連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和食管癌Eca-109細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制

郭子琪，王少康，桂蘭蘭，夏 惠，孫桂菊

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009）

2020年，食管癌的發(fā)病率位列全球范圍惡性腫瘤的第7位，總死亡率位列全球范圍惡性腫瘤第6位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)食管癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，是威脅國(guó)民健康的高發(fā)性惡性腫瘤。目前食管癌治療有手術(shù)切除、化療和放療，但副作用不容忽視。中藥在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，資源豐富，具有成本低廉、毒副作用較小等特點(diǎn)，因而在中藥中篩選抗癌生物活性成分并探討其抗癌機(jī)制顯得尤為重要。

連翹苷不僅是中藥連翹的主要生物活性物質(zhì)之一，也存在于新食品原料連翹葉中，且具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用。越來(lái)越多的研究顯示連翹苷可通過(guò)多種信號(hào)通路如磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB）（也稱為PI3K/AKT）、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）等信號(hào)通路發(fā)揮作用。PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)許多生理和病理狀況至關(guān)重要，例如細(xì)胞增殖、血管生成、代謝、分化和存活，被證實(shí)在乳腺癌、前列腺癌和胃癌等多種腫瘤中異常表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)連翹苷可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制768-0細(xì)胞增殖活力；同時(shí)多項(xiàng)研究證實(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路與食管癌的發(fā)生有關(guān)，且發(fā)現(xiàn)可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)影響食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，連翹苷對(duì)食管癌的抗癌效果及作用機(jī)制尚不明確。

本研究以食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞（本課題組自制）和Eca-109細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察連翹苷對(duì)這兩種細(xì)胞增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲的影響，并從PI3K/AKT信號(hào)通路探討其作用機(jī)制，為新食品原料連翹葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人食管正常上皮細(xì)胞（human normal esophageal epithelial cell，HEEC）、人食管癌Eca-109細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。連翹苷（純度≥98%） 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；黃曲霉毒素B（aflatoxin B，AFB）（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清以色列BI公司；低限基本培養(yǎng)基（minima essential medium，MEM）、無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基RPMI-1640、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）、胰蛋白酶溶液 美國(guó)Gibco公司；雙抗（青霉素、鏈霉素） 美國(guó)Hyclone公司；甲醇（分析純） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK8） 美國(guó)APExBIO公司；Transwell小室、基質(zhì)膠、熒光素標(biāo)記的連接素V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 美國(guó)BD公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence reagents，ECL） 江蘇迅貝生物技術(shù)股份有限公司；PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、p21、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、-actin等抗體 美國(guó)ABcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IX51型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；CCL-170B-8型二氧化碳培養(yǎng)箱 新加坡ESCO公司；Vert.A1型倒置金相顯微鏡 德國(guó)Zeiss公司；5424 R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；FacsAriaII型流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；Infnite F50型酶標(biāo)檢測(cè)儀瑞士Tecan公司；DYY-7C型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)本研究前期基礎(chǔ)，使用含1 μmol/L AFB的MEM培養(yǎng)基（每100 mL MEM培養(yǎng)基中加入10 mL胎牛血清和1 mL雙抗）進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)HEEC，置于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d進(jìn)行傳代，直到培養(yǎng)到第30代為食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞。

Eca-109細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基（每100 mL RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10 mL胎牛血清和1 mL雙抗）進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d進(jìn)行傳代。

1.3.2 細(xì)胞克隆程度測(cè)定

將HEEC和食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，接種于6 孔板，每孔接種1 000 個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，每隔3 d換1 次培養(yǎng)液。培養(yǎng)2 周后，棄掉孔中的培養(yǎng)液，PBS洗2 次，用3 mL甲醇（分析純）固定15 min，加入結(jié)晶紫溶液常溫染色20 min，用PBS沖洗，然后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)大于10 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次?？寺⌒纬陕视?jì)算如公式（1）所示。

1.3.3 細(xì)胞存活率測(cè)定

將HEEC、食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞各以5×10個(gè)/mL密度接種于96 孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別用0、1、10、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L連翹苷處理細(xì)胞，并設(shè)置空白孔（僅含培養(yǎng)液）、對(duì)照孔（0 μmol/L連翹苷），每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24 h后，每孔加10 μL CCK8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h，置于酶標(biāo)檢測(cè)儀中在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度。使用Graph Pad軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC）。通過(guò)將0 μmol/L連翹苷組的細(xì)胞存活率定義為100%，細(xì)胞存活率按公式（2）計(jì)算，表征各組細(xì)胞增殖活力。

