乳酸克魯維酵母作為微生物細(xì)胞工廠的應(yīng)用研究進(jìn)展

劉士琦，榮蘭新，趙栢祥，盧志慧，趙 禹，肖冬光，于愛群,2,*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457）

合成生物學(xué)是一門綜合了生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)和工程學(xué)等學(xué)科知識的新興前沿交叉學(xué)科。近年來，合成生物學(xué)理論和技術(shù)的迅猛發(fā)展也對生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，尤其是在構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠生物合成生物燃料、平臺化學(xué)品、復(fù)雜大分子等各種高附加值產(chǎn)品方面展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景和賦能潛力。合成生物學(xué)的發(fā)展正在為醫(yī)藥、化工、食品、能源、材料、農(nóng)業(yè)等各個工業(yè)領(lǐng)域帶來深刻變革，也必定對人類社會發(fā)展產(chǎn)生廣泛和深刻的影響。其中，酵母菌屬于單細(xì)胞低等真核生物，它兼有原核生物和真核生物兩者的優(yōu)點，因此被認(rèn)為是合成生物學(xué)研究最理想的模式生物之一。

乳酸克魯維酵母最早是從牛奶中分離得到的一種非常規(guī)酵母菌。對該酵母的遺傳學(xué)研究開始于20世紀(jì)60年代初，起初其被歸為酵母屬，被命名為。但后來發(fā)現(xiàn)該酵母不能與釀酒酵母（）進(jìn)行雜交，又將其歸為克魯維酵母屬；再后來其又被更名為馬克思克魯維酵母乳酸變種（var.）。直到20世紀(jì)90年代，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的分類方法確定了該酵母與馬克思克魯維酵母實際上是兩個獨(dú)立的物種，并最終將其命名為乳酸克魯維酵母（）。

乳酸克魯維酵母細(xì)胞呈球形或橢圓形，細(xì)胞體積略小于釀酒酵母細(xì)胞，主要進(jìn)行多邊芽殖，不產(chǎn)生子囊孢子和假菌絲；菌落呈乳白色，表面光滑、隆起，邊緣整齊，無褶皺，略有光澤，質(zhì)地細(xì)膩有黏性。與釀酒酵母不同，乳酸克魯維酵母屬于嚴(yán)格好氧菌，其可利用的碳源范圍也更為廣泛，包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、乙醇、甘露醇、乳酸、琥珀酸、檸檬酸等，特別是由于其能夠產(chǎn)生-半乳糖苷酶和乳糖透性酶分解乳糖，因此，能夠在以乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。乳酸克魯維酵母與釀酒酵母之間既有相似之處，又有不同之處。表1主要從傳代方式及能量代謝等方面比較了這兩種酵母的異同，其中這兩者較為明顯的差異是釀酒酵母在有氧條件下也會受到克雷布特效應(yīng)的影響，而乳酸克魯維酵母不存在該效應(yīng)，因而在發(fā)酵過程中更易獲得較高的菌體生物量。此外，乳酸克魯維酵母底盤細(xì)胞作為異源表達(dá)宿主還具有諸多優(yōu)勢：第一，它已被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證為食品安全級（generally recognized as safe，GRAS）微生物；第二，其遺傳背景清晰，易于進(jìn)行遺傳操作，且基因游離表達(dá)和整合表達(dá)的穩(wěn)定性均較高；第三，其蛋白分泌能力強(qiáng)、糖基化適度；第四，其可以在標(biāo)準(zhǔn)酵母培養(yǎng)基中生長，大規(guī)模發(fā)酵時不需要甲基營養(yǎng)型酵母（例如巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母）所需的防爆發(fā)酵設(shè)備。自20世紀(jì)50年代以來，乳酸克魯維酵母一直被用作-半乳糖苷酶（俗稱乳糖酶，可降解乳糖，是無乳糖乳制品生產(chǎn)所必需的酶）的工業(yè)生產(chǎn)菌株。從20世紀(jì)60年代開始，干燥失活的乳酸克魯維酵母一直被用作食品補(bǔ)充劑。因此乳酸克魯維酵母在食品發(fā)酵工業(yè)中具有重要的研究意義和廣闊的應(yīng)用前景。

表1 乳酸克魯維酵母與釀酒酵母主要特征的對比Table 1 Comparison of key features of K. lactis with those of the model yeast S. cerevisiae

近年來，以乳酸克魯維酵母為底盤細(xì)胞開展的一系列合成生物學(xué)方面的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究發(fā)展迅速，并逐漸成為研究熱點。本文主要對乳酸克魯維酵母底盤細(xì)胞在合成生物學(xué)元件、遺傳操作工具、基因編輯策略等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了介紹，并對利用合成生物學(xué)手段構(gòu)建乳酸克魯維酵母細(xì)胞工廠的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述和展望。

