李 妍，石 巖，吳 迪

（天津市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，天津 300384）

隨著我國人民生活質(zhì)量的極大提高，生活和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所產(chǎn)生的有機類廢棄物的規(guī)模也逐年增多，形成了巨大的環(huán)境壓力。2020 年6 月8 日，生態(tài)環(huán)境部、國家統(tǒng)計局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部聯(lián)合發(fā)布的《第二次全國污染源普查公報》[1]顯示：2017 年，全國干污泥產(chǎn)生量1 026.71 萬t，處置量為1 000.59 萬t；秸稈產(chǎn)生量為8.05 億t，秸稈利用量5.85 億t；畜禽養(yǎng)殖排放化學需氧量604.83 萬t。廢棄資源的安全高效利用已成為當前研究的熱點之一。蚯蚓被達爾文稱之為“世界上最有價值的動物”。蚯蚓作為一種養(yǎng)殖成本低、營養(yǎng)價值豐富、產(chǎn)量高、經(jīng)濟效益好的動物，具有很大的推廣應用前景，在我國廣大農(nóng)村和城市進行蚯蚓的養(yǎng)殖及開發(fā)利用市場十分廣闊。蚯蚓在生態(tài)系統(tǒng)中的功能主要表現(xiàn)在: 1）影響所在環(huán)境中有機質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)等關鍵過程；2）影響所在環(huán)境的理化性質(zhì)； 3）通過挖掘、吞食和排泄作用，與所在環(huán)境中的植物、微生物及其他動物相互影響[2]。在蚯蚓-微生物共生系統(tǒng)中，蚯蚓主要起調(diào)控作用，通過腸道消化，尤其可加速污染物的降解，影響系統(tǒng)中微生物量、活性及群落結(jié)構(gòu)[3?4]。蚯蚓堆肥是利用蚯蚓和微生物，將有機類廢棄物進行快速有效地分解并將其轉(zhuǎn)換成腐殖質(zhì)的一種生態(tài)環(huán)境友好的堆肥技術，被應用于污泥、畜禽廢棄物和秸稈等廢棄物治理領域[5?7]，可有效降低固體廢棄物對環(huán)境帶來的危害和風險[8]。在蚯蚓堆肥過程中為保證其生長與繁殖環(huán)境，常添加各種物料來改善污泥等廢棄物的理化性質(zhì)，主要采用的物料有牛糞、生物炭、水稻殼、粉煤灰和甘蔗渣等[9?12]，還有的采用沸石、膨潤土等化學調(diào)理劑[13]。現(xiàn)有參考文獻常用牛糞馴化養(yǎng)殖后的蚯蚓來開展不同物料配比消納試驗研究，而利用污泥馴化后的蚯蚓作為試驗研究對象較少提及。因此，本研究以污泥馴化后的大平2 號蚓作為供試蚯蚓，探討了腐熟秸稈、牛糞和污泥的不同配比對蚯蚓和蚯蚓糞理化性質(zhì)、蚯蚓生長繁殖和蚯蚓腸道群落結(jié)構(gòu)組成的影響，為蚯蚓堆肥技術提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試蚯蚓為經(jīng)喂食污泥馴化的大平2 號，取自天津市某蚯蚓養(yǎng)殖場；污泥取自天津市靜海區(qū)某污水處理廠；牛糞取自天津市武清區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場；腐熟秸稈是由蔬菜尾菜和玉米秸稈經(jīng)高溫好氧發(fā)酵過程，經(jīng)二次腐熟后過2 mm 篩制得，取自天津市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地廢棄物資源化試驗站。實驗裝置為頂部無蓋、底部無孔洞藍色周轉(zhuǎn)箱（670 mm×420 mm×175 mm）以利于蚯蚓的全量收集。

1.2 試驗日期及地點

本次試驗于2019 年7 月～2020 年3 月在天津市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地進行。試驗結(jié)束后取樣，在實驗室進行檢測分析。

1.3 試驗方法

將3 種物料按照比例(質(zhì)量分數(shù))將牛糞和腐熟秸稈分別與污泥進行混合，每箱加入30 .00kg 物料，用去離子水使混合物料含水率達到60%，每個處理重復3次。向每個處理加入大小均勻總質(zhì)量1.00 kg帶有明顯環(huán)帶的蚯蚓,物料比例見表1。

表1 不同處理原料配比

將所有裝置整齊擺放在溫室避光處，進行為期60 d 的堆肥處理。實驗期間控制溫度在(22±5) ℃，并且定期向物料噴水，保證含水率在60%左右。培養(yǎng)結(jié)束后，把所有蚯蚓從混合物中分離出來，觀察生長狀況，統(tǒng)計蚯蚓收集量，稱重，并測定相關指標?；旌虾蟛煌幚淼奈锪侠砘誀?，見表2。

