAR組檢測(cè)到不足8.5%的PD-1表達(dá)和細(xì)胞凋亡。

圖6 E27可以增加MesoCAR-T經(jīng)過(guò)抗原反復(fù)刺激后的增殖能力Fig.6 E27 enhances the proliferation of MesoCAR-T cells after repetitive antigen stimulation

2.7 NSG小鼠體內(nèi)E27-MesoCAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用

2.7.1 E27-MesoCAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用

基于觀察到的在體外E27的分泌對(duì)于MesoCAR-T細(xì)胞耗竭的阻斷作用,我們繼續(xù)在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549-MPL的動(dòng)物模型中評(píng)估E27-MesoCAR-T細(xì)胞的優(yōu)越性。首先于第0天在每只NSG小鼠皮下種植5×106個(gè)A549-MPL細(xì)胞,第7天通過(guò)尾靜脈靜脈注射第一輪對(duì)照組、MesoCAR-T組和E27-MesoCAR-T組細(xì)胞,每組5只小鼠,每只每輪注射1×107個(gè)細(xì)胞;第14天通過(guò)尾靜脈注射第2輪細(xì)胞。尾靜脈注射螢光素酶底物,每周檢測(cè)一次A549-MPL細(xì)胞系的化學(xué)發(fā)光,通過(guò)活體成像監(jiān)控小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況(圖7(a),見(jiàn)第412頁(yè))。結(jié)果如圖7(b)(見(jiàn)第 412頁(yè))所示,在第28天E27-MesoCAR組有1只小鼠活體成像未檢測(cè)到熒光,1只小鼠熒光值仍處于24 000 cps以下,而實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的其他小鼠熒光值均過(guò)曝(最大熒光值超過(guò)65 535 cps),對(duì)照組甚至出現(xiàn)因?yàn)槟[瘤過(guò)大腫瘤局部壞死的情況(Mock組左數(shù)第2只小鼠背部呈現(xiàn)黑色的位置);我們利用Image J軟件統(tǒng)計(jì)了熒光面積,結(jié)果顯示E27-MesoCAR組和MesoCAR組與對(duì)照組腫瘤大小存在明顯差異(P＜0.01),同時(shí)E27-MesoCAR組和MesoCAR組腫瘤大小也存在差異(P＜0.05)(圖7(c),見(jiàn)第412頁(yè))。第33天,待各組小鼠死后解剖取出皮下腫瘤,腫瘤實(shí)物圖如圖7(d)(見(jiàn)第 412頁(yè))所示;稱量腫瘤重量,可以觀察到MesoCAR組和E27-MesoCAR組腫瘤重量較Mock組顯著性縮小(P＜0.01),抑瘤率分別為89.1%和97.4%(圖7(e),見(jiàn)第412頁(yè))。

圖7 體內(nèi)E27-MesoCAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用Fig.7 Antitumor effect of E27-MesoCAR-T cells in vivo

2.7.2 PD-1阻斷型單鏈抗體E27增強(qiáng)MesoCAR-T細(xì)胞體內(nèi)的增殖和持久性

為了觀察T細(xì)胞在體內(nèi)的增殖情況,在第31天,通過(guò)小鼠眼眶靜脈采血,流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中人CD3+T細(xì)胞的含量。結(jié)果顯示,E27-MesoCAR組小鼠外周血中人CD3+T細(xì)胞含量為27.3%,顯著性高于其他兩組(P＜0.01)(圖8(a))。隨機(jī)選擇1只Mock組、1只MesoCAR組和1只E27-MesoCAR組小鼠皮下剝離的腫瘤組織,進(jìn)行ICH染色,染色指標(biāo)為人CD3,選擇代表性視野分別放大10倍和40倍觀察(圖8(b))。隨機(jī)選擇3個(gè)40×視野,計(jì)數(shù)腫瘤組織內(nèi)部T細(xì)胞的數(shù)量(圖8(c))。結(jié)果顯示,E27-MesoCAR組腫瘤組織內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量顯著性多于MesoCAR組(P＜0.01),與E27抗體在體外可以阻斷腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間接觸導(dǎo)致的T細(xì)胞耗竭,增強(qiáng)其增殖能力以及持久性的結(jié)果相一致。

圖8 PD-1單鏈抗體E27增強(qiáng)MesoCAR-T細(xì)胞體內(nèi)的增殖和持久性Fig.8 E27 enhances the proliferation and persistence of MesoCAR-T cells in vivo

3 討 論

本文針對(duì)TME導(dǎo)致的免疫抑制問(wèn)題,提出了聯(lián)合PD-1阻斷和CAR-T細(xì)胞治療的解決思路,對(duì)安全性和有效性做出了優(yōu)化。

