乳酸乳球菌乳亞種NCU036018細(xì)菌素的分離純化及其抗菌機(jī)制

許曉燕，彭 珍，熊世進(jìn)，肖沐巖，黃 濤，熊 濤

（南昌大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

金黃色葡萄球菌是常見的食源性病原菌之一，其產(chǎn)生的腸毒素等有害物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致食物中毒，主要污染源有乳、乳制品、肉及肉制品等。金黃色葡萄球菌是僅次于沙門氏菌和副溶血弧菌的第三大致病菌，其引起的食物中毒占食源性食物中毒事件的25%左右。近年來，越來越多濫用抗生素的行為導(dǎo)致了病原菌耐藥性（antimicrobial resistance，AMR）的出現(xiàn)，進(jìn)而提高了病原菌給食品和醫(yī)藥行業(yè)所帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)。預(yù)計(jì)到2050年，AMR每年將造成1 000萬 人的死亡。而在食品行業(yè)中常用的防腐劑主要為化學(xué)合成防腐劑，對(duì)人體健康存在一定的安全隱患。因此，綠色天然的細(xì)菌素是最具潛力的化學(xué)防腐劑的安全替代品之一。細(xì)菌素是細(xì)菌核糖體產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的蛋白類或多肽類物質(zhì)。它可以通過特異型靶點(diǎn)和非特異性靶點(diǎn)破壞細(xì)胞膜的完整性和通透性，或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)影響DNA和蛋白質(zhì)的正常代謝等抑制或殺死病原菌，但經(jīng)人體攝入后可被胃腸道蛋白酶消化酶解，不會(huì)破壞腸道菌群的微生態(tài)平衡。

乳酸鏈球菌素是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品法典委員會(huì)在1969年唯一認(rèn)定為安全的菌素，可作為食品添加劑。但乳酸鏈球菌素只能在一定的pH值范圍內(nèi)（pH 3.5～8.0）發(fā)揮作用，并且隨著pH值和溫度的升高，其活性也會(huì)下降。因此，相對(duì)于乳酸鏈球菌素，市場(chǎng)上更需要活力強(qiáng)且使用范圍廣的新型細(xì)菌素有效遏制致病菌的滋生，以推動(dòng)食品防腐劑市場(chǎng)的發(fā)展。目前自然發(fā)酵泡菜已經(jīng)成為分離產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的重要渠道。例如，高兆建等從泡菜中篩選到1 株產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵乳桿菌，其產(chǎn)細(xì)菌素BLF52分子質(zhì)量為5.6 kDa，并且在一定的溫度和pH值范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著抑制作用。此外，Gao Yurong等也從傳統(tǒng)發(fā)酵卷心菜中篩選到1 株格氏乳桿菌，其所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有抑制作用。但目前對(duì)分離自傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中的乳酸乳球菌乳亞種所產(chǎn)細(xì)菌素的研究相對(duì)較少。本研究旨在對(duì)篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中的乳酸乳球菌乳亞種所產(chǎn)細(xì)菌素進(jìn)行分離鑒定，并探究其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制，為食品級(jí)細(xì)菌素在食品行業(yè)和制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指示菌金黃色葡萄球菌（）CMCC26003保藏于南昌大學(xué)國(guó)家食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、-糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶、脂肪酶、淀粉酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（2×）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色試劑盒、低分子質(zhì)量蛋白Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Applied Biosysterms公司；酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技有限公司；DM300B正置熒光顯微鏡 德國(guó)徠卡公司；凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；SP Sepharose Fast Flow手動(dòng)純化預(yù)裝柱 武漢晶誠(chéng)生物科技公司；Optima 8000 ICP-AES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國(guó)珀金埃爾默儀器有限公司；冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

1.3.1.1 樣品采集及乳酸菌分離

從市場(chǎng)上采集不同種類自然發(fā)酵的泡菜樣本22 份。從泡菜樣品中取1 mL泡菜液用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選取10、10、10三個(gè)梯度各100 μL分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基（含溴甲酚紫）上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落進(jìn)行連續(xù)劃線分離。隨后在培養(yǎng)基上挑取產(chǎn)黃色光暈且形態(tài)單一的菌落于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中孵育24 h，將培養(yǎng)液和50%的無菌甘油按1∶1體積比混合并保存于－80 ℃。

