基于MP-KG凝膠體系研究微觀結(jié)構(gòu)影響質(zhì)構(gòu)特性的調(diào)控機制

袁華根，施 帥，奚照壽，潘雪峰，陳 霞，陳銀基,*

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；3.南京市高淳區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 南京 211300）

利用膳食纖維替代脂肪開發(fā)健康低脂香腸是當(dāng)前加工肉制品行業(yè)的研究熱點。從營養(yǎng)角度，膳食纖維被譽為“第七大營養(yǎng)素”，能夠改善腸道益生菌群和降低心血管疾病的發(fā)生幾率。世界衛(wèi)生組織建議膳食纖維每日攝入量應(yīng)該達(dá)到25 g。然而相關(guān)實驗結(jié)果顯示：不同類型的膳食纖維作為脂肪替代物對低脂香腸的感官質(zhì)構(gòu)影響差異顯著，例如：抗性淀粉和卡拉膠等既能夠降低低脂香腸蒸煮損失，而且改善質(zhì)構(gòu)特性（硬度和咀嚼性）；微晶纖維素等能夠顯著降低低脂香腸蒸煮損失，但是對質(zhì)構(gòu)影響差異不顯著；羧甲基纖維素和黃原膠等對低脂香腸質(zhì)構(gòu)甚至有負(fù)面作用。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)膳食纖維在香腸中的運用存在添加量極限。例如：卡拉膠改善火雞香腸感官質(zhì)構(gòu)的添加量極限為0.8%；甘蔗不溶膳食纖維改善豬肉低脂香腸感官質(zhì)構(gòu)的添加量極限為2.0%。目前，膳食纖維影響蛋白凝膠類產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性的作用機制還鮮有文章報道。

魔芋膠提取于魔芋草本植物的根部，其主要成分是魔芋葡甘聚糖。魔芋葡甘聚糖是一種非離子型水溶性高分子多糖，由-葡萄糖和-甘露糖聚合而成。魔芋膠作為一種膳食纖維，具有零卡路里、螯合膽固醇和促進(jìn)腸道蠕動功能作用。因此，本實驗以肌原纖維蛋白-魔芋膠（myofibrillar protein-konjac glucomannan，MP-KG）為模擬體系，通過微觀結(jié)構(gòu)（石蠟切片和掃描電鏡）、圖像分析軟件技術(shù)（分維分析和缺項分析）和質(zhì)構(gòu)特性，進(jìn)而闡釋微觀結(jié)構(gòu)對蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的調(diào)控機制，為KG在低脂肉制品中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后腿肉購于蘇果超市；KG 上海北聯(lián)生物科技有限公司；過氧化氫、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙二醇-雙-2-氨基乙醚四乙酸（ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid，EGTA）、碳酸一氫鈉、碳酸二氫鈉、氯化鎂、戊二醛 西格瑪試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MM-12絞肉機 中國豐偉機械有限公司；切片機德國徠卡公司；T25DS25I KA均質(zhì)機、磁力攪拌器德國IKA公司；Avanti JXN-30離心機 美國Beckman公司；TW20水浴鍋 德國Julabo公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀英國Stable Micro Systems公司；PQ001低場核磁共振儀蘇州紐邁公司；S-3000N掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取和復(fù)合體系的制備

剔除豬后腿肉中結(jié)締組織和脂肪并絞肉機絞碎（0.6 mm孔板），用雙層真空包裝袋（聚乙烯）進(jìn)行分裝，每袋500 g，貯存于－20 ℃。提取前取出豬后腿肉并放置于0～4 ℃冷庫中解凍至中心溫度為0 ℃。

MP提取方法參照Han Minyi等，并稍作改動。具體操作步驟如下：將50 g斬拌后的肉糜和4 倍體積的磷酸緩沖溶液（10 mmol/L NaHPO/NaHPO、0.1 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl、1 mmol/L EGTA、pH 7.0，4 ℃）混合均質(zhì)（6 000×，30 s）。將均質(zhì)后混合溶液用雙層紗布進(jìn)行過濾后離心（3 000×，15 min）取沉淀，重復(fù)上述過程兩遍，最終沉淀物即為純MP。雙縮脲方法測定純MP濃度。將甘蔗膳食纖維進(jìn)行超微粉碎，過100 目篩的標(biāo)記為100 目，剩余通過50 目的標(biāo)記為50 目。將甘蔗不溶性膳食纖維添加到MP中，并將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至50 mg/mL（0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）。不同粒徑（50、100 目）甘蔗膳食纖維添加量為3 個梯度：1.0%、2.0%和3.0%。用攪拌器攪拌混合體系3 min，以確保甘蔗膳食纖維均勻分布。將部分樣品進(jìn)行蒸煮（80 ℃、20 min）并冷卻至室溫4 ℃，另一部分樣品用于流變測定。

