水稻早衰突變體els-t的表型鑒定與基因克隆*

馮 巍, 周國強(qiáng), 陳浩天, 馬伯軍, 陳析豐

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

衰老是細(xì)胞死亡和分解、組織和器官的退化、生命功能的老化等一系列退化過程，它受到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的嚴(yán)格控制.葉片衰老的起始不僅受到溫度、光照、干旱、營養(yǎng)缺乏、損傷、病原體感染等外部環(huán)境的影響，還受到發(fā)育階段、植物激素水平等內(nèi)部遺傳因素的影響[1-5].當(dāng)葉片受到來自環(huán)境或內(nèi)部本身的壓力后，為了維持生命的進(jìn)程，就會通過信號起始衰老基因的表達(dá)，進(jìn)而使得葉片衰老死亡.葉片衰老涉及一系列的細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)變化，主要包括：細(xì)胞膜通透性的改變、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的降解、光合作用能力降低、葉綠體變性導(dǎo)致的葉綠素含量降低、丙二醛含量升高、活性氧、H2O2含量增加等[6-7].水稻作為單子葉植物，其營養(yǎng)的積累主要在于葉片中葉肉細(xì)胞的光合作用，但水稻葉片過早的衰老往往會減少光合作用時(shí)間、降低養(yǎng)分再轉(zhuǎn)化效率和收獲指數(shù)，進(jìn)而影響水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量[8-10].相反，延遲葉片衰老對水稻生產(chǎn)力有潛在的積極影響，據(jù)理論推算,水稻葉片衰老每推遲1 d可增產(chǎn)2%，實(shí)踐證明也可達(dá)到1%左右.因此，克隆葉片衰老的調(diào)控基因，解析其分子機(jī)制對提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義.

目前，許多水稻葉片衰老相關(guān)基因已經(jīng)被鑒定出來.這些基因可以根據(jù)代謝途徑分為不同的類別：1)合成葉綠體并降解葉綠素的相關(guān)基因，包括NYC1，NOL，OsPAO，OsRCCR1，OsSGR，V1，V2等[11-14]；2)涉及GnT1，OsSAG12，Osh69，TDC1，TDC2 等蛋白的合成、降解和轉(zhuǎn)運(yùn)[15-19]；3)與激素信號通路有關(guān)，如OsFBK12，OsSAMS1，EIN2和EIN3等[20-22]參與了乙烯信號通路；4)與細(xì)胞程序性死亡(PCD)相關(guān)的基因，如RLS1，OsCATC，SPL28等[23-25].雖然，水稻葉片衰老相關(guān)的基因研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但葉片衰老是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，具體的分子機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步研究.本研究從水稻誘變庫中獲得了一個(gè)早衰突變體els-t(earlyleafsenescence-temporary)，并對該突變體進(jìn)行了表型鑒定、遺傳分析與基因精細(xì)定位，通過PCR測序分析確定了候選基因，為進(jìn)一步研究水稻早衰的分子機(jī)理提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻早衰els-t突變體是秈稻品種鎮(zhèn)恢084經(jīng)60Co-γ輻射誘變而來，經(jīng)多代自交，其突變表型遺傳穩(wěn)定.以els-t突變體為母本，分別與野生型對照鎮(zhèn)恢084、日本晴雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代群體.水稻材料均種植于浙江省金華市的大田中，4月中旬播種，10月份收獲.

1.2 凈光合速率測定

在水稻分蘗期的晴天上午，隨機(jī)選取突變體els-t及其野生型對照鎮(zhèn)恢084各3株，對其正常葉片采用LI-6800型便攜式光合作用測定儀測定凈光合速率，繪制光合曲線，每株重復(fù)測定3次，取其平均值作圖.

1.3 葉綠素降解實(shí)驗(yàn)

在水稻分蘗期，選取els-t突變體及其野生型對照鎮(zhèn)恢084的正常葉片，放置到裝有20 mL純凈水的培養(yǎng)皿中，避光28 ℃分別處理0，3,5 d后，將葉片組織剪碎，按照Porra方法[26]測定葉綠素a和葉綠素b含量，每個(gè)材料重復(fù)測定3次，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析突變體與野生型之間的顯著性差異.

1.4 水稻農(nóng)藝性狀調(diào)查

根據(jù)劉建豐等[27]方法，在水稻抽穗時(shí)取els-t突變體與野生型對照鎮(zhèn)恢084各15株，測定每株水稻的株高、分蘗數(shù)、劍葉長、劍葉寬；待水稻成熟后，取els-t突變體與野生型對照鎮(zhèn)恢084各15株，考察穗長、結(jié)實(shí)率、粒長、粒寬、千粒質(zhì)量.采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析.使用GraphPad Prism 7軟件繪制箱形圖.

1.5 目的基因的連鎖分析與精細(xì)定位

取水稻日本晴、els-t突變體及其雜交F2群體中15個(gè)野生型單株和15個(gè)早衰型單株，采用Murray 等[28]方法分別提取葉片的基因組DNA，并將所有的野生型F2單株或早衰型F2單株DNA等量混合，構(gòu)建野生型DNA混池和早衰型DNA混池.采用覆蓋水稻基因組的SSR和InDel標(biāo)記[29-30]對日本晴與els-t突變體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸2 min；4 ℃保存.

