汪凱駿，張烝彥，章露恒，張孟霜，潘丹杰

（1.杭州市糧食保障服務(wù)中心，浙江 杭州 310000；2.杭州市糧食收儲有限公司，浙江 杭州 310000）

稻米，亦稱大米，是當(dāng)今世界上最重要的糧油經(jīng)濟(jì)作物之一，在我國南方地區(qū)大部分人都以稻米作為主食。隨著稻米生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大以及生活水平的改善，人們對優(yōu)良食味品質(zhì)稻米的需求量也將日漸提高[1]。淀粉作為稻米最重要的成分之一，占稻米總重70%～80%。其中，稻米直鏈淀粉含量的多少與米飯的硬度、黏性以及口味等食味品質(zhì)有關(guān)[2-3]。一般來講，直鏈淀粉含量過高的稻米，所蒸煮的稻米偏硬，且黏性也不好，味道較差；相反，含量過低的稻米，所蒸煮的稻米偏軟，過于粘連，口感也不好。因此，選擇適宜直鏈淀粉含量的水稻材料作為選種培育的水稻品種就顯得尤為重要。

直鏈淀粉含量作為影響稻米食味品質(zhì)的主要因素之一，對稻米中直鏈淀粉含量的檢測技術(shù)也在進(jìn)一步發(fā)展中。由原來的單波段碘比色法，經(jīng)過方法改良后擴(kuò)展為雙波段和多波段碘比色法，引入新的檢測儀器后，又開發(fā)出近紅外光譜法（NIR）、熱重法（TG）、差示掃描量熱法（DSC）等[4-7]測定方法。其中碘比色法為目前實驗室中最常見的直鏈淀粉含量測定法，具備成本低、測定結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢。在常規(guī)選種育種中，用于篩選和鑒別的水稻材料，數(shù)量巨大。而參照GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》的方法測定，過于繁瑣、耗費大量的試劑和時間，不利于大批量樣品的檢測。同時，由于直鏈淀粉含量是三倍體遺傳的特點[8-9]，如果采用混合集中法來分析直鏈淀粉含量，會導(dǎo)致實驗結(jié)果與理論值有較大的出入。因此，對于一些圍繞稻米蒸煮及食味品質(zhì)形成機(jī)理開展的遺傳研究和雜交選育，需要采用單粒米法分析[10]。本文提出了一種可批量化快速測定單粒稻米中直鏈淀粉含量的方法，并對直鏈淀粉含量和堊白度這兩個影響稻米品質(zhì)的重要理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為遺傳研究和雜交選育提供參考性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液（各1 mg/mL，馬鈴薯來源）：河南省萬佳標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心有限公司；氫氧化鈉（優(yōu)級純）：永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；乙酸（分析純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇（分析純）：安徽安特食品股份有限公司；碘、碘化鉀（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；試驗用的10個稻谷材料來源于浙江杭州、嘉興地區(qū)，分別為粳稻品種：嘉67、秀水121、秀水134，晚秈稻品種：中浙優(yōu)8號、甬優(yōu)1540、嘉豐優(yōu)2號，早秈稻品種：中組143、中組18、中冷23，粳糯稻品種：粳糯4921，分別對應(yīng)樣品編號1～10。

MSA-224S型分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-2600型紫外分光光度計：島津企業(yè)管理(中國）有限公司；ELX-800型全自動定量繪圖酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；JNM-III型碾米機(jī)：中儲糧成都糧食儲藏科學(xué)研究所；JLG-III型礱谷機(jī)：中儲糧成都糧食儲藏科學(xué)研究所；JMWT-12型大米外觀品質(zhì)檢測儀：北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

按照表1配制了直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)液和0.09 mol/L NaOH水溶液的混合標(biāo)液，混勻待用。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)液

1.2.2 樣品制備及方法處理

將待測稻谷樣從田間收獲后在實驗室放置1周，平衡水分。每個稻谷樣隨機(jī)取適量，用JLGIII型礱谷機(jī)脫粒后，取10 g左右比較飽滿的稻米粒，用JNM-III型碾米機(jī)碾磨成精米，置于密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