1 乳酸克魯維酵母的分子遺傳學(xué)及合成生物學(xué)研究進(jìn)展

1.1 合成生物學(xué)元件

以已知的代謝網(wǎng)絡(luò)和重組DNA技術(shù)為基礎(chǔ)，采用自下而上的理念，通過設(shè)計一些合成生物學(xué)功能元件以精確調(diào)控代謝途徑，改善微生物底盤細(xì)胞性能，從而實現(xiàn)目的產(chǎn)物的高效合成是合成生物學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。近年來，研究人員已經(jīng)在乳酸克魯維酵母底盤中構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)的載體（整合型質(zhì)粒和游離型質(zhì)粒），并對啟動子、終止子和信號序列等常用（合成）生物學(xué)功能元件進(jìn)行了優(yōu)化，從而大大提升了乳酸克魯維酵母作為微生物細(xì)胞工廠的潛力。本節(jié)主要總結(jié)乳酸克魯維酵母底盤中常用的合成生物學(xué)元件以及分子遺傳學(xué)方面的研究進(jìn)展。

1.1.1 啟動子

通過控制啟動子的強(qiáng)度可以有效改變基因表達(dá)水平。高效的強(qiáng)啟動子通常會對外源基因表達(dá)產(chǎn)生很強(qiáng)的促進(jìn)作用，因此構(gòu)建和篩選強(qiáng)啟動子是提高乳酸克魯維酵母底盤中外源產(chǎn)物產(chǎn)量和得率的有效策略。

目前，雖然有一些乳酸克魯維酵母的組成型和誘導(dǎo)型啟動子已經(jīng)得到了功能鑒定，但總地來說，已報道的可用于異源基因表達(dá)的高效啟動子數(shù)目仍然較少。其中，-半乳糖苷酶基因（）的啟動子P是目前在乳酸克魯維酵母底盤中應(yīng)用最廣泛的內(nèi)源強(qiáng)啟動子，該啟動子可由乳糖或半乳糖誘導(dǎo)（圖1）。在乳酸克魯維酵母細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄激活因子Lac9對P具有激活作用，而Lac9又受到抑制劑KlGal80和雙功能蛋白KlGal1的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)乳糖水解或吸收胞外半乳糖時，KlGal1開始發(fā)揮作用，催化半乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖-1-磷酸；同時KlGal1與KlGal80結(jié)合并使其失活，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)Lac9的表達(dá)，最終實現(xiàn)了對基因的誘導(dǎo)表達(dá)。

圖1 乳酸克魯維酵母β-半乳糖苷酶基因啟動子PKlLAC4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制Fig. 1 Mechanism for the transcriptional regulation of the promoter of the β-galactosidase gene in K. lactis

此外，在乳酸克魯維酵母底盤中應(yīng)用較多的其他一些啟動子還包括來自釀酒酵母的組成型啟動子P，乳酸克魯維酵母內(nèi)源誘導(dǎo)型啟動子P、P和P等。P是釀酒酵母中磷酸甘油酸激酶基因（）的啟動子，也是釀酒酵母中具有較高活性的啟動子之一，目前已被成功應(yīng)用于乳酸克魯維酵母生產(chǎn)白細(xì)胞介素-1β和嗜熱酯酶等。P是乳酸克魯維酵母酸性磷酸酯酶基因（）的啟動子，它受到胞內(nèi)無機(jī)磷酸鹽濃度的調(diào)節(jié)；磷酸鹽濃度低對乳酸克魯維酵母酸性磷酸酯酶的合成具有較明顯的促進(jìn)作用，目前該啟動子也已被應(yīng)用于乳酸克魯維酵母生產(chǎn)白細(xì)胞介素-1β和-淀粉酶。編碼乳酸克魯維酵母線粒體乙醇脫氫酶基因（）的啟動子P是乙醇誘導(dǎo)型啟動子，且該啟動子并不受葡萄糖的抑制，已被用于人血清白蛋白、--阿拉伯呋喃糖苷酶和超氧化物歧化酶等多種蛋白在乳酸克魯維酵母底盤中的生產(chǎn)。P是乳酸克魯維酵母中編碼丙酮酸脫羧酶基因（）的啟動子，其活性受到碳源和溶氧水平的調(diào)控，已被用于乳酸克魯維酵母異源生產(chǎn)來自毛栓菌（）的漆酶和來自一種耐鹽酵母菌（）的葡萄糖淀粉酶等。天然啟動子的使用大大提高了蛋白及其他高值產(chǎn)物的表達(dá)水平，除了這些天然存在的內(nèi)源和外源啟動子，人工合成啟動子也已被證明是微生物細(xì)胞工廠中非常具有發(fā)展?jié)摿Φ暮铣缮飳W(xué)元件之一。例如，Sakhtah等通過將組成型啟動子P和碳源敏感型啟動子P的部分區(qū)域在體外進(jìn)行雜合，構(gòu)建出了受碳源精確調(diào)控的人工雜合啟動子P，當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖和甘油等碳源時，該啟動子的功能被抑制；當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源被耗盡時，該啟動子就被激活并啟動目的基因的表達(dá)。該研究構(gòu)建的受碳源精確調(diào)控的人工啟動子對于進(jìn)一步闡明酵母啟動子的作用機(jī)制具有十分重要的意義。隨著釀酒酵母和解脂耶氏酵母等酵母人工合成啟動子研究的不斷深入，勢必會促進(jìn)乳酸克魯維酵母人工合成啟動子的快速發(fā)展。