用親本間具多態(tài)性的SSR標(biāo)記對野生型DNA混池和突變型DNA混池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在2個(gè)混池間篩選具多態(tài)性的標(biāo)記，即目的基因連鎖的標(biāo)記，對目的基因進(jìn)行初步定位.然后，用連鎖分子標(biāo)記對F2群體中的所有早衰型單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)新的InDel標(biāo)記(見表1)，對目的基因進(jìn)行精細(xì)定位.

表1 InDel標(biāo)記的PCR引物序列

1.6 候選基因的擴(kuò)增與測序

根據(jù)水稻日本晴基因組的注釋(http://rapdb.dna.affrc.go.jp)，對定位區(qū)間內(nèi)的候選基因設(shè)計(jì)PCR引物(見表2)，使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase試劑盒(TaKaRa公司，日本)對野生型對照鎮(zhèn)恢084和els-t突變體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃復(fù)性 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，寄送生物技術(shù)公司進(jìn)行測序.

表2 Os03g0265100基因的PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻els-t突變體表現(xiàn)為葉片早衰及生長發(fā)育受影響

水稻els-t突變體從分蘗期開始出現(xiàn)早衰表型，葉尖首先黃化，隨后整個(gè)葉片逐漸枯黃，而對照葉片還未出現(xiàn)任何衰老的跡象(見圖1a).進(jìn)一步對els-t突變體正常葉片的光響應(yīng)曲線進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)els-t突變體的暗呼吸速率(光照強(qiáng)度為0 時(shí))與同時(shí)期的對照葉片相近；但是，隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，els-t突變體達(dá)到光補(bǔ)償點(diǎn)和光飽和點(diǎn)都比對照延遲了，而且els-t突變體的凈光合速率也比對照顯著性下降(見圖1b).以上結(jié)果表明，els-t突變體對光的響應(yīng)能力及其光合作用效率均低于對照.同時(shí)，將els-t突變體的正常葉片與同時(shí)期的對照葉片進(jìn)行黑暗處理，并測定了其葉綠素含量的變化，結(jié)果顯示，處理前二者的葉色與綠色含量沒有差異，而經(jīng)過黑暗處理后，els-t突變體的葉片明顯比對照更黃(見圖1c)，其葉片的葉綠素含量也比對照下降得更快(見圖1d).這表明在黑暗條件下，els-t突變體葉片中葉綠素的降解速率比對照更快.對els-t突變體的農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量和單株產(chǎn)量等產(chǎn)量相關(guān)的重要性狀均比對照顯著性下降(見圖2).

a：分蘗期的植株表型；b：分蘗期葉片的光響應(yīng)曲線；c：暗處理后葉片的表型；d：暗處理后葉片的葉綠素含量變化對照：野生型對照鎮(zhèn)恢084；els-t：els-t突變體.“**”表示對照與els-t之間存在顯著性差異(P<0.01)

箱形圖顯示中間值(線)和異常值(黑點(diǎn)).“**”表示野生型對照鎮(zhèn)恢084與突變體之間存在顯著性差異(P<0.01)

2.2 水稻els-t突變體的早衰表型受單隱性核基因控制

以els-t突變體為母本與野生型鎮(zhèn)恢084(秈稻)雜交，F(xiàn)1代自交獲得F2代群體.F1代植株為野生型，F(xiàn)2代群體(3 835單株)出現(xiàn)了表型分離，其中野生型2 918株，早衰突變型917株，經(jīng)χ2檢驗(yàn)該群體的野生型與突變型的分離符合3∶1(見表3).同時(shí)，以els-t突變體為母本與野生型日本晴(秈稻)雜交，其F1代植株也為野生型，自交F2代群體的野生型與早衰突變型的分離比也符合3∶1(見表3).這些結(jié)果表明，els-t突變體的早衰表型由單隱性核基因控制.

表3 水稻els-t 突變體與野生型雜交F2代群體的表型及分離比

2.3 水稻els-t 基因被精細(xì)定位于3號染色體的48 kb區(qū)間

利用els-t突變體與日本晴雜交構(gòu)建的F2代群體，用覆蓋水稻基因組、在兩個(gè)親本間具有多態(tài)性的92個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行了連鎖分析，結(jié)果見圖3，圖中“n”表示用于分析的F2突變單株數(shù)目，分子標(biāo)記下對應(yīng)的數(shù)字表示該標(biāo)記與目的基因間發(fā)生染色體交換的單株個(gè)數(shù).首先將目的基因確定在水稻3號染色體上，并利用100個(gè)F2突變單株將els-t基因初步定位在標(biāo)記RM14635和RM14766之間，物理距離為3.0 Mb(見圖3a).隨后，在這兩個(gè)標(biāo)記之間篩選出了6個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)記，通過擴(kuò)大F2突變單株數(shù)目至1 585株，進(jìn)一步將目的基因精細(xì)定位在InDel3與InDel4兩個(gè)標(biāo)記之間，物理距離為48 kb(見圖3b).

