鐵蛋白納米載體在營(yíng)養(yǎng)與健康領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

劉 博，張晨曦，臧佳辰，呂晨艷，張 拓,2,*，趙廣華

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品功能膠體與軟物質(zhì)研究中心，北京 100083）

鐵蛋白是廣泛存在于生物體中的一種鐵儲(chǔ)藏蛋白，其主要生物學(xué)功能有兩種：一是將二價(jià)鐵離子轉(zhuǎn)化成可溶無(wú)毒且生物可利用的三價(jià)鐵形式并儲(chǔ)存于蛋白質(zhì)內(nèi)部空腔，調(diào)節(jié)鐵代謝平衡；二是清除亞鐵離子介導(dǎo)的自由基反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化性損傷。天然的鐵蛋白由蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)部鐵核兩部分組成，外殼是由24 個(gè)相同或不同的亞基構(gòu)成的具有高度對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中空籠狀蛋白質(zhì)分子，鐵核則是由大量氫氧化鐵和磷酸鹽組成。在無(wú)氧條件下可利用還原反應(yīng)將鐵核去除，從而制備得到具有內(nèi)部空腔的脫鐵鐵蛋白外殼。鐵蛋白的籠狀外殼非常穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的酸堿耐受性（pH 2.0～12.0）以及熱穩(wěn)定性（蛋白質(zhì)變性溫度為70～80 ℃）。鐵蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由亞基間的氫鍵和疏水作用維持，故可以通過(guò)物理化學(xué)的手段將其亞基解離及重新組裝，其可逆的解離重組特性為鐵蛋白納米籠作為包埋外殼以及遞送載體的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

由于鐵蛋白納米籠獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的理化性質(zhì)和良好的生物相容性，其內(nèi)部空腔被廣泛地用于封裝無(wú)機(jī)或有機(jī)客體分子，應(yīng)用于食品營(yíng)養(yǎng)、生物醫(yī)藥與納米材料等領(lǐng)域。鐵蛋白作為納米載體具有以下優(yōu)勢(shì)：第一，鐵蛋白封裝納米顆粒尺寸較小且均一性好，一般為12 nm左右。第二，生理?xiàng)l件下，鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)或血液中具有良好的溶解性和穩(wěn)定性。第三，鐵蛋白在特定條件（如強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿）下可解離成單亞基，而當(dāng)恢復(fù)至生理環(huán)境時(shí)，鐵蛋白又可以重新組裝成籠形結(jié)構(gòu)且性質(zhì)不變。利用這種可逆自組裝特性，客體分子可以容易地被包埋進(jìn)內(nèi)部空腔中。第四，鐵蛋白的界面位置容易進(jìn)行遺傳或化學(xué)修飾以賦予其他功能性。目前為止，鐵蛋白已被廣泛用于包埋花青素、姜黃素、蘆丁等多種食品營(yíng)養(yǎng)素以提高其水溶性、穩(wěn)定性以及細(xì)胞吸收率，利用鐵蛋白裝載抗癌藥物、造影劑等成分可用于實(shí)現(xiàn)藥物的靶向傳遞、細(xì)胞成像以及腫瘤治療等研究。此外，由于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)單一，鐵蛋白也被科學(xué)家們廣泛用于人工設(shè)計(jì)制造不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)的新型籠形蛋白，這極大拓展了鐵蛋白作為納米載體的應(yīng)用范圍。本篇綜述對(duì)鐵蛋白分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，并重點(diǎn)介紹其作為納米載體應(yīng)用于食品科學(xué)、營(yíng)養(yǎng)健康及醫(yī)藥成像等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)

1.1 鐵蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征

不同來(lái)源鐵蛋白的亞基種類與氨基酸組成有一定差異，但其空間結(jié)構(gòu)具有很高的保守性。典型的鐵蛋白結(jié)構(gòu)是由24 個(gè)相同或相似的亞基自組裝形成的一種中空籠狀分子，內(nèi)外徑分別約為8 nm和12 nm。鐵蛋白亞基的外形近似圓柱體，長(zhǎng)、寬分別約5.0、2.5 nm。亞基結(jié)構(gòu)由1 個(gè)兩兩成反向平行的螺旋簇（A、B和C、D螺旋）和1 個(gè)較短螺旋（E螺旋）組成，B和C螺旋之間由一段被稱為BC-環(huán)的氨基酸鏈連接，E螺旋位于螺旋簇的尾端并與之成60°夾角（圖1A）。鐵蛋白亞基的氨基端、BC-環(huán)、A螺旋和C螺旋構(gòu)成鐵蛋白的外表面，B螺旋和D螺旋則位于內(nèi)表面。鐵蛋白內(nèi)表面富含谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸殘基，因此在pH值為中性的條件下，鐵蛋白內(nèi)表面具有較高的負(fù)電荷密度，而外表面的凈電荷接近于零或略帶正電荷。

鐵蛋白分子具有3 種化學(xué)性質(zhì)不同的活性界面：內(nèi)表面、外表面、亞基間界面（圖1B），而這3 種界面均可通過(guò)化學(xué)和基因手段進(jìn)行修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)鐵蛋白的功能調(diào)控?；瘜W(xué)修飾指將染料分子、猝滅劑等功能性小分子與鐵蛋白特定氨基酸進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，基因修飾是定點(diǎn)突變、添加或刪除特定氨基酸改變鐵蛋白的基因序列。鐵蛋白外表面偶聯(lián)修飾一些官能團(tuán)可賦予其發(fā)光成像等特性，內(nèi)表面主要是作為納米反應(yīng)器合成無(wú)機(jī)納米材料或用于包埋活性營(yíng)養(yǎng)小分子，亞基間界面則可用于調(diào)控鐵蛋白分子的解離重組以及設(shè)計(jì)新型籠狀蛋白。通過(guò)對(duì)這3 種活性界面的修飾和改造，可以拓展鐵蛋白分子應(yīng)用空間。

