耿娟， 韓榮嘉， 劉建華， 陳上將， 翟亞軍， 范鐘銹， 苑麗， 吳華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

貓作為伴侶動(dòng)物可以滿足人類的情感需要，具有非常重要的情感價(jià)值。根據(jù)中國(guó)《2021年寵物行業(yè)白皮書(shū)》報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，貓?jiān)趯櫸镏兴急壤_(dá)到59.5%，已經(jīng)超過(guò)了犬成為人類飼養(yǎng)最多的寵物[1]。但是，貓也是常見(jiàn)的細(xì)菌攜帶者和傳染源，能攜帶多種與人類相關(guān)的病原菌，加之在中國(guó)城鎮(zhèn)家庭中寵物貓經(jīng)常與人類共同居住，接觸頻繁，導(dǎo)致由貓傳播的細(xì)菌性傳染病呈高發(fā)趨勢(shì)，且存在細(xì)菌感染和耐藥性菌株橫向傳播的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。相關(guān)研究表明，貓和人類在臨床治療細(xì)菌感染性疾病時(shí)所使用的部分抗菌藥物一致或多數(shù)一致，這意味著相同耐藥背景的耐藥菌會(huì)產(chǎn)生人獸互相傳遞的風(fēng)險(xiǎn)[4]?；疾櫸矬w內(nèi)會(huì)攜帶大量與人類健康密切相關(guān)的耐藥菌群，無(wú)論患病及康復(fù)后的寵物都被認(rèn)為是潛在的抗性細(xì)菌庫(kù)，貓也不例外[5]。此外，貓還會(huì)通過(guò)排泄、呼吸和添食等途徑導(dǎo)致耐藥菌群的二次傳播[6]。同時(shí)，貓自身攜帶的多重耐藥菌群會(huì)和人源多重耐藥菌群發(fā)生交叉?zhèn)鞑?，在公共衛(wèi)生層面上對(duì)抗生素及抗菌藥的使用產(chǎn)生較大影響[7-9]。

關(guān)注寵物貓?jiān)床≡哪退幈硇图岸嘀啬退幥闆r，將有助于了解寵物貓臨床抗生素及抗菌藥的使用情況，對(duì)制定合理的臨床抗菌治療方案以及減緩人醫(yī)和獸醫(yī)臨床多重耐藥菌株的增加與橫向傳播而言意義重大。中國(guó)國(guó)內(nèi)部分地區(qū)已經(jīng)有針對(duì)當(dāng)?shù)貙櫸锊≡哪退幮詸z測(cè)及其多重耐藥分析的研究[10-13]，但鄭州地區(qū)有關(guān)此類研究報(bào)道相對(duì)較少。同時(shí)，已有研究多集中于寵物犬源病原菌耐藥性的探討，而對(duì)寵物貓攜帶的病原菌的藥物敏性研究和多重耐藥分析較為匱乏。本研究針對(duì)鄭州市寵物貓?jiān)床≡M(jìn)行分離鑒定、藥物敏感性分析及多重耐藥表型探究，旨在了解和掌握鄭州市寵物源主要病原菌的多重耐藥情況，為寵物貓臨床合理使用抗生素或抗菌藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 于2021年7—9月在鄭州市多家寵物醫(yī)院無(wú)菌采集寵物貓(15只美短、8只英短、21只布偶、11只貍花和8只折耳)咽拭子、鼻拭子和肛拭子共計(jì)63份樣品。其中，健康寵物貓49份，患病寵物貓14份。

1.1.2 培養(yǎng)基及標(biāo)準(zhǔn)菌株 麥康凱(MacConkey，MacC)瓊脂培養(yǎng)基(大腸桿菌選擇培養(yǎng)基)、沙門(mén)志賀菌屬(salmonella-shigella，SS)瓊脂培養(yǎng)基(沙門(mén)氏菌選擇培養(yǎng)基)、腸球菌瓊脂培養(yǎng)基、BP(Baird-Parker)瓊脂培養(yǎng)基(加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞碲酸鹽卵黃增菌液)和LB(lysogeny broth)肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自河南天馳生物公司。質(zhì)控菌株為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌株，包括大腸桿菌(Escherichiacoli)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC 25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC 29213、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC 29212。