乳酸克魯維酵母底盤中異源表達(dá)目標(biāo)基因中常用的啟動子如表2所示。

表2 乳酸克魯維酵母底盤中異源表達(dá)目標(biāo)基因中常用的啟動子Table 2 Most commonly used promoters for heterologous expression of target genes in K. lactis

1.1.2 終止子

相比于啟動子，終止子對于基因轉(zhuǎn)錄水平和mRNA穩(wěn)定性的影響經(jīng)常被低估。但實際上，在酵母菌等真核生物中，終止子既能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因的表達(dá)，又能夠影響轉(zhuǎn)錄后mRNA的穩(wěn)定性，因此它也是非常重要的合成生物學(xué)元件。

在釀酒酵母中，最常用的終止子包括t和t，但這兩個終止子的序列較長，不利于多基因表達(dá)載體的構(gòu)建。為了解決這一問題，Curran等開始構(gòu)建一系列短的、人工合成的終止子，相比于釀酒酵母的t，這些人工終止子中蛋白熒光強(qiáng)度和mRNA表達(dá)量最高分別增加了3.7 倍和4.4 倍；此外，Curran等還將基于釀酒酵母的人工合成終止子在解脂耶氏酵母中進(jìn)行了功能驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該合成終止子有很好的種間可轉(zhuǎn)移性。乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)常使用的終止子是其內(nèi)源的t和來自釀酒酵母的終止子如t、t和t等。然而到目前為止，還沒有關(guān)于乳酸克魯維酵母人工終止子基因工程的報道，在釀酒酵母底盤中得到功能驗證的人工合成終止子也并未在乳酸克魯維酵母底盤中得到應(yīng)用，但是在釀酒酵母和解脂耶氏酵母中可以進(jìn)行功能轉(zhuǎn)移人工合成終止子的研究為異源合成終止子在乳酸克魯維酵母中的應(yīng)用開拓了思路。因此，利用合成生物學(xué)技術(shù)來開發(fā)乳酸克魯維酵母適用的性能穩(wěn)定、功能可控的人工合成終止子可以成為未來乳酸克魯維酵母分子遺傳學(xué)和合成生物學(xué)研究的重點分支方向之一。

1.1.3 信號序列

信號序列是一段疏水氨基末端的延伸，具有引導(dǎo)多肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的功能，也是酵母底盤中調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)分泌所必不可少的生物學(xué)元件。通常情況下，蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中的積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其在培養(yǎng)基中的積累量，這使得下游加工過程中需要額外引入復(fù)雜的蛋白質(zhì)純化工藝。相對而言，胞外分泌的蛋白質(zhì)純化過程會更簡單、高效，更利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，合適信號序列的選擇是酵母底盤細(xì)胞高效合成內(nèi)源/外源蛋白質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。酵母細(xì)胞中負(fù)責(zé)分泌特定蛋白的信號序列通常包含一個位于信號序列和異源蛋白之間的C末端Kex2蛋白酶識別位點，因此，一旦新產(chǎn)生的多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，信號序列就被切除。真核生物信號序列之間的保守性非常強(qiáng)，而且一般情況下，天然存在的信號序列就能夠滿足對外源蛋白進(jìn)行有效分泌的要求。