1.3.4 細(xì)胞周期測(cè)定

一方面，盡管東昌區(qū)政府高度重視并采取一系列卓有成效的措施支持葫蘆文化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，卻沒(méi)有深刻認(rèn)識(shí)到葫蘆文化在鄉(xiāng)村旅游中的發(fā)展地位，沒(méi)有充分抓住山東省全面開(kāi)發(fā)鄉(xiāng)村旅游的良好機(jī)遇，利用本地豐富的葫蘆文化旅游資源，大力發(fā)展極具地域特色的鄉(xiāng)村旅游。另一方面，社區(qū)居民對(duì)種植、加工葫蘆的收入較為滿意，且因文化層次較低，缺少鄉(xiāng)村旅游開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)，從而對(duì)開(kāi)發(fā)葫蘆文化旅游缺乏足夠的信心和熱情。

將食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，內(nèi)含3 mL完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別用0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)細(xì)胞24 h，用PBS洗滌后，加1 mL胰酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞皺縮變圓立即加入2 mL完全培養(yǎng)液終止消化，離心（1 000 r/min、5 min）后，加入PBS調(diào)整每孔1×10個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后，倒掉上清液，加入500 μL體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇置于4 ℃冰箱過(guò)夜。PBS洗滌、離心2 次（1 000 r/min、5 min），棄上清液，加入500 μL配制好的染液（（RNase A）∶（PI）＝1∶9），輕柔吹打混勻，避光放置30～60 min后，吸取細(xì)胞懸液過(guò)300 目篩后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 細(xì)胞凋亡測(cè)定

將食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞各以1×10個(gè)/mL密度接種于6 孔板，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別用0、10、100 μmol/L連翹苷處理細(xì)胞24 h后，與上述同樣方法用PBS調(diào)整至每孔5×10個(gè)細(xì)胞后，PBS洗滌、離心（1 000 r/min、5 min）2 次，棄上清液，加適量的結(jié)合緩沖液，輕柔吹打，加5 μL Annexin V-FITC，避光孵育15 min后，加5 μL PI，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.6 細(xì)胞遷移、侵襲能力測(cè)定

收集0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞。用無(wú)胎牛血清的MEM培養(yǎng)基以體積比1∶8稀釋基質(zhì)膠，50 μL/孔鋪于Transwell小室，4 ℃冷藏過(guò)夜。上室加入200 μL細(xì)胞懸液（5×10個(gè)/孔），下室加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的600 μL培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS清洗，棉簽擦去基質(zhì)膠與細(xì)胞，甲醇（分析純）固定，結(jié)晶紫染色液染色后于倒置顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞，每張膜隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔的細(xì)胞數(shù)，分析細(xì)胞侵襲能力。而在分析細(xì)胞遷移能力時(shí)，Transwell小室不需要鋪基質(zhì)膠，且上室僅加入200 μL細(xì)胞懸液（2×10個(gè)/孔）即可，其余步驟同細(xì)胞侵襲能力分析。

1.3.7 Western blot檢測(cè)

提取0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞的總蛋白，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，將定量后的蛋白按照20 μg/孔上樣，用不同的恒壓進(jìn)行電泳，采用“三明治”法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，加入對(duì)應(yīng)的一抗后4 ℃孵育過(guò)夜。TBST（Tris-HCl緩沖溶液+Tween-20）洗膜3 次，每次10 min，用對(duì)應(yīng)種屬的二抗（（二抗）∶（TBST）＝1∶3 000）在37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室顯色曝光，用Image J軟件定量分析蛋白灰度值結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 20.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用Graph Pad 8.0軟件進(jìn)行繪圖。＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的確定

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)是體外檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的常用方法。細(xì)胞克隆形成的能力與腫瘤細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)，其大小可以反映腫瘤細(xì)胞的致瘤能力和惡性程度。如圖1所示，HEEC和食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的克隆形成率分別為（0.60±0.08）%、（4.23±0.21）%，與HEEC相比，食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的克隆形成率顯著升高（＜0.05），說(shuō)明食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)。研究表明食管鱗癌的癌前病變主要指食管鱗狀上皮細(xì)胞的異型增生，因此認(rèn)為食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞具有一定的致瘤能力，屬于食管癌前病變細(xì)胞。

圖1 食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Fig. 1 Results of plate cloning of malignantly transformed esophageal epithelial cells (n = 3)

2.2 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞、Eca-109細(xì)胞和HEEC存活率的影響