作為一種典型的籠形蛋白，鐵蛋白分子通過(guò)亞基界面之間的復(fù)雜而精確的作用力自組裝形成具有高度對(duì)稱性的四級(jí)結(jié)構(gòu)。參與鐵蛋白籠狀結(jié)構(gòu)組裝的亞基間界面包括C、C、C以及C-C界面，其中C和C-C界面是維持亞基間相互作用的主要區(qū)域（圖1C）。一般認(rèn)為鐵蛋白的亞基先形成1 個(gè)反向平行的二聚體，之后二聚體形成鐵蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)，若把二聚體當(dāng)作1 個(gè)面，鐵蛋白則為一種呈4-3-2點(diǎn)對(duì)稱的菱形十二面體。該十二面體上沿二、三、四重旋轉(zhuǎn)軸分別為鐵蛋白亞基與亞基之間組成的12 個(gè)二重軸通道、8 個(gè)三重軸通道、6 個(gè)四重軸通道。其中鐵蛋白的三重軸通道和四重軸通道的孔徑在0.3～0.5 nm之間，起到連接內(nèi)部空腔和外部環(huán)境的作用。金屬離子和帶正電荷的小于鐵蛋白通道孔徑的有機(jī)小分子可以通過(guò)靜電吸引擴(kuò)散到空腔中，但大分子由于空間位阻則不能通過(guò)鐵蛋白通道進(jìn)入內(nèi)部空腔。

圖1 鐵蛋白結(jié)構(gòu)特征Fig. 1 Structural characteristics of ferritin

1.2 不同來(lái)源天然鐵蛋白特征

動(dòng)物鐵蛋白通常由功能差異很大的H型（重鏈，分子質(zhì)量約為21 kDa）和L型（輕鏈，分子質(zhì)量約為19.5 kDa）兩種亞基組成。H型亞基包含1 個(gè)亞鐵氧化中心，可將二價(jià)鐵離子氧化成三價(jià)鐵離子。1 個(gè)亞鐵氧化中心能夠同時(shí)結(jié)合2 個(gè)二價(jià)鐵離子，亞鐵氧化中心包含2 個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，A位點(diǎn)由Glu27、Glu61、Glu62、His65和Glu107 5 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，B位點(diǎn)由Tyr34和Gln141兩個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。L型亞基不具備氧化亞鐵離子的功能，但其具有1 個(gè)成核中心，負(fù)責(zé)將氧化后的三價(jià)鐵離子轉(zhuǎn)化為礦化核。鐵蛋白H和L亞基的比例在不同器官和組織中有所區(qū)別，腦、心臟等代謝旺盛的器官中鐵蛋白富含H亞基，而脾臟和肝臟等器官中鐵蛋白L亞基比例較高。H和L亞基可分別專一識(shí)別人體細(xì)胞的表面受體，一種是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）1，特異性識(shí)別鐵蛋白H型亞基；另一種是清道夫A類受體5號(hào)蛋白，負(fù)責(zé)識(shí)別結(jié)合鐵蛋白L型亞基。

植物鐵蛋白的24 個(gè)亞基均為具有亞鐵氧化中心的H型亞基，其氨基酸組成與動(dòng)物鐵蛋白H型亞基相似度約為40%。從豌豆、大豆、黑豆、玉米、苜蓿和擬南芥等植物體中分離得到的植物鐵蛋白都是由H-1亞基（26.5 kDa）和H-2亞基（28.0 kDa）以不同的比例組成，H-1與H-2亞基氨基酸序列同源性為80%。成熟的植物鐵蛋白亞基N端位于蛋白殼的外表面具有一段特殊的延伸肽段（extension peptide，EP肽段）。重組大豆鐵蛋白4的晶體結(jié)構(gòu)表明，EP肽段通過(guò)與殼表面相鄰亞基相互作用穩(wěn)定植物鐵蛋白的整體結(jié)構(gòu)。一方面，EP肽段具有二價(jià)亞鐵離子氧化能力；另一方面，EP肽段還具有絲氨酸蛋白酶活性，能夠調(diào)控鐵蛋白的自降解，也與鐵離子的還原釋放過(guò)程有關(guān)。不同于動(dòng)物鐵蛋白疏水性四重軸通道，植物鐵蛋白的四重軸是由組氨酸組成的親水性通道，研究表明植物鐵蛋白的三重軸和四重軸親水通道均為鐵離子進(jìn)出的主要通道。