表2 不同處理原料理化性狀

1.4 檢測指標及數(shù)據(jù)處理

原料、蚯蚓、蚯蚓糞的有機質(zhì)、總養(yǎng)分（N%+P2O5%+K2O%）、pH 和電導率等測定采用農(nóng)業(yè)化學常規(guī)分析方法[14]。糞大腸菌群數(shù)測定采用多管發(fā)酵法，蛔蟲卵死亡率測定采用濾膜法。蚯蚓腸道微生物群落結(jié)構(gòu)組成采用百邁客生物科技公司的高通量測序技術進行測定分析。試驗結(jié)果采用Excel進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 蚯蚓糞理化性狀分析

蚯蚓堆肥過程結(jié)束后蚯蚓糞的理化性狀，見表3。T1～T5 蚯蚓糞的容重在0.49～0.55 g/cm3之間，糞大腸菌群值和蛔蟲卵死亡率均達到《有機肥料：NY/T525—2021》標準。對比表2、表3 數(shù)據(jù)可知，經(jīng)蚯蚓過腹轉(zhuǎn)化后，蚯蚓糞只有T1、T4 總養(yǎng)分含量增加，T2、T3 和T5 總養(yǎng)分含量均低于初始值，且以T5 降低最多。DOMINGUEZ et al[15]研究表明，原料的養(yǎng)分含量、配比會影響蚯蚓的進食和消化，促使蚯蚓的糞便、黏液、體液和酶等進入到物料中，并加速養(yǎng)分礦化，從而使蚯蚓糞養(yǎng)分增加，反之則降低。與初始值相比，不同處理組的蚯蚓糞有機質(zhì)、pH 均呈下降趨勢，且pH 后期接近中性，而電導率均呈升高趨勢。KHARRAZI et al[16]認為蚯蚓在堆肥過程中通過自身活動加速了有機質(zhì)的分解與礦化，在此過程中，促進了原料中礦物鹽和無機離子的釋放，以及形成一些中間產(chǎn)物，從而會導致有機質(zhì)降低，pH、電導率升高。NDEGWA et al[17]研究認為，蚯蚓糞pH 的變化與氮、磷礦化和產(chǎn)生有機酸有關。本試驗蚯蚓糞的有機質(zhì)、pH 和電導率的降幅與增幅變化并不規(guī)律，可能是由于原料理化性狀差異所導致?？傮w來看，蚯蚓對純污泥(T1)的過腹轉(zhuǎn)化使有機質(zhì)降低最多，pH 降幅最大，蚯蚓糞的養(yǎng)分含量增加最多。與T1 純污泥組對比，秸稈和牛糞的添加不利于蚯蚓生物過腹轉(zhuǎn)化，其中添加秸稈的處理養(yǎng)分轉(zhuǎn)化效果最差。

表3 不同處理蚯蚓糞理化性狀

2.2 蚯蚓理化性狀分析

不同處理組所收集的蚯蚓體含水率在78.36%～79.37%，差異不大。養(yǎng)分變化范圍在11.76%～12.31%，pH 5.40～6.05,添加秸稈的處理組（T2、T5）＞添加牛糞處理組（T3、T4）＞純污泥處理（T1）。蚯蚓收集質(zhì)量從高到低依次是T1＞T4＞T5＞T3＞T2，T1、T4 蚯蚓體收集量最多，分別達到了3.11 和3.07 kg，相較于初始蚯蚓投放量，增量超過了2 倍。蚯蚓個體的長度和直徑也優(yōu)于其他處理，長度分別達到了6.01 和5.43 cm，蚯蚓體直徑也分別達到了3.16和2.83 mm，見表4。

表4 不同處理蚯蚓體理化性狀

LIM et al[18]和蔡玉琪等[19]認為利用新鮮污泥堆肥效果不佳。李英凱等[20]研究表明高比例的污泥會對蚯蚓的生長起到抑制作用，甚至發(fā)生死亡現(xiàn)象，而從本試驗5 組不同處理得出相反結(jié)果，以純污泥飼養(yǎng)的蚯蚓收集量最高。可能是由于投放的蚯蚓經(jīng)過純污泥馴化，已適應污泥的理化性狀，純污泥和高比例的污泥（T1、T4）配方中的養(yǎng)分及環(huán)境條件適宜蚯蚓的生長與繁殖，而其他處理可能由于添加了牛糞和腐熟秸稈，改變了原有食源性狀，導致蚯蚓過腹轉(zhuǎn)化速率降低，繁殖能力下降。劉佳等[21]認為只有當可利用、易分解的物質(zhì)被完全降解后，蚯蚓才會利用較難降解的有機物作為營養(yǎng)物質(zhì)，如纖維素含量較高的有機物，因此添加腐熟秸稈對蚯蚓的繁殖影響較大，蚯蚓繁殖能力最低。

2.3 蚯蚓腸道微生物群落結(jié)構(gòu)組成變化

蚯蚓腸道是蚯蚓堆肥發(fā)生的主要場所[22]。本次試驗對收集的蚯蚓體進行腸道剝離，分析了不同處理的蚯蚓腸道中微生物種群的組成，考察不同食源對蚯蚓腸道內(nèi)微生物群落組成的影響。