1.1.3 藥品 本研究中藥物分為7類14種(6類12種抗生素，以及氟喹諾酮類2種抗菌藥物)。β-內(nèi)酰胺類抗生素包括頭孢喹肟(cefquinome, CFQ)、頭孢噻呋(ceftiofur, CEF)和阿莫西林(amoxicillin, AMX)；四環(huán)素類抗生素包括多西環(huán)素(doxycycline, DOX)和替加環(huán)素(tigecycline, TGC)；酰胺醇類抗生素包括氟苯尼考(florfenicol, FFC)；氨基糖苷類抗生素包括慶大霉素(gentamicin, GEN)和阿米卡星(amikacin, AMK)；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素包括泰樂(lè)菌素(tylosim, TYL)、阿奇霉素(azitromycin, AZM)和替米考星(tilmicosin, TIL)；氟喹諾酮類抗菌藥包括恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)和氧氟沙星(ofloxacin, OFX)；多肽類抗生素包括黏菌素(colistin, COL)。上述藥品均購(gòu)自河南天馳生物科技有限公司，分析純。藥液初始質(zhì)量濃度統(tǒng)一配制為5 120 μg·mL-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離與純化 將無(wú)菌采集的寵物貓鼻拭子、咽拭子和肛拭子加入至 5 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37 °C振搖培養(yǎng)12 h，肉湯渾濁后用接種環(huán)挑菌接種于血平板上，37 ℃培養(yǎng) 18～24 h可見(jiàn)不同形態(tài)的細(xì)小菌落。挑取不同形態(tài)的菌落分別劃線接種于MacC、SS、BP及腸球菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24 h，挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落再次分別接種上述瓊脂固體培養(yǎng)基中，分離純化至3代以上，至呈現(xiàn)單一明確菌落。

1.2.2 染色鏡檢 對(duì)選擇培養(yǎng)后疑似大腸桿菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcus)、腸球菌(Enterococcus)及沙門(mén)氏菌(Salmonella)等進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察。挑取純化單菌落加生理鹽水后涂勻至載玻片中心，按照初染、媒染、脫色和復(fù)染4個(gè)步驟進(jìn)行染色，最后通過(guò)奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(CX23，日本)進(jìn)行鏡檢觀察(×1 000)。

1.2.3 16S rRNA鑒定 將鏡檢疑似菌株進(jìn)行16S rRNA通用引物擴(kuò)增和特異性引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。引物設(shè)計(jì)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，并由北京擎科生物科技有限公司合成。通用引物16S rRNA-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S rRNA-R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT；擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為1 600 bp。沙門(mén)氏菌特異性引物(invasionproteinA,invA)invA-F：AAAAGAAGGGTCGTCGTTAG；invA-R：TACCACTCGCATCAAATCAA；預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為280 bp。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，2×Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃(退火溫度由上下游引物決定)退火30 s，72 ℃延伸2 min(延伸時(shí)間由片段長(zhǎng)度決定);30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果后，送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，并進(jìn)行Blast比對(duì)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn) 依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Clinical and laboratory Standards Institute, CLSI)(2020)[14]推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定各種抗生素及抗菌藥對(duì)寵物貓?jiān)床≡淖钚∫志鷿舛?minimal inhibitory concentration,MIC)。以ATCC 25922作為大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控，以ATCC 29213作為葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控，以ATCC 29212作為腸球菌的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控。如上述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌對(duì)被檢抗菌藥物MIC在質(zhì)控范圍內(nèi)，且陽(yáng)性對(duì)照有細(xì)菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，測(cè)得MIC結(jié)果有效。CFQ的MIC耐藥折點(diǎn)依據(jù)參考文獻(xiàn)[15]，其他藥物MIC依據(jù)CLSI(2020)[14]和歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(huì)(The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST)(2019，2020)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定[16-17]。

1.2.5 藥物多種及多重耐藥試驗(yàn) 多種耐藥統(tǒng)計(jì)方法是把對(duì)被檢抗菌藥物中的1種藥物耐藥統(tǒng)計(jì)為1耐(1R)，對(duì)被檢抗菌藥物中的2種藥物耐藥統(tǒng)計(jì)為2耐(2R)，以此類推；多重耐藥的表型確定標(biāo)準(zhǔn)是同時(shí)對(duì)3類抗生素(抗菌藥)耐藥[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 寵物貓?jiān)床≡蛛x與鑒定