1.3.1.2 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的篩選

將活化好的198 株乳酸菌疑似株以2%（/）的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h得到乳酸菌發(fā)酵液。將發(fā)酵液6 500×離心10 min后收集上清液，為了排除發(fā)酵液pH值對(duì)抑菌結(jié)果的影響，調(diào)節(jié)其pH 6.1±0.1并用0.22 μm微孔濾膜過濾，保存至4 ℃待用。

使用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性。簡(jiǎn)言之，將培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌加入LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基中使其濃度為1.0×10CFU/mL，混勻后倒平板，待冷卻凝固后打孔（6 mm），每皿3 個(gè)孔，向每孔中加入200 μL制備好的上述分離菌株的發(fā)酵上清液，37 ℃下培養(yǎng)14～16 h，根據(jù)抑菌圈直徑大小篩選抑菌性能優(yōu)異的菌株。

1.3.1.3 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的16S rDNA鑒定

使用細(xì)菌DNA提取試劑盒對(duì)抑菌性能優(yōu)異的乳酸菌菌株進(jìn)行基因組DNA的提取。以細(xì)菌通用引物27 F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用BLAST工具進(jìn)行同源性比較，將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入MEGA5.2中，采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 抑菌物質(zhì)性質(zhì)的初步探索

參照1.3.1.2節(jié)方法制備復(fù)篩出的抑菌優(yōu)異菌株的發(fā)酵上清液，將上清液分別在不同溫度（60、70、80、90、100 ℃水浴和121 ℃高壓蒸汽）處理30 min；不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10）處理2 h，之后調(diào)回pH 6.1；不同酶（過氧化氫酶、淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、-糜蛋白酶）處理2 h，隨后于100 ℃滅活5 min，酶的最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。以未處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照。采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同處理組的抑菌活性，探究不同處理?xiàng)l件對(duì)乳酸乳球菌乳亞種NCU036018無菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響。

1.3.3 乳酸乳球菌乳亞種NCU036018生長(zhǎng)及抑菌活性曲線

活化后的乳酸乳球菌乳亞種NCU036018按照2%（/）比例接種于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h，每2 h取樣一次，分別測(cè)試發(fā)酵液的OD、pH值、無細(xì)胞發(fā)酵上清液的抑菌活性（瓊脂孔擴(kuò)散法）。觀察乳酸乳球菌乳亞種NCU036018在發(fā)酵過程中生長(zhǎng)曲線、pH值和產(chǎn)細(xì)菌素的關(guān)系，確定細(xì)菌素的最適發(fā)酵時(shí)間。

1.3.4 細(xì)菌素的分離純化

1.3.4.1 硫酸銨沉淀

向制備好的乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液中緩慢添加硫酸銨，使溶液中硫酸銨飽和度分別為20%、40%、50%、60%、70%、80%，低溫磁力攪拌過夜，4 ℃、8 000×離心15 min，棄去上清液，收集沉淀，并復(fù)溶于甲酸銨緩沖鹽溶液（0.01 mol/L、pH 3.5）中，瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性，確定最適的硫酸銨飽和度。

1.3.4.2 超濾

將復(fù)溶后的細(xì)菌素粗提物轉(zhuǎn)移至超濾管中，分別先后通過截留分子質(zhì)量為30、10、3 kDa的超濾管進(jìn)行超濾截留（4 ℃、3 500×、25 min），收集不同的組分，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)不同組分的抑菌活性。

1.3.4.3 SP Sepharose Fast Flow純化

選擇具有抑菌活性的超濾組分采用Sepharose Fast Flow瓊脂糖凝膠柱（1.5 cm×10 cm）進(jìn)行層析。20 mmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液充分平衡后，采用不同濃度的NaCl（0～1 mol/L）進(jìn)行線性梯度洗脫，流速1 mL/min。將洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥并復(fù)溶于ddHO中，采用點(diǎn)種法確定具有抑菌活性的洗脫組分，以獲得較高純度的細(xì)菌素。