a：els-t基因初定位的遺傳圖譜；b：els-t基因精細(xì)定位的遺傳圖譜；c：els-t基因結(jié)構(gòu)及其突變位點(diǎn)；d：日本晴與els-t突變體雜交F2代植株的突變位點(diǎn)測序結(jié)果

2.4 水稻els-t 為早衰調(diào)控基因PLS2的一個(gè)新等位突變

根據(jù)水稻日本晴基因組的注釋，在48 kb的基因定位區(qū)內(nèi)含有9個(gè)基因.通過PCR對這些基因的測序分析，與野生型鎮(zhèn)恢084的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)基因Os03g0265100的第5個(gè)外顯子中發(fā)生1個(gè)堿基A缺失(見圖3c).為了進(jìn)一步證明該堿基的缺失導(dǎo)致了els-t突變體出現(xiàn)早衰表型，從F2代群體中隨機(jī)選取20個(gè)野生型和20個(gè)早衰突變型單株，對該突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型單株的基因型為無突變(野生型)、或單染色體突變(野生型/A缺失)，而早衰突變型單株則全部為純合突變(A缺失)，代表性的測序結(jié)果如圖3d所示.在圖3d中，左側(cè)表示植株表型，右側(cè)表示Os03g0265100的基因型，野生型表示無突變，野生型/A缺失表示單染色發(fā)生堿基A缺失，A缺失表示雙染色體發(fā)生堿基A缺失的純合突變.基因Os03g0265100是一個(gè)曾被報(bào)道參與水稻早衰調(diào)控的基因PLS2(prematureleafsenescence2)，els-t是其新的等位突變[31].

3 討 論

葉片衰老是植物生長發(fā)育的必然進(jìn)程，也是植物對環(huán)境的一種適應(yīng)性.然而，葉片過早的衰老會降低光合作用的效率進(jìn)而影響作物的生物量合成[32].目前，水稻中已經(jīng)鑒定的葉片早衰突變體有很多，其中esl3，esl6和es5等突變體在苗期出現(xiàn)葉片早衰表型[33-35]，esl9，mps1和g398等突變體在分蘗期出現(xiàn)葉片早衰表型[35-37]，es-h等突變體在抽穗后葉片出現(xiàn)早衰表型[38].雖然，這些水稻早衰突變體衰老發(fā)生的時(shí)期不同，但在其葉片衰老過程中，葉片的葉綠素含量都會顯著下降，并且主要農(nóng)藝性狀每穗粒數(shù)和單株產(chǎn)量等都顯著降低.水稻els-t突變體也具有相似的表型，在分蘗期時(shí)開始出現(xiàn)葉片衰老，其光合作用的效率也顯著低于野生型對照.由于水稻營養(yǎng)物質(zhì)的積累主要來源于葉片的光合作用，因此其與產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀也顯著性下降.

通過對els-t突變基因的精細(xì)定位和候選基因的PCR測序研究發(fā)現(xiàn)，els-t是曾被報(bào)道參與水稻早衰調(diào)控的基因PLS2[31]的一個(gè)新的等位突變，其第5個(gè)外顯子的第61位A堿基缺失，造成移碼突變.而曾被報(bào)道的pls2突變體，其第9個(gè)外顯子上第41位的C堿基被替換為T堿基，導(dǎo)致精氨酸被半胱氨酸所替換引發(fā)早衰表型，株高、每穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量和單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀也顯著降低[31].移碼突變往往導(dǎo)致基因的功能缺失，往往比堿基替換引發(fā)的效應(yīng)更加嚴(yán)重.盡管els-t突變體的多項(xiàng)農(nóng)藝性狀發(fā)生下降，但是其株高卻沒有顯著變化，這點(diǎn)與株高明顯下降的pls2突變體不同.這可能是因?yàn)榛蛉笔е粫?dǎo)致PLS2蛋白質(zhì)失去原有的功能，而堿基替換導(dǎo)致的精氨酸到半胱氨酸的替換可能影響了PLS2蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，使得PLS2蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變，抑制了水稻的正常生長.這種通過堿基替換導(dǎo)致功能發(fā)生改變的突變形式可以為蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與其功能之間關(guān)系的研究提供了新的思路.

PLS2基因編碼一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，它在參與生物合成、保持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)態(tài)，調(diào)控信號分子和防御化合物的活性中起著重要的作用.依賴UDP的糖基轉(zhuǎn)移酶可以催化糖從活性糖供體轉(zhuǎn)移到小分子受體上，進(jìn)而形成糖苷鍵.已有的研究表明，糖基轉(zhuǎn)移酶在植株抗性及植株衰老等過程中發(fā)揮著一定的作用.在擬南芥中，過表達(dá)豌豆的PsUGT1基因會導(dǎo)致植株葉片衰老加快[39]，而沉默AtUGT85A7的擬南芥葉片衰老速度會延遲[39].然而糖基轉(zhuǎn)移酶在水稻葉片衰老中是如何發(fā)揮作用的尚不明確，以上研究結(jié)果為糖代謝異常導(dǎo)致葉片衰老提供了一個(gè)新的遺傳材料.