2.1.1 寵物貓?jiān)床≡?6S rRNA與invA基因鑒定 寵物貓?jiān)床≡?jīng)選擇培養(yǎng)和分離純化后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，選擇疑似大腸桿菌、腸球菌、沙門(mén)氏菌和葡萄球菌通過(guò)16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，并對(duì)疑似沙門(mén)氏菌進(jìn)行特異基因invAPCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)Blast比對(duì)，各種菌株分別與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列以及沙門(mén)氏菌invA基因序列同源性都大于99%。

M, DL2000; 1～17，試驗(yàn)菌株；其中15、17是沙門(mén)氏菌invA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2.1.2 寵物貓?jiān)床≡蛛x鑒定結(jié)果 本試驗(yàn)從63份樣品中總計(jì)分離獲得42株細(xì)菌，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，大腸桿菌和腸球菌的分離率最高，分別是16株(16/42，38.1%)和14株(14/42，33.3%)，屬于寵物貓病原菌優(yōu)勢(shì)菌群[5]；獲得葡萄球菌8株，分離率為19.1%(8/42)；沙門(mén)氏菌株4株，分離率最低為9.5%(4/42)

表1 寵物貓?jiān)床≡攴蛛x數(shù)量與分離率Table 1 Number of strain isolates and the isolation rate of pathogens isolated from companion felines

2.2 寵物貓?jiān)床≡幬锩舾行栽囼?yàn)

2.2.1 大腸桿菌和腸球菌藥物敏感性試驗(yàn) 如表2所示，寵物貓?jiān)创竽c桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類的3種抗生素CFQ、CEF和AMX的耐藥率比較高，分別是56.3%、68.8%和100.0%；對(duì)四環(huán)素類藥物DOX的耐藥率為37.5%，而對(duì)TGC的敏感率為100.0%；對(duì)酰胺醇類獸醫(yī)專用抗生素FFC的耐藥率為31.3%；對(duì)氨基糖苷類藥物AMK和GEN的敏感率分別為75.0%和43.8%，耐藥率均為25.0%；對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素AZM的敏感率相對(duì)較高，為87.5%；而對(duì)氟喹諾酮類藥物ENR和OFX的敏感率均為68.8%；多肽類抗生素COL因其獨(dú)特的作用機(jī)制，對(duì)寵物貓?jiān)创竽c桿菌的敏感率為100.0%。因此，對(duì)寵物貓?jiān)创竽c桿菌敏感性最強(qiáng)的抗菌藥物依次是COL(100.0%)、TGC(100.0%)、AZM(87.5%)、AMK(75.0%)、ENR(68.8%)和OFX(68.8%)；而耐藥性較為嚴(yán)重的則是AMX(100.0%)、CFQ(68.8%)和CEF(56.3%)。

表2 寵物貓?jiān)创竽c桿菌和腸球菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

寵物貓?jiān)茨c球菌除對(duì)CEF和AZM的耐藥性較高以外，對(duì)其他類抗生素的敏感性均較強(qiáng)，14株腸球菌全部對(duì)CEF耐藥(100.0%)，對(duì)AZM的耐藥率達(dá)到50.0%；而對(duì)腸球菌比較敏感的藥物依次是TGC、OFX、FFC、DOX、AMX、TYL和ENR，敏感率依次是100.0%、92.9%、85.7%、78.6%、78.6%、71.4%和71.4%。這表明貓?jiān)创竽c桿菌的總體耐藥情況較腸球菌嚴(yán)重。