（1）國標(biāo)法：參照GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》的方法測定，對上述制備的樣品進(jìn)行脫脂處理后旋風(fēng)磨粉碎成細(xì)粉過80目篩。稱取0.100 0 g試樣于100 mL錐形瓶中，加入1 mL乙醇溶液和9 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，在沸水浴中加熱10 min，冷卻轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容。準(zhǔn)確移取5.0 mL分散液，1.0 mL 1.0 mol/L HAc溶液，2.0 mL碘試劑（2.000 g碘化鉀、0.200 g碘，加水定容至100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用）置100 mL容量瓶，加水至刻度。用空白溶液調(diào)零，利用分光光度計在720 nm處測定吸光度。

（2）單粒米快速法：在每個樣品中隨機(jī)取整精米作直鏈淀粉含量測定。用研缽將單粒精米研磨成粉，稱量0.010 0 g米粉置于10 mL試管中，加入0.1 mL 95%乙醇溶液和0.9 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，輕輕搖勻，使其分散。然后，將其放入100 ℃恒溫干燥箱中加熱10 min后拿出，冷至室溫。各準(zhǔn)確移取1.25 mL試樣分散液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.09 mol/L NaOH水溶液（作空白對照），置預(yù)先加入10 mL左右水的25 mL比色管中，加入0.25 mL HAc溶液，搖勻，加入0.5 mL碘試劑，加水定容至刻度，搖勻，靜置10～15 min。使用移液槍各準(zhǔn)確移取250 μL待測樣、標(biāo)準(zhǔn)樣以及空白樣至96孔塑料微孔板中，使用ELX-800酶標(biāo)儀（微孔分光光度計）于630、490 nm處，測量其吸光度。以雙波段的吸光度之差為縱坐標(biāo)，以直鏈淀粉含量為橫坐標(biāo)描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后通過回歸方程計算各個待測樣的直鏈淀粉含量。

1.2.3 稻米堊白度的測定

從每個品種中各隨機(jī)挑選出含堊白的米粒10粒作為待測米粒，通過大米外觀品質(zhì)檢測儀掃描得到稻米圖像。經(jīng)過人工確認(rèn)后，儀器自動分析處理圖像計算得到堊白度。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種方法處理過程的差異分析

單粒米快速法和國標(biāo)法處理過程中差異性主要表現(xiàn)在使用的儀器設(shè)備、試劑的消耗量、測定的用時量等方面。單粒米快速法摒棄了國標(biāo)法中100 mL容量瓶定容和沸水浴加熱操作，采用了10 mL試管，放置于試管架中并使用恒溫干燥箱加熱。摒棄了國標(biāo)法中使用紫外可見分光光度計單個依次測定吸光度的操作，采用酶標(biāo)儀雙波長法同時測定96個樣品的吸光度。兩者相較，單粒米快速法操作簡便、試劑消耗量少、測定用時短。

2.2 直鏈淀粉測定波長和參比波長的選擇

以碘試劑為空白，分別對1 mg/mL直鏈淀粉、1 mg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.2（2）的方法處理所得的直鏈淀粉-碘復(fù)合物、支鏈淀粉-碘復(fù)合物掃描液通過UV-2600紫外可見分光光度計，在400～900 nm區(qū)域進(jìn)行光譜掃描。如圖1所示，直鏈淀粉、支鏈淀粉的最大吸收波長分別為630 nm和540 nm，根據(jù)等吸收點作圖法確定直鏈淀粉的測定波長為630 nm，參比波長為490 nm；支鏈淀粉的測定波長為540 nm和參比波長為720 nm。

圖1 直鏈淀粉與支鏈淀粉的掃描圖譜

2.3 2種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將按1.2.1方法所配制的直鏈淀粉含量的0%～35%的標(biāo)準(zhǔn)混合液，先后使用本實驗的單粒米快速法和國標(biāo)法測定其吸光度。單粒米快速法采用雙波長法，利用ELX-800酶標(biāo)儀同時測得630、490 nm處的吸光度，以△A（A630nm-A490nm）為縱坐標(biāo)，直鏈淀粉含量（%）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2（a）所示，其線性相關(guān)系數(shù)R2為0.998 7。如圖2（b）所示，國標(biāo)法的線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1，說明2種方法所測量的吸光度均與直鏈淀粉含量之間有較好的線性關(guān)聯(lián)。