到目前為止，一些內(nèi)源、外源和合成的信號序列已經(jīng)被成功應(yīng)用到乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)中以合成各種具有不同分泌需求的外源蛋白質(zhì)。比如，F(xiàn)leer和Berg等分別以人血清白蛋白和凝乳酶為模型蛋白，比較了乳酸克魯維酵母中不同分泌信號的作用效果。Madhavan等將里氏木霉（）的外切纖維素酶I基因（）的分泌信號與P啟動子融合，在乳酸克魯維酵母中進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，并與來自釀酒酵母的-交配因子（-mating factor，-MF）信號肽進(jìn)行功能比較，結(jié)果表明分泌信號更能顯著提高重組蛋白在乳酸克魯維酵母底盤中的表達(dá)量。上述研究結(jié)果表明不同的分泌信號對蛋白的胞外分泌影響十分明顯，因此需要開發(fā)具有普適性、效率高的分泌信號序列，為異源蛋白的高效表達(dá)提供穩(wěn)定可靠的解決方案。

1.1.4 選擇標(biāo)記

目前，在乳酸克魯維酵母遺傳操作系統(tǒng)中，通常是選擇營養(yǎng)缺陷型和藥物抗性來作為篩選標(biāo)記。其中，抗性標(biāo)記能夠在包括原養(yǎng)型菌株在內(nèi)的任何菌株中使用，而G418和博來霉素這兩種真菌抗生素的應(yīng)用更為廣泛。營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記只能應(yīng)用于特定的菌株，而、、也已經(jīng)被證明是篩選乳酸克魯維酵母陽性轉(zhuǎn)化子的理想標(biāo)記。此外，氮源篩選標(biāo)記的利用也是在乳酸克魯維酵母中重要的特異性篩選方案。該篩選標(biāo)記是以構(gòu)巢曲霉（）中的乙酰胺酶（由基因編碼）為基礎(chǔ)形成的，乙酰胺酶可以將乙酰胺分解生成含氮化合物，供菌株生長。當(dāng)其作為篩選標(biāo)記時，乙酰胺就是培養(yǎng)基中的唯一氮源，只有成功轉(zhuǎn)化含有乙酰胺酶標(biāo)記的陽性菌株才能在該篩選培養(yǎng)基上生長。該方案已經(jīng)被應(yīng)用于乳酸克魯維酵母商用菌株GG799中，并成功實現(xiàn)了對牛腸激酶、纖維素酶等多種蛋白的異源表達(dá)。乙酰胺酶還可以分解氟乙酰胺，生成對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)，使含有乙酰胺酶標(biāo)記的菌株不能生長，因此利用這一原理還可以實現(xiàn)該篩選標(biāo)記的回收和重復(fù)利用。

1.1.5 質(zhì)粒載體

外源基因在酵母中的表達(dá)主要有兩種策略：游離型質(zhì)粒表達(dá)和整合型質(zhì)粒表達(dá)。游離型質(zhì)?；蚓哂锌截悢?shù)較高的優(yōu)點，但是在沒有選擇標(biāo)記的情況下容易發(fā)生丟失；整合型質(zhì)粒具有能夠在細(xì)胞中較穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)點，但基因拷貝數(shù)通常較低。

目前，最常用的乳酸克魯維酵母整合型質(zhì)粒是由美國NEB公司生產(chǎn)的商用載體pKLAC1和pKLAC2，該系列載體含有突變的Pribnow序列（PBI）、乳酸克魯維酵母內(nèi)源基因終止子t、由釀酒酵母啟動子P調(diào)控的黑曲霉乙酰胺酶基因（）的選擇標(biāo)記基因、氨芐西林抗性基因（）和大腸桿菌復(fù)制起點（ori）。

目前在乳酸克魯維酵母中可用的游離型質(zhì)粒大多是以天然質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建形成的。其中，從果蠅克魯維酵母變種中分離得到的pKD1質(zhì)粒在乳酸克魯維酵母中的應(yīng)用較為廣泛。該質(zhì)粒的特征與釀酒酵母的2 μm質(zhì)粒較為相似，包含一個果蠅克魯維酵母的復(fù)制起點、編碼位點特異性質(zhì)粒重組酶的基因A、參與分配的基因B和C、順式作用分配位點和反向重復(fù)序列的重組酶位點。

嗜殺質(zhì)粒pGKLl和pGKL2是一種線性雙鏈DNA質(zhì)粒，天然存在于多個克魯維酵母菌株中。它們能夠在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定存在，且拷貝數(shù)較高（每個細(xì)胞中可達(dá)100～200 個拷貝），也能夠產(chǎn)生異源三聚體內(nèi)毒素。嗜殺質(zhì)粒作為乳酸克魯維酵母的表達(dá)載體時存在兩個明顯缺陷：第一，嗜殺質(zhì)粒的5′端通常含有共價連接蛋白，這使得體外操作更加復(fù)雜，并阻礙了其在大腸桿菌中的擴(kuò)增；第二，嗜殺質(zhì)粒中目的基因的表達(dá)通常需要特定的轉(zhuǎn)錄信號，Kamper等通過將外源基因與pGKL1中ORF2的啟動子和終止子融合構(gòu)建表達(dá)盒的方法較為理想地解決了該問題。