細(xì)菌鐵蛋白（bacterioferritin，BFR）亞基結(jié)構(gòu)與動(dòng)植物鐵蛋白類似，且具有亞鐵氧化中心，但不同點(diǎn)在于細(xì)菌鐵蛋白是一種亞基均聚物。目前在原核生物中發(fā)現(xiàn)的鐵蛋白有3 類：第一類是與動(dòng)物鐵蛋白的H亞基結(jié)構(gòu)相似的典型鐵蛋白（canonical ferritin，F(xiàn)TN）；第二類是結(jié)合血紅素的BFR；第三類是DNA結(jié)合蛋白Dps。大多數(shù)FTN具有典型的正八面體4-3-2對(duì)稱結(jié)構(gòu)，且具備鐵氧化還原中心。與FTN不同，結(jié)合血紅素的BFR包含12 個(gè)血紅素，通過(guò)亞基二聚體中間界面的兩個(gè)甲硫氨酸殘基與血紅素結(jié)合。研究表明，大腸桿菌和銅綠假單胞菌鐵蛋白中的血紅素雖然不是鐵氧化沉淀或籠狀組裝所必需，但對(duì)于鐵還原釋放有顯著作用。Dps蛋白又稱小鐵蛋白，由12 個(gè)亞基組成1 個(gè)2-3對(duì)稱的籠形結(jié)構(gòu)，內(nèi)徑約為4.5 nm，外徑約為9 nm。除此之外，科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的BFR：來(lái)自火焰色古生菌的鐵蛋白（ferritin，AfFtn）以一種獨(dú)特的方式組裝成呈四面體2-3對(duì)稱的籠狀結(jié)構(gòu)，表面有4 個(gè)直徑約45 ?的大孔。AfFtn和海棲熱袍菌鐵蛋白在低離子強(qiáng)度下以亞基二聚體形式存在，通過(guò)添加特定的礦物離子可重新組裝為24聚體結(jié)構(gòu)。

1.3 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)改造

由于天然蛋白質(zhì)的尺寸和形狀比較單一，限制了其應(yīng)用范圍。于是科學(xué)家們通過(guò)人工設(shè)計(jì)構(gòu)建新型鐵蛋白納米籠。鐵蛋白分子4 種亞基間界面對(duì)鐵蛋白籠狀結(jié)構(gòu)的形成非常重要，其中C-C界面的表面積最大，其次是C、C和C界面。Zhang Shengli等通過(guò)在C-C界面關(guān)鍵位置插入或者刪除氨基酸使24聚體鐵蛋白分別轉(zhuǎn)變?yōu)?6聚體和48聚體籠形鐵蛋白（圖2A）。16聚體鐵蛋白由兩個(gè)相似的8聚體通過(guò)疏水作用連接在一起，形成扁球形中空結(jié)構(gòu)。48聚體鐵蛋白的外徑則擴(kuò)大為17 nm，其內(nèi)部空腔容量大約是原來(lái)的4.3 倍，但在溶液條件下48聚體不穩(wěn)定，會(huì)轉(zhuǎn)化為直徑約為10 nm的碗狀8聚體鐵蛋白。之后Zang Jiachen等以上述碗狀8聚體鐵蛋白為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵為作用力，分別成功將其轉(zhuǎn)化為3 種新型的籠形蛋白：籠形24聚體（外徑12 nm）、橢圓16聚體（長(zhǎng)軸10 nm、短軸8 nm）以及籠形48聚體（外徑17 nm）（圖2B）。而當(dāng)完全消除鐵蛋白的C-C界面，即刪除鐵蛋白亞基羧基端49 個(gè)殘基時(shí)，鐵蛋白將轉(zhuǎn)化為8聚體納米環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖2C）。該納米環(huán)內(nèi)壁僅由B螺旋組成，而其外壁由A螺旋、C螺旋和BC-環(huán)組成，其高度為5.1 nm，內(nèi)外徑分別為3.2 nm和7 nm。

圖2 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)改造Fig. 2 Structural transformation of ferritin

除了重新設(shè)計(jì)界面作用力得到更多不同尺寸形狀的新型鐵蛋白外，對(duì)于鐵蛋白分子內(nèi)組裝調(diào)控的研究也取得了成功。Huard等通過(guò)改造鐵蛋白C界面使得鐵蛋白的自組裝可以通過(guò)二價(jià)銅離子的結(jié)合來(lái)進(jìn)行控制。而Gu Chunkai等通過(guò)將組氨酸結(jié)構(gòu)域插入到鐵儲(chǔ)藏蛋白C界面處，成功制備得到一種新型4聚體鐵蛋白，鎳、銅以及鋅等過(guò)渡金屬離子在接近中性條件下可以誘導(dǎo)其重新自組裝成24聚體籠形蛋白，而加入螯合劑后籠形蛋白又可重新解離成4聚體，該研究也為鐵蛋白在中性條件下包埋生物活性物質(zhì)提供了良好的應(yīng)用模型。