1.3.2 水分分布

參照Bertram等方法，并稍作改動。將樣品加入直徑為1 cm的石英玻璃管中并避免氣泡的產(chǎn)生，進(jìn)而水?。?0 ℃）加熱凝膠并冷卻至室溫。使用PQ001低場核磁共振儀對樣品進(jìn)行測定，質(zhì)子共振頻率為22.3 MHz，樣品測試溫度為32 ℃，采用的測試算法為CPMG序列（carrpurcell-meiboom-gill sequence）。測試具體參數(shù)如下：90°脈沖和180°脈沖時間間隔為250 μs；回波次數(shù)12 000。利用3 組分算法分析并生成弛豫時間圖；3 個不同水分組分的弛豫初始時間、峰值時間和結(jié)束時間以及3 個不同水分組分對應(yīng)的峰面積和占比比例。為方便描述，弛豫圖每個組分的峰值時間作為弛豫時間，以表示，而每個組分峰面積所占總積分面積的百分比，以表示。

1.3.3 復(fù)合凝膠的形變特性

參照Czerner等方法并稍作改動。使用質(zhì)構(gòu)儀測定樣品（直徑2 cm、高度2 cm）的復(fù)合凝膠斷裂時的形變特性，具體參數(shù)如下：下降速率2.0 mm/s、測試速率1.0 mm/s，質(zhì)構(gòu)探頭為P50型號，壓縮比90%。其中的復(fù)合凝膠斷裂形變時的應(yīng)變計算公式如下：

式中：為樣品初始高度；為樣品發(fā)生斷裂形變時的壓縮高度。

復(fù)合凝膠斷裂形變時的應(yīng)力計算按照下式計算：

式中：為壓縮過程中所測得的力；為樣品接觸探頭的表面積。

1.3.4 石蠟切片

將凝膠樣品切割成1 cm×1 cm×2 cm的長方體，并用4%的多聚甲醛進(jìn)行結(jié)構(gòu)固定。將樣品從固定液取出后，進(jìn)行切片和染色后，用正置明場顯微鏡放大1 000 倍觀察切片的微觀結(jié)構(gòu)。每個樣品取5 個不同的觀察視野。

1.3.5 掃描電鏡和圖像處理

掃描電鏡及其圖像處理的方法參照Han Minyi等，并稍作改動。將凝膠樣品切割成側(cè)面1 cm的長方體，并用2.5%的戊二醛磷酸緩沖溶液進(jìn)行結(jié)構(gòu)固定。固定后用磷酸緩沖溶液對樣品進(jìn)行多次漂洗后，用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對樣品脫水。脫水干燥后的樣品粘于金屬臺上進(jìn)行噴金鍍膜。最后將樣品置于S-3000N掃描電鏡中進(jìn)行放大2 000 倍觀察。每個樣品分別觀察5 個視野。將掃描電鏡圖像導(dǎo)入ImageJ v1.47后，利用其Fraclac 2.5 v插件對其進(jìn)行處理分析。首先，在圖像的像素調(diào)整到640×432后，對其進(jìn)行二維化處理。分維分析反映不規(guī)則復(fù)雜結(jié)構(gòu)占有空間的有效性。盒計數(shù)法為在圖像上定義幾個尺寸縮小的網(wǎng)格，并計算每個網(wǎng)格中包含蛋白三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的像素數(shù)量。分維維度按下式計算：

式中：為凝膠蛋白三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的分維維度；N為不同尺寸網(wǎng)格中所包含的像素數(shù)量；為網(wǎng)格的尺寸。