2.2.2 葡萄球菌和沙門(mén)氏菌藥物敏感性試驗(yàn) 14種藥物對(duì)貓?jiān)雌咸亚蚓蜕抽T(mén)氏菌株的MIC與耐藥判斷結(jié)果如表3所示。葡萄球菌耐藥率較高的藥物依次是DOX(100.0%)、CEQ(87.5%)、CEF(75.0%)和TYL(62.5%)，而8株葡萄菌對(duì)AMX、FFC、OFX這3種藥物全部敏感。此外，葡萄球菌對(duì)TGC、ENR、AZM和TIL的耐藥率較低，敏感率依次為87.5%、87.5%、62.5%和62.5%。4株沙門(mén)氏菌的耐藥現(xiàn)象也較為普遍，對(duì)AMX、DOX和GEN這3種藥物全部耐藥(4/4)，對(duì)FFC的耐藥率也較高(3/4)；4株菌中有2株對(duì)CEQ、TGC、AZM和ENR耐藥；4株沙門(mén)氏菌對(duì)OFX和COL全部敏感。而對(duì)于寵物貓?jiān)瓷抽T(mén)氏菌而言，GEN主要用于檢測(cè)高水平耐藥，不用于臨床抗菌活性評(píng)價(jià)[14]，4株貓?jiān)瓷抽T(mén)氏菌中有3株GEN的MIC≥64，1株GEN的MIC≥32，4株均表現(xiàn)出對(duì)氨基糖苷類抗生素的高水平耐藥(MIC>32)。

表3 寵物貓?jiān)雌咸亚蚓蜕抽T(mén)氏菌MIC及藥物敏感性結(jié)果

2.3 寵物貓?jiān)床≡喾N及多重耐藥結(jié)果分析

本研究中藥物分為7類14種，包括6類12種抗生素及氟喹諾酮類2種抗菌藥物。寵物貓?jiān)床≡亩喾N耐藥分布情況見(jiàn)圖2。42株寵物貓?jiān)床≡曛校?00%(42/42)的菌株出現(xiàn)對(duì)抗菌藥物的耐藥性，最少是1耐，最多是11耐。33株耐4種及以上藥物，占寵物貓?jiān)床≡昕倲?shù)的78.6%(33/42)，其余9株分別耐1類或2類抗菌藥中的1～3種藥物。92.9%的病原菌株出現(xiàn)耐2種及其以上藥物種類，其中6耐的菌株數(shù)最多(9株)，占多重耐藥菌株總數(shù)的47.4%(9/19)；5耐的菌株數(shù)僅次之(8株)，占多重耐藥菌株總數(shù)的42.1%(8/19);7耐、8耐的菌株數(shù)分別有3株、4株，占多重耐藥菌株總數(shù)的15.8%(3/19)和21.1%(4/19);4耐的菌株數(shù)為7株，占多重耐藥菌株總數(shù)的36.8%(7/19)；9耐和11耐的菌株數(shù)分別為1株，合計(jì)占多重耐藥菌株總數(shù)的10.5%(2/19)。這種耐藥情況比較嚴(yán)重，較為少見(jiàn)。

圖2 寵物貓?jiān)床≡鷮?duì)14種抗菌藥物的多種耐藥分布

寵物貓?jiān)床≡亩嘀啬退幏植记闆r見(jiàn)圖3。針對(duì)7類抗菌藥物，多重耐藥菌株(耐3類及以上藥物)共19株，占寵物貓?jiān)床≡昕倲?shù)的45.2%(19/42)；耐3類有6株，耐4類有9株，耐5類有3株，耐6類有1株，沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)7類藥物全部耐藥的菌株。在多重耐藥菌株中比例最高的是4重耐藥(47.4%，9/19)，同時(shí)有1株沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出6重耐藥，即對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及氟喹諾酮類藥物同時(shí)出現(xiàn)耐藥，僅對(duì)黏菌素敏感，值得重點(diǎn)關(guān)注和深入研究。