1.2 基因編輯策略

在代謝工程和合成生物學(xué)改造過程中，通常會涉及到多基因的遺傳修飾。因此，高效的基因編輯技術(shù)是代謝工程和合成生物學(xué)的基本工具。隨著各種高效、精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)在乳酸克魯維酵母底盤中的成功應(yīng)用，極大推動了關(guān)于乳酸克魯維酵母代謝工程和合成生物學(xué)研究的快速發(fā)展。本節(jié)對傳統(tǒng)的基因定點靶向整合技術(shù)以及應(yīng)用前景較好的CRISPR-Cas技術(shù)在乳酸克魯維酵母底盤中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

1.2.1 基因定點靶向整合技術(shù)

外源DNA片段整合到微生物底盤細(xì)胞的基因組中需要借助其雙鏈斷裂（double strand break，DSB）修復(fù)機(jī)制。目前，在真核細(xì)胞中主要有同源重組和非同源末端連接兩種修復(fù)機(jī)制。同源重組整合外源基因主要依賴于基因簇，包括、、、、和等基因，可以實現(xiàn)外源基因在底盤細(xì)胞基因組的精確定點整合；而介導(dǎo)非同源末端連接的基因主要包括、、（哺乳動物中）、和等，這可能會造成異源基因的表達(dá)盒或線性化質(zhì)粒隨機(jī)連接到底盤細(xì)胞基因組的不同位置上。在釀酒酵母細(xì)胞中，外源基因的整合更偏向于利用同源重組的修復(fù)方式，而乳酸克魯維酵母的DNA修復(fù)偏好性則與釀酒酵母完全不同，非同源末端連接是外源DNA整合到其基因組上的最常見方式。例如，在野生型乳酸克魯維酵母中，外源基因的同源臂長度為50 bp時的整合效率為0%，當(dāng)同源臂長度增加到600 bp時，整合效率提高到88%；但是，構(gòu)建過長同源臂往往費(fèi)時費(fèi)力，為了實現(xiàn)乳酸克魯維酵母細(xì)胞工廠的快速構(gòu)建，敲除介導(dǎo)異源基因非同源末端連接的基因可以提高乳酸克魯維酵母異源基因定點整合的效率。目前，乳酸克魯維酵母基因組中常用的定點整合位點是位點，NEB公司針對該位點設(shè)計了經(jīng)典的整合型質(zhì)粒pKLAC1和pKLAC2，并一直沿用至今。使用該系列質(zhì)粒時，應(yīng)首先利用限制性內(nèi)切酶II對該質(zhì)粒進(jìn)行線性化，隨后P啟動子的5’端和3’端可分別作為上下游同源臂與乳酸克魯維酵母基因組上的位點進(jìn)行同源重組，從而實現(xiàn)外源基因在乳酸克魯維酵母基因組上的高效定點靶向整合。具體過程如圖2所示。

圖2 通過同源重組機(jī)制將外源基因表達(dá)盒整合到乳酸克魯維酵母基因組LAC4位點的示意圖Fig. 2 Strategy for integrating heterologous gene expression cassettes into the LAC4 locus of K. Lactis via homologous recombination