CCK8法檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示，10、100、200、400、600、800 μmol/L和1 000 μmol/L連翹苷均可抑制食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞增殖，其IC值分別為308.4 μmol/L和322.0 μmol/L；然而，1、10、100 μmol/L連翹苷可促進(jìn)HEEC增殖，200、400、600、800 μmol/L和1 000 μmol/L連翹苷可抑制HEEC增殖，其IC值為384.4 μmol/L。結(jié)合連翹苷對(duì)3 種細(xì)胞增殖的影響，1、10、100 μmol/L連翹苷對(duì)HEEC增殖無(wú)明顯的抑制，這證明了連翹苷濃度在低于或等于100 μmol/L時(shí)對(duì)HEEC無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用；而10、100 μmol/L連翹苷可抑制食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞增殖，且為避免高濃度連翹苷細(xì)胞毒性的影響，故選擇濃度10、100 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞、Eca-109細(xì)胞和HEEC存活率的影響（n＝3）Table 1 Effect of forsythin at different concentrations on the survival rates of malignantly transformed esophageal epithelial cells, Eca-109 cells and HEEC (n = 3)

2.3 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制

2.3.1 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果（圖2）顯示，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞周期發(fā)生顯著改變，干預(yù)組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著降低（＜0.05），且隨著連翹苷濃度升高，各周期細(xì)胞比例變化越明顯，說(shuō)明連翹苷可能通過(guò)將細(xì)胞阻滯在G0/G1期抑制食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞增殖。

圖2 連翹苷誘導(dǎo)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞周期改變（n＝3）Fig. 2 Forsythin-induced cell cycle changes of malignantly transformed esophageal epithelial cells (n = 3)

2.3.2 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的凋亡率分別為（8.15±0.14）%、（10.76±0.46）%和（22.83±0.13）%（圖3）。與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的凋亡率顯著升高（＜0.05）。說(shuō)明連翹苷可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞增殖。

圖3 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用（n＝3）Fig. 3 Promoting effect of forsythin on cell apoptosis in malignantly transformed esophageal epithelial cells (n = 3)

2.3.3 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞遷移、侵襲的影響

如圖4A、B所示，0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的遷移穿膜細(xì)胞數(shù)分別為295.20±14.62、190.20±20.30和136.60±7.94。與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的遷移穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（＜0.05），說(shuō)明經(jīng)10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)后的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞遷移能力降低。由圖4C、D可知，0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)分別為169.80±16.81、67.60±4.63和47.60±1.50。與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（＜0.05），說(shuō)明經(jīng)10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)后的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞侵襲能力降低。

圖4 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用（n＝5）Fig. 4 Inhibitory effect of forsythin on migration and invasion of malignantly transformed esophageal epithelial cells (n = 5)

2.3.4 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)結(jié)果如圖5顯示，在PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)方面，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。在周期相關(guān)蛋白表達(dá)方面，與0 μmol/L干預(yù)組相比，100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。在凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)方面，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。在侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)方面，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞中MMP9蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。

圖5 連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of forsythin on protein expression in malignantly transformed esophageal epithelial cells

2.4 連翹苷對(duì)Eca-109細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制

2.4.1 連翹苷對(duì)Eca-109細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果如圖6所示，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的Eca-109細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，干預(yù)組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（＜0.05），S期細(xì)胞比例明顯降低（＜0.05），且隨著連翹苷濃度升高，各周期細(xì)胞比例變化越明顯，說(shuō)明連翹苷可能通過(guò)將細(xì)胞阻滯在G0/G1期抑制Eca-109細(xì)胞增殖。

圖6 連翹苷誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞周期改變（n＝3）Fig. 6 Forsythin-induced cell cycle changes in Eca-109 cells (n = 3)

2.4.2 連翹苷對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖7所示，0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的Eca-109細(xì)胞的凋亡率分別為（9.92±0.59）%、（12.71±0.50）%和（15.42±0.01）%。與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組Eca-109細(xì)胞的凋亡率顯著升高（＜0.05），說(shuō)明連翹苷可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制Eca-109細(xì)胞增殖。

圖7 連翹苷對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用（n＝3）Fig. 7 Promoting effect of forsythin on cell apoptosis in Eca-109 cells (n = 3)

2.4.3 連翹苷對(duì)Eca-109細(xì)胞遷移、侵襲的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8A、B所示，0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的Eca-109細(xì)胞的遷移穿膜細(xì)胞數(shù)分別為413.60±12.02、310.04±9.91和183.60±10.30。與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組Eca-109細(xì)胞的遷移穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（＜0.05），說(shuō)明經(jīng)10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)后的Eca-109細(xì)胞遷移能力降低。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖8C、D）顯示，0、10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組Eca-109細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)分別為44.40±3.82、20.00±2.00和7.40±0.48，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組Eca-109細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（＜0.05），說(shuō)明經(jīng)10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)后的Eca-109細(xì)胞侵襲能力降低。

圖8 連翹苷對(duì)Eca-109細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用（n＝5）Fig. 8 Inhibitory effect of forsythin on migration and invasion of Eca-109 cells (n = 5)