缺項分析是反映凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中水孔隙的均勻程度。缺項分析定義為在圖像中定義個數(shù)量相同大小的網(wǎng)格，計算這些網(wǎng)格中代表水相形成水孔隙的目標(biāo)像素的變異系數(shù)。缺項分析基于下式計算：

式中：為目標(biāo)像素的缺項；為所有大小網(wǎng)格內(nèi)目標(biāo)像素數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)差；為所有大小網(wǎng)格內(nèi)目標(biāo)像素數(shù)量的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實驗設(shè)計采用完全隨機區(qū)組的方法，所有處理重復(fù)3 次。所有的數(shù)據(jù)用SAS 9.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，添加KG處理組采用方差分析，比較方法采用Duncan多重比較分析，＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP-KG凝膠的形變特性

通過質(zhì)構(gòu)儀測定MP-KG凝膠破碎瞬間的參數(shù)，并利用公式計算得到復(fù)合凝膠斷裂形變時應(yīng)力應(yīng)變。如圖1所示，KG添加量對復(fù)合凝膠斷裂形變時應(yīng)力應(yīng)變影響顯著。隨著KG添加量提高，復(fù)合凝膠的斷裂形變時應(yīng)力變化呈現(xiàn)拋物線形，這說明KG對復(fù)合凝膠的應(yīng)力改善具有添加量極限。復(fù)合凝膠斷裂形變時應(yīng)變的變化趨勢和應(yīng)力相似，但是兩者的添加量極限不同。圖1顯示添加1%的KG組斷裂形變時的應(yīng)力最大為13.73 kPa，添加0.5%的KG組斷裂形變時的應(yīng)變最大為1.02。當(dāng)KG添加量達(dá)到2%時，復(fù)合凝膠的斷裂形變時的應(yīng)力應(yīng)變最低，分別為16.31 kPa和0.68。這說明當(dāng)KG超過添加量極限后會顯著降低復(fù)合凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，甚至要低于對照組。

圖1 KG添加量對復(fù)合凝膠斷裂形變時應(yīng)力應(yīng)變的影響Fig. 1 Effect of KG concentration on fracture stress and fracture strain of composite gels

2.2 低場核磁共振

在MP凝膠體系中水分子存在3 種分布狀態(tài)：1）結(jié)合水，能和MP分子緊密結(jié)合在一起，弛豫時間（）分布在1～10 ms；2）不易流動水，被束縛于MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的間隙中，弛豫時間（）分布在200～400 ms；3）自由水，其不被凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)所束縛并自由流動，弛豫時間（）分布在1 000～2 000 ms。在肌原纖維凝膠體系中，水分子的分布狀態(tài)能夠直接反映MP凝膠結(jié)構(gòu)體系，尤其是不易流動水，其弛豫時間越短說明肌原纖維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，是因為凝膠結(jié)構(gòu)對水分子的束縛能力越強。因此，測定不易流動水的弛豫時間能夠直接反映KG對MP交聯(lián)程度的影響。如表1所示，添加不同比例KG對復(fù)合凝膠中3 種分布狀態(tài)的水分子弛豫時間和相對百分比。結(jié)果顯示：隨著KG添加量的增加，不易流動水的弛豫時間呈現(xiàn)勾狀變化趨勢，在添加1.0%時不易流動水的弛豫時間最低且其相對百分比最高，分別為274 ms和92.79%。這說明KG能夠有效的促進(jìn)形成致密的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提高對水分子的束縛。當(dāng)添加量增加到2%時，處理組的弛豫時間最高且相對百分比最低，分別為343.51 ms和77.51%。這說明當(dāng)KG超過添加量極限后會抑制MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚集。此外，KG添加量的變化對結(jié)合水的影響不顯著，說明結(jié)合水的變化只與MP比例相關(guān)。KG添加量顯著影響自由水的百分比，在添加1.0% KG時自由水的百分比最低，這說明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠束縛足夠多的不易流動水，進(jìn)而降低了自由水的比例。

表1 KG對MP凝膠中水分弛豫時間和百分比的影響Table 1 Effect of KG concentration on relaxation times and percentage peak areas of water in composite gels