2 鐵蛋白在食品營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 礦質(zhì)元素載體

鐵是生物體必需的微量元素之一，而缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA）則是世界范圍內(nèi)最為普遍的一種營(yíng)養(yǎng)素缺乏癥，嚴(yán)重影響著人類的營(yíng)養(yǎng)與健康，其主要原因在于鐵攝入不足或過(guò)量消耗，因此科學(xué)家們?cè)诓粩嗵剿鞲咝野踩难a(bǔ)鐵制劑。目前，市場(chǎng)上常見(jiàn)的補(bǔ)鐵劑主要是以硫酸亞鐵或葡萄糖酸亞鐵為代表，該類補(bǔ)劑雖然鐵含量高、價(jià)格便宜，但性質(zhì)不穩(wěn)定且易受到食物其他組分的影響，同時(shí)會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定副作用，如腹瀉、嘔吐、生長(zhǎng)遲緩等。天然植物鐵蛋白特別是豆科類種子中的鐵蛋白，由于其廣泛來(lái)源以及豐富的鐵含量受到了科學(xué)家的關(guān)注，被認(rèn)為是一種新型天然膳食的補(bǔ)鐵因子。得益于蛋白質(zhì)外殼的保護(hù)，植物鐵蛋白的鐵不容易受到膳食中螯合劑如植酸和單寧酸的影響。在豆科類種子中，90%以上的鐵元素以鐵蛋白的形式貯存在淀粉質(zhì)體中，研究者比較了大鼠對(duì)硫酸亞鐵與分離提取的大豆鐵蛋白的鐵吸收效果后發(fā)現(xiàn)，兩組之間沒(méi)有顯著性差異，故大豆鐵蛋白中的鐵能被人體很好地吸收，具有與硫酸亞鐵相似的補(bǔ)鐵功效。鐵蛋白可以抑制亞鐵離子自氧化生成具有毒副作用的活性氧， 具有去毒作用，蛋白可作為一種植物來(lái)源的新型補(bǔ)鐵制劑。

鈣是人體含量最為豐富的無(wú)機(jī)元素，參與體內(nèi)多種生理過(guò)程，對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)健康起著重要作用。目前我國(guó)缺鈣現(xiàn)象仍然普遍，市場(chǎng)上補(bǔ)鈣制劑主要分為無(wú)機(jī)鈣、生物活性鈣、有機(jī)鈣以及氨基酸螯合鈣等，這些鈣制劑均存在一定的應(yīng)用缺陷，隨后以多肽或蛋白質(zhì)為主要配體的鈣制劑迅速發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)鈣或其他礦物元素可以通過(guò)肽轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制或蛋白質(zhì)的特異性受體被小腸細(xì)胞所吸收。雖然乳制品是生物可利用鈣的良好來(lái)源，但不適合于素食主義者等人群，因此開(kāi)發(fā)植物來(lái)源蛋白質(zhì)為載體的補(bǔ)鈣制劑尤為重要。為解決上述問(wèn)題，研究人員將鈣離子裝載進(jìn)植物鐵蛋白空腔中，制備得到鐵蛋白鈣復(fù)合物。細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物鐵蛋白能夠保護(hù)鈣離子不受膳食抑制因子如草酸、單寧酸的干擾。此外，與已知的二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal-ion transporter-1，DMT1）介導(dǎo)的二價(jià)金屬離子吸收途徑不同，細(xì)胞可通過(guò)新的TfR1參與途徑吸收鐵蛋白-鈣復(fù)合物，故鐵蛋白包裹的鈣離子不會(huì)干擾其他二價(jià)金屬離子的吸收。隨后，鋅、銅、硒等多種礦物元素被裝載到鐵蛋白空腔已得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其特殊的中空結(jié)構(gòu)和籠形的蛋白質(zhì)外殼可以克服金屬離子溶解度低以及易受外界環(huán)境干擾的缺點(diǎn)，顯著提高礦質(zhì)元素的生物利用率。綜上所述，鐵蛋白作為礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素載體具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包埋

食品中存在著許多高生物活性小分子，如-胡蘿卜素、姜黃素、蘆丁、花青素、葉黃素、原花青素等，這些物質(zhì)被認(rèn)為具有抗氧化、抗癌和抗炎癥等生物活性，對(duì)于人體健康具有較大促進(jìn)功能。然而這些化合物大多對(duì)于環(huán)境條件十分敏感，如水不溶性或光、熱不穩(wěn)定性等，這極大限制了其在營(yíng)養(yǎng)和人類健康領(lǐng)域的應(yīng)用，因此克服這些限制因素顯得至關(guān)重要。近年來(lái)，動(dòng)植物鐵蛋白在食品科學(xué)和營(yíng)養(yǎng)健康領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，科學(xué)家們利用鐵蛋白受pH值控制的可逆解離組裝特性來(lái)包埋各種水溶性或脂溶性活性營(yíng)養(yǎng)素。這一方法簡(jiǎn)單易行且環(huán)境友好，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)包埋后營(yíng)養(yǎng)小分子的水溶性、光熱穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取活性明顯優(yōu)于游離狀態(tài)，鐵蛋白分子同時(shí)還能防止包埋物質(zhì)受到食品中其他成分的干擾。

2.2.1 水溶性活性物質(zhì)包埋

花青素屬于類黃酮類物質(zhì)，是一種重要的水溶性植物色素，水果、蔬菜等豐富的色彩大部分與之有關(guān)。花青素是一種強(qiáng)抗氧化劑，能夠保護(hù)人體免受自由基的損傷，還能夠增強(qiáng)血管彈性、抑制炎癥和過(guò)敏，在食品中不但可作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，而且還可作為著色劑應(yīng)用于飲料產(chǎn)品中。然而在商品加工和貯存過(guò)程中，溫度、氧氣、光和酶等因素嚴(yán)重影響著花青素的穩(wěn)定性，通過(guò)與各種有機(jī)酸?；⒆跃喓系确椒m然可以達(dá)到穩(wěn)定花青素的作用，然而對(duì)花青素的保護(hù)仍非常有限。矢車菊素-3--葡萄糖苷（cyanidin-3--glucoside，C3G）是桑椹花青素的主要成分之一，利用pH值介導(dǎo)鐵蛋白解離重組的方法可以將C3G包裹在重組大豆鐵蛋白的空腔內(nèi)，研究結(jié)果顯示平均1 個(gè)鐵蛋白內(nèi)部空腔可以裝載約37.5 個(gè)C3G分子，包埋后C3G分子的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性提高了約2 倍。更重要的是，將C3G分子包埋在鐵蛋白空腔中可以顯著提高C3G的小腸吸收效率。