1.3.4.4 Tricine-SDS-PAGE分子質(zhì)量測(cè)定及凝膠原位抑菌檢測(cè)

將Marker和預(yù)處理過的細(xì)菌素樣品依次加入上樣孔中進(jìn)行SDS-PAGE，兩塊凝膠同時(shí)進(jìn)行。電泳完成后將其中一塊凝膠轉(zhuǎn)移至考馬斯亮藍(lán)G-250染液中染色6 h，隨后轉(zhuǎn)移至脫色液中脫色6 h。觀察樣品條帶位置并確定其分子質(zhì)量。另外一塊凝膠浸泡于洗滌液（異丙醇∶乙酸∶水=5∶2∶13），洗滌6～8 h，再用無菌水洗6 h，最后轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，覆蓋上一層含有金黃色葡萄球菌的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，觀察條帶位置是否具有抑菌活性。

1.3.5 乳球菌素036018的抑菌機(jī)制

1.3.5.1 乳球菌素036018對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

將制得的乳球菌素036018溶液用PBS以兩倍稀釋法逐步稀釋2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048 倍。以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性。以肉眼觀察到產(chǎn)生抑菌圈最小的濃度為乳球菌素036018對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.5.2 乳球菌素036018對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制

參照Pei Jinjin等的方法進(jìn)行金黃色葡萄球菌生物膜形成的測(cè)定。6 500×、4 ℃離心10 min收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌，用LB培養(yǎng)基重懸至OD為0.1，吸取100 μL重懸液至96 孔板中，加入等體積的乳球菌素036018溶液于37 ℃孵育24 h，以PBS處理的菌懸液為陰性對(duì)照。小心除去未附著的細(xì)胞，PBS洗滌3 次后甲醇固定10 min，風(fēng)干后再加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫室溫染色30 min。用PBS洗滌3 次除去多余的結(jié)晶紫。在每孔中加入200 μL 95%乙醇溶液溶解附著的結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀測(cè)600 nm波長(zhǎng)處OD值，PBS為空白對(duì)照，生物膜形成率按照下式計(jì)算：

式中：OD為陰性對(duì)照組；OD為實(shí)驗(yàn)組24 h后吸光度；OD為空白對(duì)照組。

1.3.5.3 K泄漏

K濃度的測(cè)定按照段改麗的方法并進(jìn)行一定修改。6 500×、4 ℃離心10 min收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌。PBS洗滌2 次后重懸至OD為0.5，加入等體積乳球菌素036018溶液于37 ℃孵育0、0.5、1、2、3 h，PBS進(jìn)行相同處理的金黃色葡萄球菌作為對(duì)照組，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測(cè)上清液中K濃度。

1.3.5.4 PI染色

采用Lu Yingying等的方法進(jìn)行PI染色。6 500×、4 ℃離心10 min收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌，用PBS重懸菌體后，按照1∶1比例加入乳球菌素036018溶液分別處理0.5、1、2 h。之后用PBS緩沖液洗滌菌體2 次，重懸細(xì)胞并調(diào)整濃度為10CFU/mL，取95 μL細(xì)胞重懸液加入5 μL PI染色液，混勻后室溫避光孵育5～30 min，在熒光顯微鏡下觀察菌體染色情況。

1.3.5.5 掃描電子顯微鏡觀察

根據(jù)Lv Xin等的方法利用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。離心收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌菌體，PBS洗滌兩次，重懸于等體積乳球菌素036018溶液中分別處理30 min、1 h、2 h。6 500×、4 ℃離心10 min收集菌體，用PBS洗滌2 次。加入2.5%戊二醛4 ℃固定過夜。6 500×、4 ℃離心5 min收集菌體，無菌水洗滌3 次。依次使用系列體積分?jǐn)?shù)梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%、100%）脫水。隨后將懸浮在100%乙醇中的菌體轉(zhuǎn)移到干凈的硅片上，室溫晾干后噴金，以PBS進(jìn)行相同處理作為對(duì)照，通過冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察菌體的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.6 乳球菌素036018在牛奶中的應(yīng)用

6 500×、4 ℃離心5 min收集穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌，用生理鹽水重懸并調(diào)節(jié)其濃度為2×10CFU/mL，取1 mL菌懸液加入9 mL的巴氏滅菌牛奶中。再分別加入乳球菌素036018溶液使其濃度分別為2、4、8 倍MIC。充分混勻后放于4 ℃貯藏12 h，每隔2 h取樣計(jì)活菌數(shù)。分別加入等體積PBS作為陰性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌鑒定