首先,在分泌型PD-1單抗聯(lián)用MesoCAR-T細(xì)胞治療非小細(xì)胞肺癌方面完成了全部序列人源化的設(shè)計(jì)。CAR-T臨床試驗(yàn)的主要安全性問(wèn)題為脫靶毒性和細(xì)胞因子風(fēng)暴,但NSG小鼠由于較為嚴(yán)重的免疫缺陷以及與人種屬差異的存在,對(duì)于CAR-T安全性的準(zhǔn)確評(píng)估并不是合適的模型,相比較而言臨床數(shù)據(jù)更具有參考價(jià)值和意義。間皮素在肺癌患者中的表達(dá)頻率為60%～65%[23],已經(jīng)在美國(guó)臨床試驗(yàn)網(wǎng)站注冊(cè)的23項(xiàng)試驗(yàn)中有12項(xiàng)的適應(yīng)癥包含肺癌[24]。并且已經(jīng)公開(kāi)的相關(guān)數(shù)據(jù)和結(jié)果顯示,除了由于鼠免疫原性的間皮素單鏈抗體引起的急性過(guò)敏反應(yīng)[25]和宿主對(duì)抗體以及T細(xì)胞的免疫反應(yīng)導(dǎo)致回輸?shù)腃AR-T持續(xù)時(shí)間較短療效不佳[26]之外,未出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征或神經(jīng)毒性等癥狀,因此我們認(rèn)為間皮素是CAR-T治療肺癌患者的一個(gè)安全有效的靶點(diǎn)。我們通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)和專利,從序列種屬來(lái)源和PD-1阻斷方式角度優(yōu)化CAR載體。靶向間皮素的人源化單鏈抗體序列,這里我們參考了專利WO2013063419A1中的P4單抗序列,其構(gòu)成的抗間皮素CAR-T細(xì)胞在小鼠實(shí)驗(yàn)中療效顯著[27]?，F(xiàn)階段PD-1免疫檢查點(diǎn)療法和CAR-T療法的聯(lián)合治療臨床試驗(yàn)共有17例,其中適應(yīng)癥為實(shí)體瘤的有11例[28]。聯(lián)合方式主要有3種:PD-1阻斷劑藥物、CAR-T細(xì)胞PD-1表達(dá)的干擾和CAR-T細(xì)胞分泌PD-1抗體。考慮到分泌型抗體具有更強(qiáng)的靶向性可以避免系統(tǒng)給藥帶來(lái)的副作用,相較于單純的部分回輸T細(xì)胞PD-1表達(dá)干擾,分泌型抗體在自分泌封閉自身T細(xì)胞的同時(shí)也可以通過(guò)旁分泌的方式封閉腫瘤區(qū)域的其他免疫細(xì)胞,我們參考了專利US20180127502A1中的E27單抗序列,該單抗與抗原結(jié)合能力較強(qiáng)且在上清液中穩(wěn)定性極高[29],并且在保證分泌效率的情況下我們將分泌信號(hào)序列從原來(lái)的鼠源替換成了人源IgGSS序列。

其次,證明了在免疫抑制性的實(shí)體瘤微環(huán)境中,通過(guò)增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的增殖活性和抗凋亡能力,E27-MesoCAR-T在體內(nèi)外得到了更好的抗腫瘤效果,Hu等[30]在敲除PD-1以增強(qiáng)靶向間皮素CAR-T效應(yīng)功能的研究過(guò)程中也得到了相同的結(jié)論。

而在阻斷PD-1抗體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上,本文選擇了以scFv的形式分泌到胞外。考慮到scFv的穩(wěn)定性較差、親和力較弱等特征,一種通過(guò)增加抗體結(jié)合價(jià)并引入Fc片段的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)能否帶來(lái)更顯著的治療優(yōu)勢(shì)值得進(jìn)一步驗(yàn)證,如IgG4型單克隆抗體結(jié)構(gòu)[31]。另一方面,在肺癌小鼠模型的建立中依然存在改進(jìn)完善的空間。本文選擇了高表達(dá)MSLN和PD-L1非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系作為靶細(xì)胞,在NSG小鼠背部皮下進(jìn)行了移植。由于移植位置不屬于重要組織器官,也不影響小鼠正?；顒?dòng),所以即使瘤體最大長(zhǎng)度達(dá)到1.5 cm小鼠也不會(huì)因?yàn)楹闪鲐?fù)擔(dān)過(guò)大而死,但達(dá)到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理的處死規(guī)定,因此不能采集到生存曲線的數(shù)據(jù),肺部原位移植不失為一個(gè)更為合理的小鼠模型[20]。而對(duì)于不同的患者腫瘤樣本來(lái)說(shuō),MSLN和PD-L1的陽(yáng)性率都達(dá)到90%以上的情況是極少數(shù)的,在我們構(gòu)建的細(xì)胞模型中分泌型PD-1單抗的MesoCAR-T細(xì)胞展現(xiàn)出顯著的治療優(yōu)勢(shì),但在患者體內(nèi)能否維持,還需要通過(guò)病人來(lái)源腫瘤異種移植的小鼠進(jìn)一步探討。