1.2.2 CRISPR-Cas技術(shù)

2003年，Mojica等發(fā)現(xiàn)來自細(xì)菌的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR）與部分病毒序列相匹配，并推測CRISPR是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的一部分。隨后，多項研究進(jìn)一步揭示了CRISPR的功能。如今，CRISPR基因編輯技術(shù)發(fā)展十分迅速，該技術(shù)具有操作簡便、重組效率高、實驗成本低等諸多優(yōu)點，極大地提高了對各類細(xì)胞基因組的編輯效率，并且已經(jīng)在包括乳酸克魯維酵母在內(nèi)的許多生物體中得到了成功應(yīng)用。由于傳統(tǒng)方案需要利用多個篩選標(biāo)記來進(jìn)行異源基因整合陽性轉(zhuǎn)化子的篩選，因此分子操作更加復(fù)雜，耗時更長；而CRISPR-Cas系統(tǒng)工作時，sgRNA首先定位到基因組上的目標(biāo)位點，隨后引導(dǎo)Cas9蛋白對目的基因進(jìn)行切割，以實現(xiàn)目的基因的精準(zhǔn)編輯，因此操作十分簡便高效。Horwitz等在乳酸克魯維酵母中利用CRISPR-Cas技術(shù)將6 個外源基因同時整合到基因組的3 個靶向位點上，快速構(gòu)建了粘康酸的異源合成通路；Burghardt等利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)將乳酸克魯維酵母的內(nèi)源果糖轉(zhuǎn)化酶基因敲除以后，將合成低聚果糖的果糖轉(zhuǎn)移酶活性提高了66.9%。經(jīng)過對CRISPR-Cas系統(tǒng)的不斷探索，研究人員已經(jīng)實現(xiàn)了對乳酸克魯維酵母工程菌株基因組的高效編輯，與傳統(tǒng)的基因組編輯策略相比，CRISPR-Cas可以實現(xiàn)同時對多個基因的編輯。但目前CRISPR-Cas系統(tǒng)在乳酸克魯維酵母中的應(yīng)用仍有一些不足之處，如CRISPR-Cas技術(shù)對目的基因的識別依賴于前間隔片段臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列（NGG），因而存在一定的局限性。Harrington等研究發(fā)現(xiàn)Cas14蛋白在識別目的基因時不依賴于PAM序列，因此有望解決這個問題。此外，sgRNA對于Cas蛋白與目標(biāo)序列的結(jié)合有至關(guān)重要的作用，不同的sgRNA特異性和穩(wěn)定性在微生物底盤中的差異巨大，且容易造成脫靶和效率低等問題。為了解決這一問題，Guo Jiahui等在大腸桿菌中通過對約70 000 個sgRNA的活性及效率等指標(biāo)進(jìn)行分析，建立了一個較為全面的sgRNA圖譜，可以針對該模式微生物基因組上的任何位點選擇具有高度活性的sgRNA，有助于提高sgRNA的特異性及解決脫靶問題。總之，雖然CRISPR-Cas技術(shù)已成功用于對乳酸克魯維酵母基因組的編輯，但該技術(shù)尚未在乳酸克魯維酵母中得到廣泛應(yīng)用，因此也展現(xiàn)出相當(dāng)大的應(yīng)用潛力和發(fā)展空間。隨著對CRISPR-Cas系統(tǒng)的不斷優(yōu)化，在乳酸克魯維酵母底盤細(xì)胞中進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)將變得更加快捷和高效。

1.3 常用宿主菌

和釀酒酵母相同，乳酸克魯維酵母也是雌雄異體菌株，有兩種交配類型：a和α。目前常用的乳酸克魯維酵母菌株主要有NRRL Y-1140（CBS 2359、ATCC 8585）、NRRL Y-I118（CBS 6315、ATCC 8563）和NRRL Y-1205（CBS 2360、ATCC 8651）。其中，NRRL Y-1140是應(yīng)用最廣泛的菌株，酵母中常用的嗜殺質(zhì)粒pGKLl和pGKL2也是在該菌株中被首次發(fā)現(xiàn)。NRRL Y-1205是一種自然變異菌株，細(xì)胞內(nèi)含有一個隱性的等位基因，在正常培養(yǎng)條件下，該菌株沒有明顯的生長缺陷；但是當(dāng)細(xì)胞呼吸功能被線粒體抑制劑阻斷時，該菌株就不能在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上正常生長。研究證明，在其他乳酸克魯維酵母菌株如CBS 141、CBS 5618和CBS 8043中也具有類似功能的等位基因。表3列出了目前分子遺傳學(xué)和合成生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的乳酸克魯維酵母宿主/底盤菌株。

表3 常用的乳酸克魯維酵母宿主菌株Table 3 Most commonly used host strains of K. lactis

2 利用合成生物學(xué)技術(shù)改造乳酸克魯維酵母生產(chǎn)高值產(chǎn)品的應(yīng)用實例

乳酸克魯維酵母具有外源蛋白表達(dá)量高的明顯優(yōu)勢，因此是外源基因/生物合成途徑表達(dá)的優(yōu)良宿主/底盤細(xì)胞。在過去30 年里，已有上百種重組蛋白在乳酸克魯維酵母底盤中實現(xiàn)了異源表達(dá)，并有多種蛋白已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。本節(jié)對近年來以乳酸克魯維酵母底盤細(xì)胞所構(gòu)建的細(xì)胞工廠生產(chǎn)蛋白質(zhì)和其他高附加值產(chǎn)品的實例進(jìn)行總結(jié)。