從發(fā)酵泡菜中篩選到的乳酸菌分離株D1對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌活性，如圖1所示，該菌株在MRS固體平板上菌落形態(tài)較小，白色圓潤(rùn)光滑，圓形凸起，邊緣整齊有光澤；在油鏡下呈卵圓狀，成對(duì)排列，革蘭氏染色呈陽性。

圖1 菌株D1的分離鑒定Fig. 1 Isolation and identification of strain D1

生理生化結(jié)果顯示，菌株D1過氧化氫酶陰性，能發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和甘露醇，不能利用菊糖，不能在45 ℃條件下生長(zhǎng)，不耐4%的NaCl。

16S rDNA鑒定結(jié)果顯示（圖2），菌株D1與乳酸乳球菌乳亞種相似度達(dá)100%，結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)確定菌株D1為乳酸乳球菌乳亞種，并將其命名為乳酸乳球菌乳亞種NCU036018。

圖2 乳酸乳球菌乳亞種NCU036018的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain L. lactis subsp. lactis NCU036018

2.2 乳酸乳球菌NCU036018發(fā)酵上清液抑菌分析

2.2.1 pH值對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

表1 溫度、pH值、酶處理對(duì)乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Table 1 Effects of temperature, pH and enzyme treatment on the antibacterial activity of the fermentation supernatant of L. lactis subsp. lactis NCU036018

由表1可知，隨著pH值的升高，乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液的抑菌活性呈現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì)（＜0.05），但在pH 10時(shí)仍保留了70%以上的活性，說明該抑菌成分具有較好的pH值穩(wěn)定性。

2.2.2 酶處理對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

如表1所示，乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液經(jīng)淀粉酶和脂肪酶處理后，抑菌活性無顯著變化（＜0.05），經(jīng)過氧化氫酶及胃蛋白酶處理后抑菌活性略有下降，經(jīng)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和-糜蛋白酶處理后抑菌活性完全喪失。由此可以初步確定乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液主要抑菌成分可能是蛋白類物質(zhì)。

2.2.3 溫度發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液經(jīng)121 ℃高溫高壓處理后其抑菌活性略有下降，但仍保留了90%以上（＜0.05），50～100 ℃等不同溫度處理后抑菌活性無顯著變化。說明乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性良好，可能為耐熱的乳酸乳球菌素。

2.3 乳酸乳球菌乳亞種NCU036018生長(zhǎng)及抑菌活性曲線

圖3 乳酸乳球菌乳亞種NCU036018生長(zhǎng)曲線與抑菌活性間的關(guān)系Fig. 3 Relationship between growth curve and antibacterial activity of L. lactic subsp. lactis NCU036018

如圖3所示，乳酸乳球菌乳亞種NCU036018在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，8 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。發(fā)酵液pH值先快速下降隨后逐漸穩(wěn)定在4.2左右。發(fā)酵上清液抑菌活性隨培養(yǎng)時(shí)間呈先上升后下降的趨勢(shì)，在14 h處達(dá)到峰值，抑菌圈直徑為13.60 mm，此時(shí)為細(xì)菌素的最佳收獲時(shí)間，這與已有研究結(jié)果相似。細(xì)菌素一般為次級(jí)代謝產(chǎn)物，通常是發(fā)酵中后期代謝產(chǎn)物，但也有文獻(xiàn)報(bào)道某些細(xì)菌素為初級(jí)代謝產(chǎn)物。此外，發(fā)酵后期（18～36 h）上清液的抑菌活性顯著降低，這可能與菌體釋放的一些水解酶有關(guān)。

2.4 細(xì)菌素分離純化

2.4.1 硫酸銨沉淀

如表2所示，隨著硫酸銨飽和度的上升，乳酸乳球菌乳亞種NCU036018發(fā)酵上清液沉淀物的抑菌活性先上升后下降。在飽和度為70%時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性達(dá)到最強(qiáng)，抑菌圈直徑為13.96 mm。因此，后續(xù)選擇70%的硫酸銨進(jìn)行鹽析。