2.4.4 連翹苷對(duì)Eca-109細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，在PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)方面，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的Eca-109細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）（圖9）。在周期相關(guān)蛋白表達(dá)方面，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的Eca-109細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。在凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)方面，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的Eca-109細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。在侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)方面，與0 μmol/L干預(yù)組相比，10、100 μmol/L連翹苷干預(yù)組的Eca-109細(xì)胞中MMP9蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。

圖9 連翹苷對(duì)Eca-109細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響Fig. 9 Effect of forsythin on protein expression in Eca-109 cells

3 討 論

連翹是一味廣譜抗腫瘤中藥，對(duì)乳腺癌、前列腺癌、食管癌等均有抑制作用，其中連翹苷為主要活性物質(zhì)。本研究旨在證明連翹苷具有抗食管癌活性。本課題組前期的病例對(duì)照研究結(jié)果表明，AFB的高暴露可能是中國(guó)淮安（食管癌高發(fā)區(qū)）地區(qū)人群食管癌前病變的重要危險(xiǎn)因素，故本研究使用AFB處理HEEC使其轉(zhuǎn)變?yōu)槭彻苌掀盒赞D(zhuǎn)變細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)連翹苷可抑制食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖，且連翹苷對(duì)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和食管癌Eca-109細(xì)胞的抑制率呈現(xiàn)濃度梯度依賴性增高。

PI3K/AKT信號(hào)通路在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，其異常激活同樣與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。PI3K通過(guò)配體（胰島素、生長(zhǎng)因子、激素）與酪氨酸激酶受體以及G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合而被激活。一旦被激活，該蛋白激酶將催化磷脂酰肌醇二磷酸為磷脂酰肌醇三磷酸。AKT被募集到質(zhì)膜，可經(jīng)歷兩個(gè)磷酸化過(guò)程，第一個(gè)過(guò)程由3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1在蘇氨酸殘基水平催化，第二個(gè)反應(yīng)由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mammalian target of rapamycin complex 2, mTORC2）催化。一旦被磷酸化激活，AKT將磷酸化其他物質(zhì)從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡等。據(jù)報(bào)道，連翹苷可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路而發(fā)揮抑制腎細(xì)胞腺癌768-0細(xì)胞增殖活力、干預(yù)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移與侵襲的能力。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)連翹苷干預(yù)后食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和食管癌Eca-109細(xì)胞p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平降低，提示連翹苷可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制食管癌。

越來(lái)越多的證據(jù)表明p21蛋白是控制細(xì)胞增殖/生長(zhǎng)并參與多種癌癥的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可在G1和S期作為負(fù)調(diào)節(jié)劑控制細(xì)胞周期進(jìn)程。Du Yuanyuan等發(fā)現(xiàn)連翹苷可通過(guò)p53/p21信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，Guo Qisang等發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可提高p21的表達(dá)水平，因此推測(cè)連翹苷通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)p21蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)周期改變，本研究證實(shí)了這一推測(cè)。

Lei Qiuxiang等發(fā)現(xiàn)連翹葉的乙醇提取物（ethanol extract ofleaf，F(xiàn)SEE）可誘導(dǎo)食管癌TE-13細(xì)胞凋亡，且經(jīng)FSEE處理后的TE-13細(xì)胞mRNA表達(dá)水平下調(diào)。Bcl-2是Bcl-2細(xì)胞凋亡蛋白調(diào)節(jié)劑家族的成員，可特異性阻斷細(xì)胞凋亡。Zhang Li等研究發(fā)現(xiàn)miR-325的過(guò)表達(dá)可抑制PI3K和AKT的磷酸化，降低Bcl-2的表達(dá)。PI3K/AKT通路可通過(guò)增加Bcl-2啟動(dòng)子的組蛋白乙?；瘉?lái)促進(jìn)Bcl-2轉(zhuǎn)錄。本研究證實(shí)連翹苷可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路下調(diào)Bcl-2表達(dá)來(lái)促進(jìn)食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞凋亡。

韓國(guó)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)連翹提取物可能阻斷乳腺癌細(xì)胞的侵襲，而且通過(guò)明膠酶譜和組織蛋白酶K檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到MMP2和MMP9活性降低。MMP9是MMP家族的成員，參與癌癥轉(zhuǎn)移中細(xì)胞外基質(zhì)的分解。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可通過(guò)誘導(dǎo)MMP9啟動(dòng)子區(qū)域上的和來(lái)調(diào)節(jié)MMP9的表達(dá)，從而控制癌細(xì)胞遷移和侵襲。因此假設(shè)連翹苷可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路下調(diào)MMP9表達(dá)來(lái)抑制食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞侵襲、遷移，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一假設(shè)。

綜上，連翹苷可抑制食管上皮惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞和Eca-109細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲發(fā)生，且隨著濃度的增加抑制作用越顯著，其機(jī)制與抑制PI3K/AKT通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。