2.1 已工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品

荷蘭帝斯曼公司利用乳酸克魯維酵母作為細(xì)胞工廠已經(jīng)成功實現(xiàn)了多種胞內(nèi)蛋白和外泌蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。例如，乳酸克魯維酵母產(chǎn)生的蛋白酶能分解乳糖，因此可以用于乳產(chǎn)品的生產(chǎn)；乳酸克魯維酵母產(chǎn)生的-半乳糖苷酶主要用于生產(chǎn)不含乳糖的乳制品和益生元低聚半乳糖，乳酸克魯維酵母生產(chǎn)的-半乳糖苷酶已經(jīng)在各大公司得到大規(guī)模生產(chǎn)并分別被命名為Maxilact（荷蘭帝斯曼公司）、Lactase（意大利SNAM Progetti公司）、Biolactase（荷蘭Quest International公司）和-Galactosidase（美國Sigma-Aldrich公司）等上市。

2.2 乳酸克魯維酵母在制藥產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用潛力

到目前為止，乳酸克魯維酵母已被證明是大規(guī)模生產(chǎn)藥物及其中間體的優(yōu)良底盤細(xì)胞，因此在制藥產(chǎn)業(yè)中展現(xiàn)出非常大的應(yīng)用潛力。例如，干擾素β是一種與細(xì)胞抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子，是一種治療多發(fā)性硬化癥的有效藥物。Madhavan等將來自人的干擾素β基因與葡萄糖淀粉酶信號序列融合，克隆到pKLAC1載體中后再導(dǎo)入乳酸克魯維酵母基因組中進(jìn)行生產(chǎn)，并通過對HeLa細(xì)胞進(jìn)行抗增殖實驗驗證了其生物活性；巨噬細(xì)胞刺激因子是一種用于治療造血系統(tǒng)疾病的藥用蛋白，Hua Zhongsheng等在乳酸克魯維酵母中表達(dá)了人屬巨噬細(xì)胞刺激因子cDNA的截短片段，并成功純化出了具有活性的蛋白。此外，乳酸克魯維酵母還被用于生產(chǎn)治療糖尿病的胰島素前體、-乳球蛋白、白細(xì)胞介素1β、人血清白蛋白和其他各種抗體。乳酸克魯維酵母成功表達(dá)異源藥用蛋白大大促進(jìn)了制藥產(chǎn)業(yè)向新方向發(fā)展，必將成為藥用蛋白的優(yōu)秀生產(chǎn)菌株。

2.3 其他高值產(chǎn)品的生產(chǎn)

乳酸克魯維酵母除了以上在蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用以外，其在其他高值產(chǎn)物的生產(chǎn)上同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，-乳酸是被用于生產(chǎn)可降解聚合材料的平臺化學(xué)品，Porro等在乳酸克魯維酵母基因組中引入了來自牛的乳酸脫氫酶基因，同時敲除了內(nèi)源的丙酮酸脫羧酶基因，使工程菌株成功發(fā)酵產(chǎn)生了高純度的乳酸，通過生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)，工程菌株中乳酸的終產(chǎn)量達(dá)到了109 g/L。與釀酒酵母相比，丙酮酸脫羧酶基因的敲除對乳酸克魯維酵母的生長沒有明顯的影響，因此利用該優(yōu)勢，通過乳酸生成途徑代替乙醇生成途徑，既成功生產(chǎn)出乳酸，又降低了乙醇產(chǎn)生對乳酸純度的影響；同時也從側(cè)面證明了該酵母對低pH值條件有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在低pH值的高值產(chǎn)品生產(chǎn)方面也有很大的潛力。乙醇酸是一種優(yōu)良的可降解生物材料，Koivistoinen等利用代謝工程及合成生物學(xué)技術(shù)對乳酸克魯維酵母進(jìn)行改造，先引入乙醛酸還原酶，成功實現(xiàn)了乙醇酸在乳酸克魯維酵母中的生產(chǎn)，隨后敲除了內(nèi)源的蘋果酸合酶和異檸檬酸脫氫酶基因來改造該酵母的乙醛酸循環(huán)途徑，最終將目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提高至2 g/L，然后通過生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，最終使乳酸克魯維酵母中乙醇酸的產(chǎn)量達(dá)到了15 g/L。該研究也對釀酒酵母進(jìn)行了同樣的代謝改造，然而乳酸克魯維酵母工程菌株乙醇酸的產(chǎn)量卻遠(yuǎn)高于釀酒酵母（0.9 g/L），這可能也與乳酸克魯維酵母對低pH值有較強(qiáng)的適應(yīng)性有關(guān)。-抗壞血酸在植物中通常由葡萄糖經(jīng)10 步反應(yīng)生成，Rosa等利用代謝工程及合成生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了能夠生產(chǎn)-抗壞血酸的乳酸克魯維酵母工程菌，首先通過引入來自黑曲霉的鳥苷二磷酸-甘露糖-3,5-異構(gòu)酶、鳥苷二磷酸--半乳糖-磷酸化酶和-半乳糖-1-磷酸鹽磷酸化酶3 種途徑酶，成功將-半乳糖轉(zhuǎn)化為-抗壞血酸，工程菌株中-抗壞血酸的終產(chǎn)量達(dá)到了30 mg/L。此外，研究人員也開發(fā)了可以將低值底物轉(zhuǎn)化為高值產(chǎn)品的乳酸克魯維酵母細(xì)胞工廠，如將-木糖作為底物來生產(chǎn)-木糖酸，利用乳糖為底物生產(chǎn)阿拉伯糖醇等。