2.3 相限行為

如圖2所示，石蠟切片能夠清晰顯示不同添加量的KG在肌原纖維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的相限行為，其中紅色部分是MP，白色部分是水相，灰色陰影部分是KG。對照組顯示MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)，其為多孔的不規(guī)則的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。未添加KG時，對照組的MP三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)間隙中均勻的分布著形狀大小各異的白色水空穴。當(dāng)添加少量KG時，KG以分散相的形式被包裹在MP凝膠網(wǎng)絡(luò)體系中。KG的形狀大小顯著大于對照組中的水空穴，因此復(fù)合凝膠的微觀結(jié)構(gòu)不再均勻。當(dāng)KG添加量超過1%時，KG不再鑲嵌在MP網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。KG自身可以通過氫鍵作用發(fā)生水合形成弱凝膠結(jié)構(gòu)，進(jìn)而與MP凝膠結(jié)構(gòu)相互滲透交叉，形成雙連續(xù)相。本實驗顯示KG在MP凝膠網(wǎng)絡(luò)體系中的相限行為隨著添加量而變化：KG添加量低于1%時，碳水化合物以分散相的形式被包裹在MP凝膠網(wǎng)絡(luò)體系中；KG添加量高于1%時，碳水化合物和MP均形成連續(xù)相，且兩者相互滲透交叉。

圖2 不同添加量的KG在蛋白凝膠中的空間分布Fig. 2 Spatial distribution of konjac glucomannan at various concentrations in composite gels

2.4 掃描電鏡結(jié)果

如圖3所示，掃描電鏡能夠清晰顯示不同添加量的KG對肌原纖維蛋熱誘導(dǎo)交聯(lián)程度的影響，其中白色部分為MP骨架結(jié)構(gòu)。觀察結(jié)果顯示添加不同比例KG對MP三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)影響顯著。觀察對照組發(fā)現(xiàn)MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈粗絲狀甚至部分區(qū)域呈現(xiàn)團狀結(jié)構(gòu)，說明在加熱過程中MP折疊結(jié)構(gòu)并沒有充分展開，大量疏水基團依然包埋在分子內(nèi)部，進(jìn)而在后續(xù)加熱過程中沒有大量疏水基團進(jìn)行彼此交聯(lián)形成致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。此外，在MP三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)間隙中存在大量黑色空穴，這些黑色空穴相互交聯(lián)進(jìn)而形成水溝壑，將MP三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)分割成片狀化。

當(dāng)KG添加量小于1.0%時，觀察處理組掃描電鏡發(fā)現(xiàn)MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈細(xì)絲狀且交聯(lián)致密，沒有粗絲和團狀蛋白存在。和對照組相比MP三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)間隙中黑色空穴數(shù)量和大小顯著降低。這說明在常溫下KG通過氫鍵與水合作用將水分子束縛在KG分子結(jié)構(gòu)中，降低了水溝壑的形成以及其對MP三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)的分割。但是當(dāng)KG添加量超過1.0%時，觀察處理組掃描電鏡發(fā)現(xiàn)MP的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)沒有細(xì)絲的出現(xiàn)，整個結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)粗絲狀且相當(dāng)疏松。此外，和對照組相比MP三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)間隙中黑色溝壑?jǐn)?shù)量和大小顯著增加，并與MP網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互交叉貫穿。這說明添加高濃度的KG時，KG會和MP溶液中的水分形成連續(xù)的水凝膠，KG水凝膠和MP兩者互不相溶并形成相互穿插，這使得MP被分割成碎片化。

圖3 不同添加量的KG對MP微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 3 Effect of KG concentration on scanning electron micrographs of composite gels

為進(jìn)一步客觀比較KG添加量對MP網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響，本實驗使用圖像處理軟件對MP網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（白色部分）進(jìn)行分維分析和溝壑（黑色部分）進(jìn)行缺項分析（圖4）。分維分析結(jié)構(gòu)的數(shù)值大小和MP網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密度呈正比；缺項分析與溝壑大小和形狀的差異性呈正比。分析結(jié)果顯示處理組（添加1% KG）MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的分維維度1.872顯著高于其他KG組（＜0.05），而缺項值0.279顯著小于其他添加KG組（＜0.05）。處理組（添加2% KG）MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的分維維度1.789顯著低于其他KG組（＜0.05），而缺項值0.345顯著高于其他添加KG組（＜0.05）。