表2 不同飽和度硫酸銨沉淀物的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of precipitates induced by ammonium sulfate at different concentrations

2.4.2 超濾

硫酸銨沉淀蛋白復(fù)溶物經(jīng)超濾后得到4 個(gè)組分，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性見表3，其中截留分子質(zhì)量為10～30 kDa的組分抑菌圈最大，具有最強(qiáng)的抑菌活性，推測(cè)純化的目的細(xì)菌素蛋白分子質(zhì)量在10～30 kDa范圍內(nèi)。

表3 不同截留分子質(zhì)量組分的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of ultrafiltration fractions with different molecular mass cut-offs

2.4.3 SP Sepharose Fast Flow純化

大多數(shù)細(xì)菌素表現(xiàn)出一種陽離子結(jié)構(gòu)，富含帶正電的精氨酸和賴氨酸殘基，有利于這些多肽和微生物細(xì)胞膜之間的相互作用。因此，可通過陽離子交換層析對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行純化。如圖4所示，0.2 mol/L NaCl洗脫組分具有較高的抑菌活性，說明該組分中含有目的抑菌蛋白。

圖4 不同濃度洗脫液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性Fig. 4 Antibacterial activity of the eluate at different concentrations against S. aureus

2.4.4 Tricine-SDS-PAGE

將0.2 mol/L NaCl溶液洗脫下來的組分除鹽后經(jīng)Tricine SDS-PAGE分析，觀察到泳道上出現(xiàn)較為單一的蛋白條帶，分子質(zhì)量在14.4～20 kDa范圍內(nèi)，見圖5。凝膠原位抑菌結(jié)果顯示出清晰的抑菌帶，對(duì)應(yīng)于左側(cè)蛋白電泳條帶，表明純化獲得的樣品為細(xì)菌素，并將其命名為乳球菌素036018。一些研究人員從不同的菌株中純化出分子質(zhì)量各異的細(xì)菌素，如Ahmad等從sp.中分離的細(xì)菌素為51 kDa、Wayah等分離自SPW1的細(xì)菌素為1 221.074 Da、Ahn等分離自HW01的細(xì)菌素為6 kDa。而分子質(zhì)量在14.4～20 kDa范圍內(nèi)的乳酸乳球菌素鮮見報(bào)道，因此乳球菌素036018可能是一種新型細(xì)菌素。

圖5 乳球菌素036018的Tricine-SDS-PAGE和對(duì)應(yīng)位置抑菌活性的檢測(cè)Fig. 5 Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of lactococcin 036018

2.5 乳球菌素036018抑菌機(jī)制分析

2.5.1 乳球菌素036018對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC

如表4所示，當(dāng)乳球菌素036018稀釋倍數(shù)為128 倍時(shí)，出現(xiàn)了肉眼可見的最小抑菌圈，直徑為（7.78±0.12）mm。因此，乳球菌素036018對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.50 mg/mL。

表4 不同稀釋倍數(shù)下細(xì)菌素粗提物抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of crude bacteriocin extract at different dilution ratios

2.5.2 乳球菌素036018對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

生物膜是微生物在器皿和非器皿表面形成的有結(jié)構(gòu)的微生物聚集體，是食品的一個(gè)重要潛在污染源。一些致病菌在食品表面進(jìn)行定植形成一層生物膜屏障外界的不利環(huán)境從而發(fā)揮致病作用。如圖6所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)乳球菌素036018處理后，金黃色葡萄球菌生物膜的形成率降至25.51%，說明乳球菌素036018對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成有較強(qiáng)的抑制作用，可以降低其致病能力。

圖6 乳球菌素036018處理后對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響Fig. 6 Effect of lactococcin 036018 treatment on the biofilm formation of S. aureus

2.5.3 K泄露

如圖7所示，隨著乳球菌素036018處理時(shí)間的延長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌細(xì)胞外K質(zhì)量濃度呈上升趨勢(shì)，且遠(yuǎn)高于對(duì)照組水平。因此，乳球菌素036018可能破壞了金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的完整性導(dǎo)致K向胞外釋放。其他的細(xì)菌素也具有相同的報(bào)道，如抗菌肽AMP-jsa9、植物乳桿菌素GZ1-27、抗菌肽F1均通過破壞細(xì)胞膜通透性導(dǎo)致K泄漏。對(duì)照組在0～120 min內(nèi)胞外鉀離子水平相對(duì)穩(wěn)定在較低水平，而在120～180 min內(nèi)有較大幅度的上升，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，菌體在無營(yíng)養(yǎng)條件下自身死亡從而釋放出胞內(nèi)K所導(dǎo)致。