原花青素屬于多酚類物質(zhì)，廣泛存在于各種植物中，其中以葡萄籽中原花青素含量最為豐富，提取率可達(dá)到9.5%。作為一種國(guó)際公認(rèn)的抗氧化劑，原花青素還具有降血脂、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，故被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品等領(lǐng)域。由于其酚羥基的結(jié)構(gòu)在加工和貯存過(guò)程中容易受到溫度、氧氣和光照的影響，且在胃腸道運(yùn)輸中原花青素可能會(huì)發(fā)生降解從而降低其生物利用率，這些因素嚴(yán)重限制了原花青素在食品與醫(yī)藥行業(yè)上的應(yīng)用。利用鐵蛋白pH值介導(dǎo)的可逆組裝特性，原花青素被成功裝載于鐵蛋白空腔中，包埋率為23.2%，并且與游離的原花青素相比，原花青素在鐵蛋白納米籠中的光和熱穩(wěn)定性顯著提高。體外消化實(shí)驗(yàn)表明鐵蛋白納米籠能延長(zhǎng)原花青素在胃腸道的釋放時(shí)間。

2.2.2 脂溶性活性物質(zhì)包埋

姜黃素是從植物姜黃的根莖中分離出的活性成分，具有防腐和抗氧化作用。作為天然著色劑，姜黃素不會(huì)產(chǎn)生毒副作用且可以預(yù)防和治療多種炎癥疾病以及具備潛在的抗癌功能。但是姜黃素生物利用率低，水溶性差，溫度、pH值、光照、氧氣等外界因素都會(huì)影響其穩(wěn)定性進(jìn)而降低活性。研究人員利用鐵蛋白在不同pH值條件下的可逆組裝特性，將其包埋于人重鏈鐵蛋白內(nèi)部空腔中，平均1 個(gè)鐵蛋白分子可以裝載約14.7 個(gè)姜黃素分子，包埋率和裝載率分別為14.7%和1.07%。經(jīng)鐵蛋白包埋后姜黃素的水溶性從11 ng/mL增加到5 415 ng/mL，光熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明姜黃素的降解抑制率可達(dá)64.99%～69.10%。研究認(rèn)為鐵蛋白包埋生物活性營(yíng)養(yǎng)分子實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性的顯著提高得益于鐵蛋白的性質(zhì)，一方面來(lái)自于鐵蛋白外殼的物理和化學(xué)的雙重保護(hù)作用，鐵蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性，其籠狀結(jié)構(gòu)作為物理壁壘不僅隔絕了溫度，還能夠減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與外部的氧化劑分子相互作用，鐵蛋白的半胱氨酸殘基和其他官能團(tuán)作為潛在的抗氧化劑還能夠提供化學(xué)保護(hù)作用。另一方面是鐵蛋白內(nèi)部空腔可以通過(guò)疏水作用、范德華力或氫鍵等弱相互作用與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成復(fù)合物，有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)負(fù)載于內(nèi)部空腔的穩(wěn)定性。

葉黃素屬于類胡蘿卜素家族，是一種重要的天然植物色素，在蔬菜水果中廣泛存在。葉黃素安全無(wú)毒、提取方便，且在保護(hù)視力、預(yù)防心腦血管疾病、抑制腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要作用，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。葉黃素的穩(wěn)定性很差，主要易受氧氣、光照、加熱、pH值等因素的影響，如熱處理過(guò)程可引起葉黃素產(chǎn)生異構(gòu)化，此外水不溶性、生物利用度低等性質(zhì)也嚴(yán)重限制了其實(shí)際應(yīng)用。研究人員以大豆鐵蛋白和殼聚糖為材料，通過(guò)鐵蛋白受pH值控制的可逆解離重組特性和鐵蛋白與殼聚糖的相互作用，制備出一種殼聚糖-大豆鐵蛋白-葉黃素的復(fù)合材料。包埋結(jié)果顯示每個(gè)鐵蛋白包埋約25.2 個(gè)葉黃素分子，包埋率和裝載率分別為16.8%和2.50%，與游離葉黃素相比，復(fù)合物的光、熱穩(wěn)定性均有較大提高。此外，由于鐵蛋白的包埋和與殼聚糖的結(jié)合，復(fù)合物在模擬胃腸道消化過(guò)程中葉黃素的釋放時(shí)間延長(zhǎng)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)食物成分對(duì)葉黃素的釋放有不同的影響，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、葡萄籽原花青素和牛奶對(duì)葉黃素的釋放有抑制作用，而果膠對(duì)葉黃素的釋放有促進(jìn)作用。