圖2 2種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 2種測定方法結(jié)果描述性分析

用單粒米快速法和國標(biāo)法分別測定了10個稻米樣品的直鏈淀粉含量，每個樣品設(shè)置10個平行，取其均值作為結(jié)果值。如表2所示，單粒米快速法所測得的直鏈淀粉含量均略高于國標(biāo)法，但所呈現(xiàn)出的趨勢保持一致且差值均小于2%，結(jié)果幾無差異。通過t檢驗分析得到P值>0.05，說明2種方法之間也并無顯著的差異。同時由表2可知，單粒米快速法測定的直鏈淀粉含量變異系數(shù)在1.87% ～ 5.69%，國標(biāo)法的變異系數(shù)在1.76% ～ 5.07%，兩者之間相差無幾且穩(wěn)定性都較好。綜上所述，單粒米快速法能較精確地測定稻米中直鏈淀粉含量，同時滿足對大批量樣品的快速測定和篩選要求。

表2 2種方法測得的直鏈淀粉含量

2.5 單粒米快速法不同稻米粒直鏈淀粉含量差異性分析

每個稻米樣品分別取10粒正常粒和10粒高堊白粒（堊白度>50%），樣品編號10粳糯稻樣不做該實驗。用單粒米快速法測定其直鏈淀粉含量，取其均值為結(jié)果值。如圖3所示，早秈稻的直鏈淀粉含量明顯高于粳稻和晚秈稻，粳稻略低于晚秈稻。同時，根據(jù)圖3可知，粳稻與晚秈稻的直鏈淀粉含量和堊白度之間基本無關(guān)聯(lián)，早秈稻高堊白粒的直鏈淀粉含量與正常粒和結(jié)果值之間有較大的差別，說明對早秈稻來說直鏈淀粉含量和堊白度之間具有一定的關(guān)聯(lián)。

圖3 單粒米快速法不同稻米粒直鏈淀粉含量比較

3 討論與結(jié)論

本文中的單粒米快速法由國標(biāo)法改進(jìn)而來，采用了10 mL試管，可放入試管架中并置于恒溫干燥箱中加熱，在能保證充分糊化的前提下便于批量操作，并利用酶標(biāo)儀（96孔微孔板分光光度計）對直鏈淀粉含量進(jìn)行批量測定，具備簡便易操作、試劑用量少、可批量檢測等優(yōu)勢，同時采用雙波長法，不僅消除了直鏈、支鏈淀粉吸收背景的相互影響，也消除了96孔塑料微孔板每個孔之間的吸光度差異，能大幅提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。試驗表明，該方法測定的直鏈淀粉含量相關(guān)系數(shù)為0.998 7，變異系數(shù)范圍為1.87% ～ 5.69%，具有良好的相關(guān)性和穩(wěn)定性，可滿足選種選育中的大規(guī)模篩選。此外，一般酶標(biāo)儀都自配630、490 nm濾光片，減少了相應(yīng)檢測成本。如有需要可額外自配540、720 nm濾光片，可同時測得稻米中直鏈淀粉、支鏈淀粉以及總淀粉含量。

為促進(jìn)稻米優(yōu)良新品種的選育，林趙淼等[11-12]，對影響稻米食味品質(zhì)的相關(guān)基因做了比較深入的研究，直鏈淀粉含量受到三倍體基因型的控制，同時又受到一些相關(guān)品質(zhì)特性（堊白度、膠稠度、透明度等）影響。本文通過單粒米快速法對不同品種類型、同種不同堊白度的稻米進(jìn)行了初步的研究，旨在為遺傳選育工作提供一些參考性依據(jù)。試驗表明：在各個品種中，早秈稻品種的直鏈淀粉含量明顯高于粳稻和晚秈稻品種，且與堊白度之間存在一定的相關(guān)性，高堊白早秈稻的直鏈淀粉含量普遍高于正常早秈稻。粳稻品種的直鏈淀粉含量略低于晚秈稻品種，且這兩個品種的直鏈淀粉含量與堊白度之間幾乎無相關(guān)性。