圖7 乳球菌素036018及PBS處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞外K＋質(zhì)量濃度變化Fig. 7 Changes in extracellular potassium ion concentration in lactococcin 036018- or PBS-treated S. aureus

2.5.4 PI染色

圖8 熒光顯微鏡下金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的損傷情況Fig. 8 Damage of S. aureus cell membrane observed by fluorescence microscopy

PI是一種可穿透受損細(xì)胞并能與其DNA非特異性結(jié)合的活性熒光染料。PI不能透過完整細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞膜損傷時(shí)，它可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合呈現(xiàn)出紅色。因此，細(xì)胞膜損傷可通過PI染色法判斷。由圖8可知，紅色的金黃色葡萄球菌的數(shù)量隨著乳球菌素036018處理時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，而對(duì)照組則無明顯變化。結(jié)果說明乳球菌素036018處理之后金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜造成損傷，通透性增加，并且具有時(shí)間依賴性。

2.5.5 掃描電子顯微鏡觀察

如圖9所示，對(duì)照組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整飽滿，表現(xiàn)出典型的球狀、光滑的細(xì)胞膜特征。乳球菌素036018處理不同時(shí)間后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化：0.5 h后細(xì)胞表面出現(xiàn)輕微皺縮和凹陷；處理時(shí)間延長(zhǎng)至1 h時(shí)，細(xì)胞表面有明顯的孔洞和大范圍的皺縮；處理時(shí)間為2 h時(shí)，細(xì)胞開始表面出現(xiàn)裂紋甚至破碎，有的細(xì)胞開始發(fā)生溶解。這些結(jié)果表明，乳球菌素036018能以時(shí)間依賴性方式破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)甚至使其溶解。

圖9 乳球菌素036018處理后金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)變化Fig. 9 Morphological changes of S. aureus CMCC26003 treated with lactococcin 036018 observed by scanning electron microscopy

2.6 乳球菌素036018在牛奶中防腐能力評(píng)價(jià)

圖10 乳球菌素036018在4 ℃巴氏殺菌牛奶中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制Fig. 10 Inhibitory effect of lactococcin 036018 on inoculated S. aureus in pasteurized milk during storage at 4 ℃

為了驗(yàn)證乳球菌素036018作為食品基質(zhì)中生物防腐劑的適用性。將乳球菌素036018加入金黃色葡萄球菌污染的牛奶中觀察其防腐效果。如圖10所示，接種金黃色葡萄球菌的牛奶于4 ℃貯存12 h后，對(duì)照組菌落數(shù)略有升高，但不同濃度乳球菌素036018均在2 h內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抑制作用（＜0.05），且存在劑量依賴，隨后菌落數(shù)均趨于穩(wěn)定。其中，8MIC乳球菌素036018的處理有效降低了3 個(gè)數(shù)量級(jí)的金黃色葡萄球菌。這些數(shù)據(jù)表明，乳球菌素036018是一種有潛力的生物防腐劑，可以在運(yùn)輸和保藏過程中控制乳制品中的金黃色葡萄球菌數(shù)量。

3 結(jié) 論

從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離出1 株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸乳球菌乳亞種NCU036018，其發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用，且對(duì)pH值、溫度穩(wěn)定，對(duì)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、-糜蛋白酶敏感，推測(cè)其抑菌成分為細(xì)菌素。通過硫酸銨沉淀、超濾、陽離子交換層析純化出細(xì)菌素乳球菌素036018，其分子質(zhì)量為14.4～20 kDa，MIC為0.50 mg/mL。乳球菌素036018能有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，可通過破壞細(xì)胞膜完整性、改變膜通透性抑制金黃色葡萄球菌。此外，乳球菌素036018在牛奶基質(zhì)中能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。綜上，細(xì)菌素乳球菌素036018具備作為生物防腐劑在食品中應(yīng)用的潛力。