2.2.3 鐵蛋白包埋策略的改良

以上結(jié)果表明，鐵蛋白作為一種納米載體在脂溶性以及水溶性活性營(yíng)養(yǎng)成分包埋與遞送具有廣闊應(yīng)用前景。然而，天然蛋白納米籠對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分子的包埋存在以下缺陷：一是傳統(tǒng)的酸堿、變性劑促使解離重組的包埋方法（pH值低于2.0或高于12.0、8.0 mol/L尿素處理）會(huì)對(duì)鐵蛋白分子造成一定的損傷，一部分蛋白質(zhì)無(wú)法重新組裝成完整的籠狀結(jié)構(gòu)；二是包埋的條件可能無(wú)法維持活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的穩(wěn)定性，從而影響包埋物質(zhì)的生物活性。針對(duì)上述不足，科學(xué)家們開(kāi)始研究探索不同的處理方法，使鐵蛋白分子能在較為溫和的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行活性物質(zhì)的包埋。目前為止，各種改進(jìn)的包埋策略已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，可以總結(jié)為3 類：第一類是通過(guò)物理處理或定向改造鐵蛋白納米籠使其能在pH值更為溫和的條件下解離（圖3A）；第二類是不破壞蛋白的籠狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)改變通道特性將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包埋進(jìn)鐵蛋白空腔之中（圖3B）；第三類則是制備能在中性pH值條件下存在的鐵蛋白低聚體，利用外部刺激等誘導(dǎo)蛋白質(zhì)自組裝成籠形結(jié)構(gòu)應(yīng)用于活性物質(zhì)包埋（圖3C）。下面具體介紹各種包埋改進(jìn)策略。

圖3 通過(guò)不同策略改良鐵蛋白對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的包埋Fig. 3 Improved strategies for molecule encapsulation within ferritin cavity

鐵蛋白作為納米載體在不同領(lǐng)域的應(yīng)用如圖4所示。Chen Hai等通過(guò)刪除人鐵蛋白（human ferritin，HFn）DE轉(zhuǎn)角和E螺旋位置的氨基酸制備鐵蛋白突變體，該突變體在pH 4.0時(shí)就能實(shí)現(xiàn)亞基解離，在pH值調(diào)回中性時(shí)重新組裝。利用這種pH值較為溫和的解離條件同樣可將姜黃素分子包埋進(jìn)內(nèi)部空腔中，姜黃素的水溶性得到了極大提高（圖4A）。但刪除參與四重軸作用的這些氨基酸使得四重軸通道直徑擴(kuò)大至1.8 nm左右，通道的擴(kuò)大可能會(huì)引起較小包埋物質(zhì)的泄漏。Wang Wenming等則通過(guò)刪除鐵蛋白C-C界面AB環(huán)中的若干氨基酸，同樣得到了可在較為溫和pH值條件下可逆自組裝的鐵蛋白突變體，成功將姜黃素等活性物質(zhì)包埋于空腔中，而且該突變體不會(huì)產(chǎn)生可能引起包埋物質(zhì)泄漏的大孔道。此外，通過(guò)一些物理方法對(duì)鐵蛋白進(jìn)行處理，同樣可以將其應(yīng)用于溫和條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的包埋。研究發(fā)現(xiàn)大氣壓冷等離子體、脈沖電場(chǎng)、壓熱超聲處理等加工技術(shù)處理后的鐵蛋白比未處理的鐵蛋白能在pH值更為溫和的條件下解離成單亞基，并在中性環(huán)境下重新自組裝成納米籠結(jié)構(gòu)，利用這種方法成功將姜黃素、蘆丁、EGCG等活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包埋于鐵蛋白納米籠中。

Yang Rui等研究發(fā)現(xiàn)低濃度尿素（20 mmol/L）處理會(huì)將植物鐵蛋白的通道直徑擴(kuò)大4 倍左右，營(yíng)養(yǎng)小分子如EGCG可以通過(guò)擴(kuò)大的通道進(jìn)入鐵蛋白空腔，而不需要破壞鐵蛋白的籠狀結(jié)構(gòu)。透析去除尿素分子后，通道恢復(fù)正常大小，營(yíng)養(yǎng)小分子則被包埋在鐵蛋白納米籠中，包埋率可達(dá)17.6%。由于鐵蛋白通道處氨基酸相互作用對(duì)于變性劑分子的敏感性，低濃度（2 mmol/L）的鹽酸胍也可用來(lái)制備鐵蛋白活性分子包埋復(fù)合物。此外，研究發(fā)現(xiàn)60 ℃熱處理可以通過(guò)展開(kāi)周圍的-螺旋來(lái)擴(kuò)大植物鐵蛋白的四重軸通道，活性分子蘆丁可在pH值為中性的條件下通過(guò)通道進(jìn)入空腔。當(dāng)溫度降低到20 ℃時(shí)，蘆丁被封裝在鐵蛋白空腔內(nèi)。利用此方法，平均1 個(gè)鐵蛋白分子可包埋約10.5 個(gè)蘆丁分子，包埋率為8.08%。張晨曦等則利用超聲輔助加熱的方法處理鐵蛋白，蝦青素可通過(guò)擴(kuò)大的鐵蛋白通道進(jìn)入內(nèi)部空腔之中，包埋率為19.8%。溫和的包埋處理不會(huì)嚴(yán)重破壞蝦青素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物活性，且蝦青素的水溶性和光熱穩(wěn)定性均可得到顯著改善。與游離的蝦青素相比，鐵蛋白-蝦青素復(fù)合物能顯著抑制HO誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

前面提到的人工改造的鐵蛋白在活性物質(zhì)包埋方面也表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。以16聚體新型蛋白籠為載體可在pH值為3.0的條件解離從而包埋姜黃素，姜黃素的溶解度可提高至游離狀態(tài)的458 倍。在鐵蛋白C界面引入組氨酸結(jié)構(gòu)域，使其在中性pH值條件下以四聚體的形式存在，在過(guò)渡金屬離子或pH值等外部刺激下可實(shí)現(xiàn)蛋白自組裝成鐵蛋白籠狀結(jié)構(gòu)。將這種組氨酸介導(dǎo)的可逆蛋白自組裝特性應(yīng)用于姜黃素等活性物質(zhì)包埋，其效率幾乎是已報(bào)道的酸堿變性包埋方法的3 倍，這極大地拓寬了鐵蛋白在活性物質(zhì)包埋遞送的應(yīng)用前景。