2.3.1 細菌OTU 分析 在97% 的相似度水平下，得到了每個樣品的OTU 個數(shù)，見圖1。

圖1 OTU Venn 圖

圖1 展示了5 個處理之間共有、特有OTU 數(shù)目，表現(xiàn)出樣品間OTU 的重合情況。特有OTU 數(shù)T4＞T1＞T2 = T5＞T3，而T2、T3 和T5 的OTU 數(shù)目均低于1 個。

2.3.2 Alpha 多樣性指數(shù)分析 使用Mothur（version v.1.30）軟件，對樣品Alpha 多樣性指數(shù)進行評估。各樣品Alpha 多樣性指數(shù)值統(tǒng)計，見表5。

表5 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計

表5 可知，測序覆蓋深度均在0.99 以上，說明測序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實情況。Chao1指數(shù)常用來估計物種總數(shù)，即指數(shù)越大菌群豐度越高。Chao1 指數(shù)T4＞T1＞T3＞T5＞T2，表明T4、T1 蚯蚓腸道細菌物種豐度要高于T3、T5 和T2。Shannon 指數(shù)指示了樣品的細菌多樣性程度，數(shù)值越高，表明細菌群落的物種多樣性越高，分布越均勻。5 個處理的Shannon 指數(shù)從高到低依次為T4＞T1＞T3＞T5＞T2。T4 對蚯蚓腸道的細菌的物種豐度和物種多樣性高于其他處理，而以T2 喂食蚯蚓則最低，這與張瑩[23]的研究結(jié)果基本一致。

2.3.3 細菌多樣性分析 蚯蚓腸道菌群對蚯蚓穩(wěn)定自身身體機能、參與元素循環(huán)以及重金屬、農(nóng)藥等污染物的降解轉(zhuǎn)化發(fā)揮著非常重要的作用[24]。門水平上豐度水平前十的物種，見圖2。

圖2 門水平上的物種分布

圖2 可知，5 個處理的主要優(yōu)勢細菌為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Acitinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和藍細菌門Cyanobacteria）。黃魁等[24]的研究結(jié)果認為以城市污泥為原料的蚯蚓腸道主要以變形菌門為主，可能由于厚壁菌門參與代謝活動增強，因而成為腸道內(nèi)優(yōu)勢物種[25]。隨著原料中牛糞比例的增加，厚壁菌門減少，而變形菌門、放線菌門和擬桿菌門占比逐漸增加，這與YASIR et al[26]的研究結(jié)果一致。當原料中添加了不同比例的腐熟秸稈，蚯蚓腸道內(nèi)變形菌門占據(jù)絕對優(yōu)勢，其次為厚壁菌門，變形菌門隨著腐熟秸稈添加量的增加而略有減少。有研究表明，蚯蚓能夠通過增加群落生物量來增加纖維素的降解效率[27]，蚯蚓消化道微生物和分泌的黏液、酶也能夠促進纖維素的降解[28?30]。鄧艷芹等[31]認為蚯蚓體表液對纖維素降解菌抑制作用較小而腸液促進作用較大時，該纖維素降解菌株在蚯蚓腸道內(nèi)數(shù)量較多。從本研究的結(jié)果來看，蚯蚓在食用添加腐熟秸稈的原料后，蚯蚓腸道內(nèi)變形菌門為絕對優(yōu)勢菌，有可能主要為纖維素降解菌，這類菌及某些因素可能抑制了其他菌的生存，導致腸道內(nèi)微生態(tài)失調(diào)，引起蚯蚓腸道菌群處于失衡狀態(tài)，而導致這一結(jié)果的原因還有待進一步研究。

3 結(jié)論

（1）蚯蚓對5 種不同配比的原料能夠進行過腹生物轉(zhuǎn)化，尤其以100%污泥和70%污泥+30%牛糞的消納效果最好。污泥中添加牛糞和腐熟秸稈均能夠降低蚯蚓糞的有機質(zhì)和pH,而使電導率升高。蚯蚓過腹轉(zhuǎn)化純污泥和70% 污泥+30% 牛糞能夠使蚯蚓糞總養(yǎng)分含量增加。

（2）5 個處理的蚯蚓收集量以蚯蚓采食100%污泥后增殖量最高，50%污泥+50%腐熟秸稈蚯蚓則最低。在污泥中添加一定比例的牛糞和腐熟秸稈，蚯蚓均能夠繁殖，添加牛糞的處理要高于添加腐熟秸稈的處理，且投加腐熟秸稈比例達到50%效果最差，因此添加腐熟秸稈不宜比例過大。

（3）添加牛糞和腐熟秸稈會引起蚯蚓腸道微生物群落組成的變化。70% 污泥+30% 牛糞處理OTU 數(shù)高于其他處理，而50%污泥+50%腐熟秸稈處理則最低。喂食100%污泥的蚯蚓腸道內(nèi)細菌以厚壁菌門為主；隨著原料中牛糞比例的增加，厚壁菌門減少而變形菌門、放線菌門和擬桿菌門占比逐漸增加；而添加腐熟秸稈的原料后，腸道內(nèi)變形菌門成為絕對優(yōu)勢菌。