圖3 寵物貓?jiān)床≡鷮?duì)7類抗菌藥物的多重耐藥分布

3 結(jié)論和討論

本研究結(jié)果表明，鄭州市寵物貓?jiān)创竽c桿菌和沙門(mén)氏菌的多重耐藥情況較為普遍。其中，鄭州市寵物貓?jiān)创竽c桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類3種抗生素耐藥較為嚴(yán)重，這與吳立婷[3]和趙雪洋等[19]研究相近，推測(cè)是Ⅲ代頭孢菌素在寵物臨床治療時(shí)應(yīng)用較為廣泛所致。此外，鄭州市寵物貓?jiān)创竽c桿菌對(duì)頭孢菌素CEF和CFQ的耐藥率明顯高于趙雪洋等[19]和佟盼盼等[20]的報(bào)道，這與不同地區(qū)寵物臨床用藥習(xí)慣不一致有關(guān)。鄭州市寵物貓?jiān)创竽c桿菌對(duì)動(dòng)物專用抗生素第四代頭孢菌素CFQ產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性現(xiàn)象，這值得引起警示，其耐藥機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類抗生素DOX、氟喹諾酮類藥物ENR和OFX的耐藥率明顯低于中國(guó)其他地區(qū)[21-22]，結(jié)合鄭州市寵物醫(yī)院用藥情況，推測(cè)是這2類藥物適用于寵物臨床的藥物制劑較少，限制了其在寵物臨床的應(yīng)用。新型四環(huán)素類抗生素TGC的敏感性最高，屬于鄭州市寵物貓?jiān)床≡状螆?bào)告。抗生素COL因其較強(qiáng)的腎毒性未被批準(zhǔn)在寵物臨床體內(nèi)應(yīng)用，故本研究結(jié)果顯示其對(duì)寵物貓?jiān)创竽c桿菌敏感性亦較高，符合寵物臨床抗感染用藥實(shí)際情況。獸醫(yī)專用抗生素FFC在寵物臨床批準(zhǔn)使用時(shí)間較短，也出現(xiàn)耐藥性，推測(cè)可能由人源和食源多重耐藥菌株的水平傳播所致。這與軒慧勇等[23]研究結(jié)果一致，但與MAALAND等[24]和GMEZ-BELTRN等[25]研究結(jié)果不一致，推測(cè)該現(xiàn)象與地域環(huán)境以及FFC用藥習(xí)慣有關(guān)。寵物貓?jiān)瓷抽T(mén)氏菌的耐藥現(xiàn)象也較為突出，其多重耐藥譜型普遍較寬，僅有的1株7重耐藥菌株是沙門(mén)氏菌，主要針對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類和酰胺醇類等抗生素產(chǎn)生耐藥，且以5耐為主，這與軒慧勇等[23]、黃凱等[26]對(duì)動(dòng)物源沙門(mén)氏菌、犬源沙門(mén)氏菌的多重耐藥報(bào)道一致。但由于本研究中寵物貓?jiān)瓷抽T(mén)氏菌的分離率較低，樣本數(shù)較少，導(dǎo)致其耐藥譜型較為單一和集中。

與革蘭氏陰性菌大腸桿菌和沙門(mén)氏菌相比，鄭州市寵物貓?jiān)茨c球菌多重耐藥情況較輕，除對(duì)抗生素CEF和AZM耐藥率較高外，對(duì)其他類抗生素的敏感性均較強(qiáng)，這與潘嘉臻[5]和宋超慧等[8]報(bào)道一致。目前，腸球菌已是人醫(yī)和獸醫(yī)臨床感染率較高的細(xì)菌且臨床治療較為困難，故加強(qiáng)對(duì)其耐藥性監(jiān)控及多重耐藥表型分析，對(duì)有效預(yù)防與控制腸球菌耐藥機(jī)制的水平或垂直傳播具有重要參考價(jià)值。本研究中僅有1株葡萄球菌對(duì)抗生素AMX、FFC和OFX敏感，對(duì)其他抗生素均呈現(xiàn)耐藥，對(duì)新型抗生素TGC也表現(xiàn)為耐藥，而宿主寵物貓并未進(jìn)行過(guò)此類抗生素的治療，其耐藥機(jī)制值得深入研究和重點(diǎn)關(guān)注。葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類獸醫(yī)專用抗生素CEF和CFQ具有較高耐藥性，對(duì)氨基糖苷類、酰胺醇類和氟喹諾酮類等抗生素亦有不同程度的耐藥水平，這與國(guó)內(nèi)外寵物源葡萄球菌多重耐藥性報(bào)道一致[25, 27]，也符合獸醫(yī)臨床實(shí)際用藥情況。葡萄球菌作為寵物貓臨床常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)致病菌株，其多重耐藥性需引起獸醫(yī)臨床的高度重視和關(guān)注。

本研究表明，鄭州市寵物貓?jiān)床≡亩嘀啬退幀F(xiàn)象非常普遍，且存在高水平耐藥情況，推測(cè)其與寵物臨床抗生素或抗菌藥的不規(guī)范和超劑量使用有關(guān)，同時(shí)也可能由人與食品、環(huán)境等公共衛(wèi)生鏈的耐藥機(jī)制橫向傳播所致，故多重耐藥機(jī)制及耐藥基因種類值得進(jìn)一步深入研究。