2.3 重金屬檢測(cè)

圖4 鐵蛋白作為納米載體在食品營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)藥、診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用Fig. 4 Application of ferritin as nanocarrier in food nutrition, medicine and diagnosis

汞是一種劇毒重金屬，其可通過(guò)食物鏈進(jìn)行生物累積從而嚴(yán)重威脅著人體健康。汞化合物可以分為無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞。無(wú)機(jī)汞主要以二價(jià)汞離子（Hg）形式存在于環(huán)境中，攝入或吸入會(huì)對(duì)人神經(jīng)、胃腸道系統(tǒng)以及內(nèi)臟器官等產(chǎn)生嚴(yán)重危害，因此建立能快速準(zhǔn)確檢測(cè)汞離子的方法對(duì)于食品安全、人類健康以及環(huán)境檢測(cè)等方面具有重要意義。目前，原子吸收光譜、原子發(fā)生光譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜、電化學(xué)法等儀器方法可用于檢測(cè)Hg等重金屬離子，但這些傳統(tǒng)方法存在成本高、處理過(guò)程繁瑣等應(yīng)用缺陷。近年來(lái)，熒光探針檢測(cè)技術(shù)由于其靈敏度高、選擇性好、應(yīng)用方便等優(yōu)勢(shì)逐漸受到了研究人員的廣泛關(guān)注。Wang Yingjie等通過(guò)在HFn納米籠外表面連接一段MBP，成功制備了一種對(duì)Hg具有高結(jié)合能力的蛋白納米籠（HFn-MBP）。用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的HFn-MBP的熒光可以被GO猝滅，而在上述體系中加入Hg可以以劑量依賴的方式恢復(fù)被猝滅的熒光（圖4B）。該傳感器由FITC標(biāo)記的HFn-MBP和GO組成，對(duì)Hg具有較高的靈敏度和選擇性，檢測(cè)限可達(dá)1.0 nmol/L。此研究為鐵蛋白納米籠在重金屬離子檢測(cè)中的應(yīng)用開(kāi)辟了新的途徑。

一般來(lái)說(shuō)，有機(jī)汞化合物的毒性要遠(yuǎn)高于無(wú)機(jī)汞，而在有機(jī)汞中，甲基汞（methylmercury，MeHg）危害性最大。由于分子質(zhì)量小，脂肪溶解性強(qiáng)，故MeHg容易通過(guò)血腦屏障，具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性。金納米團(tuán)簇因其獨(dú)特的熒光特性和優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性在化學(xué)傳感和生物成像領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，同時(shí)也被用于汞化合物檢測(cè)等探針開(kāi)發(fā)。Lü Chenyan等利用非天然的16聚體鐵蛋白作為生物模板，在水環(huán)境中以簡(jiǎn)便綠色的方法制備了一種新型16聚體鐵蛋白-金納米簇（7A-Au NCs），所制備的鐵蛋白-金納米簇復(fù)合物可在體內(nèi)和體外高選擇性地檢測(cè)Hg和MeHg，其不僅適用于血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的生物成像，而且可作為一種腦特異性MeHg生物成像的有效探針。由此可見(jiàn)，以鐵蛋白為模板制備的納米材料在食品安全及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重金屬離子檢測(cè)方面具有很大的前景。

3 鐵蛋白在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 抗癌藥物遞送

惡性腫瘤是全球范圍的健康問(wèn)題，據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，2008—2018年全球癌癥死亡病例增加了26.3%。持續(xù)增長(zhǎng)的癌癥死亡率提示著腫瘤治療仍存在著巨大的挑戰(zhàn)，除了各種抗癌藥物的研發(fā)，對(duì)于納米藥物載體的研究同樣引起了廣泛的關(guān)注。由于人重鏈鐵蛋白可以特異識(shí)別TfR1，通過(guò)冷凍電子顯微鏡技術(shù)對(duì)TfR1與人重鏈鐵蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，H型亞基A螺旋的氨基端、BC-環(huán)和C螺旋的羧基端是鐵蛋白與TfR1結(jié)合的相應(yīng)區(qū)域。TfR1在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，利用其固有的腫瘤靶向性，人重鏈鐵蛋白已被廣泛用于裝載順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等鉑類化合物、Dox、金基化合物（Au2phen和Auoxo4）、釕絡(luò)合物（DiRu-1）等多種抗癌藥物。研究發(fā)現(xiàn)鐵蛋白作為藥物載體能夠穿越血腦屏障，實(shí)現(xiàn)對(duì)原位惡性腦膠質(zhì)瘤的靶向治療（圖4C）。血腦屏障是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和保護(hù)腦組織免受代謝物損傷的天然屏障，幾乎所有大分子藥物和大部分小分子藥物無(wú)法穿越血腦屏障抵達(dá)腦組織，故中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如惡性腦瘤無(wú)法得到有效治療。由于TfR1在腦內(nèi)皮細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中均能高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鐵蛋白可通過(guò)腦內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)胞吞作用穿過(guò)血腦屏障且不會(huì)阻斷在溶酶體，又可以通過(guò)TfR1介導(dǎo)特異性富集到惡性腦瘤細(xì)胞的溶酶體中降解。鐵蛋白包埋并靶向釋放藥物Dox從而靶向殺傷癌細(xì)胞。鐵蛋白與TfR1特異性的靶向結(jié)合及理想的納米尺寸效應(yīng)是其既可以穿越血腦屏障又具有腫瘤組織高選擇性的重要原因。