乳酸克魯維酵母底盤生產(chǎn)高值產(chǎn)品的部分代表性實例如表4所示。

表4 乳酸克魯維酵母底盤生產(chǎn)高值產(chǎn)品的部分代表性實例Table 4 Representative examples of high-value products produced by engineered K. lactis

3 結(jié) 語

隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，微生物細(xì)胞工廠的深入探索與應(yīng)用必將成為生物制造的新趨勢。乳酸克魯維酵母是一種十分重要的非常規(guī)酵母，其在形態(tài)特征、生理特性以及遺傳代謝等方面與常規(guī)酵母——釀酒酵母均有較大差異，其中最明顯的區(qū)別是乳酸克魯維酵母可以利用廉價的乳清作為唯一碳源進(jìn)行生長。此外，乳酸克魯維酵母并不受克雷布特效應(yīng)的影響，所以非常適合大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)。因此，該酵母在微生物基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面都具有非常大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本文主要對目前乳酸克魯維酵母中常用的合成生物學(xué)元件（啟動子、終止子、信號序列、選擇標(biāo)記和質(zhì)粒載體等）、最新的基因編輯策略以及以乳酸克魯維酵母為底盤細(xì)胞生產(chǎn)高值產(chǎn)品的應(yīng)用實例進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)。今后最需要關(guān)注的熱點問題包括以下幾點：第一，啟動子和終止子是目前控制基因表達(dá)最重要、最有效的功能元件。乳酸克魯維酵母中目前最常用的啟動子和終止子分別是內(nèi)源的-半乳糖苷酶基因啟動子P和終止子t，而關(guān)于人工啟動子和終止子在乳酸克魯維酵母底盤中的理論及應(yīng)用研究還十分缺乏。因此，要實現(xiàn)外源基因/產(chǎn)物的穩(wěn)定高效表達(dá)，人工啟動子和終止子工程的聯(lián)合開發(fā)與應(yīng)用可能是將來的研究重點。第二，隨著先進(jìn)基因編輯技術(shù)如CRISPR-Cas在乳酸克魯維酵母底盤中的快速發(fā)展及應(yīng)用，未來乳酸克魯維酵母工程菌株的開發(fā)速度將大大提高。要真正實現(xiàn)乳酸克魯維酵母細(xì)胞工廠的快速構(gòu)建，解決CRISPR-Cas系統(tǒng)對PAM序列的依賴性和脫靶問題仍是將來的研究重心。第三，目前乳酸克魯維酵母細(xì)胞工廠的最主要應(yīng)用仍然集中在工業(yè)蛋白的生產(chǎn)上，但是利用其生產(chǎn)大宗化學(xué)品、精細(xì)化學(xué)品和天然產(chǎn)物等高值產(chǎn)物的研究仍然較少。隨著乳酸克魯維酵母合成生物學(xué)元件的不斷開發(fā)和基因編輯策略的不斷優(yōu)化，一定會有更多高附加值產(chǎn)品在乳酸克魯維酵母底盤中實現(xiàn)高效生產(chǎn)。此外，實驗室適應(yīng)性進(jìn)化是一種較為有效的優(yōu)良菌株構(gòu)建策略，利用實驗室適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)與理性的合成生物學(xué)設(shè)計相結(jié)合，在基因組水平進(jìn)行多位點同時編輯或連續(xù)進(jìn)化已被證明具有可行性。由于乳酸克魯維酵母底盤天然具有的轉(zhuǎn)化廉價碳源底物的能力，該方案勢必會極大地推動綠色清潔、可持續(xù)發(fā)展的乳酸克魯維酵母細(xì)胞工廠的構(gòu)建；該酵母也勢必將成為未來工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展中優(yōu)良的工業(yè)微生物細(xì)胞工廠。