圖4 KG添加量對MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分維維度和缺項值的影響Fig. 4 Effect of KG concentration on fractal dimension and lacunary of composite gels

2.5 MP-KG凝膠體系微觀結(jié)構(gòu)對感官質(zhì)構(gòu)特性的調(diào)控

實驗證明KG作為優(yōu)質(zhì)的脂肪替代物的可行性，并進(jìn)一步研究MP-KG微觀結(jié)構(gòu)對復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)特性的調(diào)控機制。從微觀角度分析，石蠟切片顯示KG和MP屬于熱力不相溶體系，隨著KG添加量提高，兩者的相行為結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)填充結(jié)構(gòu)到互穿結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。當(dāng)復(fù)合凝膠呈現(xiàn)為互穿結(jié)構(gòu)時，KG通過氫鍵和水合作用形成的水凝膠為弱凝膠，其凝膠強度顯著小于MP凝膠強度；KG形成的水凝膠會嚴(yán)重阻礙MP疏水基團的暴露以及后續(xù)加熱過程中的交聯(lián)。因此，在互穿體系中MP不能進(jìn)行充分交聯(lián)，以及KG水凝膠本身是弱凝膠，進(jìn)而導(dǎo)致最終復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)劣變。當(dāng)復(fù)合凝膠呈現(xiàn)為填充結(jié)構(gòu)時，MP為連續(xù)相KG為填充相，通過掃描電鏡顯示填充結(jié)構(gòu)中的MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密且水空穴顯著降低。由于溶液狀態(tài)的MP過熱過程中變性展開后滲出大量水分，形成相互交錯的水溝壑并導(dǎo)致MP三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分割成片狀化。添加KG后，KG的水合能力降低水溝壑的形成，進(jìn)而形成致密整體化的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)。

從復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)角度，當(dāng)添加KG（＜1%）能夠顯著提高復(fù)合凝膠斷裂形變時的應(yīng)力和應(yīng)變，降低不易流動水的弛豫時間，這顯示添加少量KG能夠顯著改善復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)。當(dāng)添加KG（＞1%）時，復(fù)合凝膠斷裂形變時的應(yīng)力和應(yīng)變顯著降低，不易流動水的弛豫時間顯著提高降低，這顯示KG添加量超過1%會導(dǎo)致復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)的劣變。

圖5 MP-KG凝膠體系中微觀結(jié)構(gòu)對感官質(zhì)構(gòu)的調(diào)控機制Fig. 5 Regulatory mechanism of the microstructure of MP-KG composite gels on their textural properties

如圖5所示，KG的水相穩(wěn)定能力能夠減少MP中水溝壑的形成，促進(jìn)致密的整體化MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而提高復(fù)合凝膠斷裂形變時應(yīng)力和應(yīng)變。MP-KG的相行為為互穿結(jié)構(gòu)時，KG通過氫鍵和水合作用形成的水凝膠為弱凝膠，其凝膠強度顯著小于MP凝膠強度；KG形成的水凝膠會嚴(yán)重阻礙MP疏水基團的暴露以及后續(xù)加熱過程中的交聯(lián)，進(jìn)而使得復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)劣變（即斷裂形變時的應(yīng)力和應(yīng)變顯著降低）。

3 結(jié) 論

KG顯著影響MP凝膠的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)，當(dāng)添加量小于0.5%時復(fù)合凝膠的斷裂形變時的應(yīng)力應(yīng)變顯著提高；當(dāng)添加量大于1%時復(fù)合凝膠的斷裂形變時的應(yīng)力應(yīng)變顯著降低。從石蠟切片和掃描電鏡顯示，當(dāng)KG添加量小于1%時，KG均勻分散在蛋白基質(zhì)中呈填充結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定水相減少熱誘導(dǎo)凝膠過程中蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)部水溝壑的形成，間接促進(jìn)MP之間的交聯(lián)，形成致密均一的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并改善復(fù)合凝膠的質(zhì)構(gòu)特性；當(dāng)KG添加量大于1%，KG通過水合作用形成的連續(xù)弱凝膠，與MP形成互穿結(jié)構(gòu)，進(jìn)而嚴(yán)重阻礙MP在后續(xù)加熱過程中的交聯(lián)，進(jìn)而使得復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)劣變。