在其他鐵蛋白外表面進(jìn)行基因修飾同樣可以賦予其癌細(xì)胞靶向性，de Turris等在AfFtn表面設(shè)計(jì)一段序列來(lái)模擬人重鏈鐵蛋白，突變體保留了AfFtn能夠在中性pH值條件下由礦物離子控制的解離組裝特性，同時(shí)能通過(guò)TfR1受體識(shí)別并被HeLa細(xì)胞內(nèi)吞。Jiang Bing等在激烈火球菌鐵蛋白表面修飾肝癌細(xì)胞靶向肽SP94使其能夠特異結(jié)合肝癌細(xì)胞表面的受體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78，當(dāng)內(nèi)腔裝載Dox時(shí)，鐵蛋白藥物能夠精準(zhǔn)殺傷肝癌細(xì)胞。當(dāng)內(nèi)部空腔裝載CoO納米酶時(shí)，利用納米酶的過(guò)氧化物酶活性，鐵蛋白探針可催化過(guò)氧化物酶底物，使肝癌細(xì)胞可視化。同時(shí)該課題組研究發(fā)現(xiàn)藥物分子進(jìn)入人重鏈鐵蛋白的通道是位于鐵蛋白二重對(duì)稱軸處的柔性區(qū)域，通道的大小可受溫度調(diào)控。溫度升高有助于周圍的氨基酸殘基擺動(dòng)到遠(yuǎn)離二重軸的位置，藥物從此處進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔?；谶@一發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)溫度調(diào)節(jié)的方法將Dox、鉑類等抗癌藥物裝載到鐵蛋白內(nèi)腔。

3.2 診斷及光熱治療

鐵蛋白空腔的生物礦化能力以及表面易于修飾的特性使得鐵蛋白成為了良好的生物成像設(shè)備，其在核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和PAI中得到了廣泛的應(yīng)用。MRI是一種強(qiáng)大的診斷技術(shù)，由于其高靈敏度和準(zhǔn)確性，被廣泛用于腫瘤成像。然而，目前使用的釓基造影劑缺乏對(duì)癌細(xì)胞的特異性導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)，同時(shí)MRI由于空間分辨率不夠可能無(wú)法檢測(cè)到隱匿的腫瘤微沉積。Cao Changqian等通過(guò)在鐵蛋白納米籠內(nèi)合成磁鐵礦核作為MRI造影劑用于癌癥的體內(nèi)檢測(cè)，其具備極高的造影性能和TfR1依賴的MRI信號(hào)。Wang Zhantong等利用仿生合成的方法在鐵蛋白空腔內(nèi)合成了硫化銅納米顆粒（圖4D），CuS-Fn NCs具有極靈敏的腫瘤特異性靶向效應(yīng)，在放射性核素Cu標(biāo)記后可利用PET及PAI兩種成像模式表征腫瘤。同時(shí)，該材料具有較強(qiáng)的近紅外吸收光熱轉(zhuǎn)化效率，靶向癌細(xì)胞后利用較低的激光照射便可達(dá)到高效的腫瘤PTT效果，可實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像指導(dǎo)的PTT。綜上所述，諸多研究表明鐵蛋白納米籠是一種極具前景的腫瘤成像和PTT的納米載體。

4 結(jié) 語(yǔ)

由于鐵蛋白具有單分散性、高溶解性、高生物安全性和高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，利用鐵蛋白納米籠狀結(jié)構(gòu)、解離自組裝以及易于修飾的特性將活性物質(zhì)或抗癌藥物進(jìn)行包埋和靶向遞送具有重要的意義。經(jīng)過(guò)鐵蛋白包埋后，活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水溶性、熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取率均得到顯著提高，藥物分子能夠精準(zhǔn)地靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，且能夠穿越血腦屏障抵達(dá)腦組織。諸多研究表明鐵蛋白可作為一種新的包埋生物活性物質(zhì)的納米載體。此外，在食品重金屬檢測(cè)以及活體成像診斷等方面，鐵蛋白納米載體也具有非常廣闊的應(yīng)用前景。盡管針對(duì)鐵蛋白包埋物質(zhì)的制備方法和應(yīng)用已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題需要解決。首先，鐵蛋白的包埋效率以及裝載能力仍需提高，通過(guò)人工設(shè)計(jì)更多不同形狀和性質(zhì)的新型鐵蛋白納米籠或制備蛋白組裝體利用組裝間隙的空間是可能的解決方案，但具體的應(yīng)用體系需深入探索。其次，目前研究大多集中在鐵蛋白包埋物質(zhì)的制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用，鐵蛋白納米載體在食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)方面的應(yīng)用應(yīng)受到更多關(guān)注。最后，鐵蛋白在胃中的穩(wěn)定性以及客體分子的細(xì)胞攝取效率有待進(jìn)一步提高，這樣才能保證鐵蛋白運(yùn)載體系對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)與健康的貢獻(xiàn)進(jìn)入實(shí)際臨床應(yīng)用。