馬 玲,孟 菲,陸晨陽,陳赫威,蔡 暢,秦樹英,覃紹敏,劉金鳳,陳鳳蓮,吳健敏
(廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530001)
【研究意義】阿卡斑病毒(Akabane vrius,AKAV)是一種以吸血昆蟲為傳播媒介的蟲媒病毒,主要感染牛和羊等動(dòng)物,造成母畜流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及胎兒畸形,且可通過垂直傳播侵害胎兒中樞神經(jīng),導(dǎo)致積水性無腦綜合癥和新生胎兒關(guān)節(jié)彎曲(謝佳芮等,2019)。AKAV引起的赤羽病目前主要流行于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū),在我國廣泛流行;除牛、羊外,AKAV還可感染馬、水牛和駱駝,曾在豬、兔、牦牛、河馬、長頸鹿、大象,甚至靈長類動(dòng)物中檢出AKAV抗體,嚴(yán)重威脅著草食動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展及野生動(dòng)物安全,已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病和國際動(dòng)物貿(mào)易的重點(diǎn)檢疫對(duì)象,也是我國進(jìn)口牛、羊必檢的疫病之一(Murakami et al.,2017;原愷,2019)。2016年,本課題組在廣西竹鼠中分離獲得新型AKAV,首次證實(shí)AKAV可感染嚙齒動(dòng)物(Tang et al.,2017);與傳統(tǒng)毒株相比,新型AKAV毒力增強(qiáng)、臨床癥狀有明顯變化,說明在宿主范圍和致病性上已發(fā)生改變。隨后,云南、廣東、四川、湖南、海南等周邊省份相繼在牛、蠓蟲、三帶喙庫蚊、中華按蚊及致倦庫蚊等物種中發(fā)現(xiàn)與新型AKAV高度同源的毒株,推測新型AKAV已在一定范圍內(nèi)流行(宋頌,2018;范娜,2019;孟錦昕等,2019;吳德等,2019;Cao et al.,2019)。因此,亟待建立更靈敏、更準(zhǔn)確的檢測方法,加強(qiáng)對(duì)新型AKAV的監(jiān)控及科學(xué)評(píng)估其傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】AKAV隸屬于布尼亞病毒目(Bunyavirales)周布尼亞病毒科(Peribunyaviridae)正布尼亞病毒屬(),為分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒,基因組全長12 kb,由S、M、L共3個(gè)基因節(jié)段構(gòu)成(Wang et al,2017,2019;Chen et al.,2021)。S基因編碼核衣殼蛋白(N)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSs),高度保守。其中,N蛋白存在3個(gè)抗原表位,具有群特異性,可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體;而NSs蛋白可干擾細(xì)胞蛋白合成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。M基因高度變異,編碼病毒囊膜糖蛋白(Gn和Gc),具有型特異性,分別誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體(Wernike et al,2017;Yanase et al,2017)。Tang等(2017)通過分析新型AKAV基因序列,發(fā)現(xiàn)該毒株S基因具有我國牛源AKAV毒株的遺傳特征,而M基因與日本、韓國強(qiáng)致病性AKAV毒株的同源性更高。目前,普遍認(rèn)為AKAV只存在1個(gè)血清型,但通過S基因和M基因進(jìn)化分析可將全球的AKAV毒株分為4個(gè)基因型(亞洲型、澳洲型、其他型和第四型),其中基因I型(亞洲型)又可分為Ia和Ib亞型,包括新型AKAV在內(nèi)的我國分離毒株多屬于Ia亞型(Kobayashi et al.,2007)。因此,很多研究以S基因、M基因作為AKAV核酸檢測靶基因,如RT-PCR(唐海波等,2018)、套式RT-PCR、熒光定量RT-PCR(Golender etal.,2018;孟錦昕等,2020)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(張吉紅等,2013),以及針對(duì)新型AKAV的RT-PCR檢測方法(唐海波等,2018)。RT-PCR操作簡便,但敏感性略低;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等方法具有獨(dú)特的擴(kuò)增模式,但引物設(shè)計(jì)較復(fù)雜;而熒光定量RT-PCR具有操作簡便、特異、敏感、準(zhǔn)確性高、高通量等優(yōu)勢,已廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于蚊蟲中病毒載量較低,傳統(tǒng)的PCR難以檢出,因此亟需更靈敏、更準(zhǔn)確的檢測方法以開展新型AKAV監(jiān)測,為有效防控新型AKAV提供科學(xué)依據(jù),但目前尚無針對(duì)新型AKAV的熒光定量RT-PCR檢測方法,也鮮見我國邊境地區(qū)新型AKAV流行情況的研究報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】分別針對(duì)新型AKAV的S基因和M基因主要變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,建立靈敏、準(zhǔn)確的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法,并結(jié)合序列測定開展廣西邊境地區(qū)蚊攜帶新型AKAV調(diào)查,旨在了解其流行趨勢及遺傳進(jìn)化特征,為建立重要蚊媒病毒病預(yù)警機(jī)制提供技術(shù)支持。
核酸抽提試劑盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 9767、PrimeScriptRT Master Mix(RR036Q)、Premix(RR003Q)、pMD18-T 載體(6011)和SYBR Premix ExII(RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)及質(zhì)粒抽提試劑盒(CW0500A)購自天根生物科技(北京)有限公司;病毒RNA提取試劑盒(CW0586)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;DMEM(12800-017)和胎牛血清(10099-141)購自賽默飛世爾公司;Vero細(xì)胞、竹鼠圓環(huán)病毒、藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒、布魯氏桿菌由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。熒光定量PCR儀(Accurate 96型)購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司。
根據(jù)GenBank已公布新型AKAV毒株GXLCH16-70的S基因(KY381274)和M基因(KY381280)序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1),委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 以感染新型AKAV的Vero細(xì)胞基因組提取物為模板,采用引物AKAVSF/SAKAVSR、AKAVMF/AKAVMR分別擴(kuò)增S基因和M基因片段,然后按經(jīng)典分子克隆方法連接至pMD18-T載體上。抽提陽性克隆質(zhì)粒pMD-AKAVS和pMDAKAVM,利用分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度并計(jì)算其拷貝數(shù),分別制備1.0×10copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)10倍梯度稀釋后作為SYBR Green I熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品(馬玲等,2017)。
1.3.2 SYBR Green I熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 在不同引物濃度(2、4、5、6和10 μmol/L)、退火溫度(58、60、62、64、66和68 ℃)、Mg濃度(0、0.5和1.0 μmol/L)、兩步法或三步法等條件下進(jìn)行SYBR Green I熒光定量RT-PCR擴(kuò)增,通過值、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率、相關(guān)系數(shù)、擴(kuò)增效率及擴(kuò)增準(zhǔn)確性等指標(biāo)確定最佳反應(yīng)條件。
1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及結(jié)果判定 在10~10copies/μL的濃度范圍內(nèi),以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品pMDAKAVS和pMD-AKAVM為模板進(jìn)行SYBR Green I熒光定量RT-PCR擴(kuò)增,并繪制熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.1 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用針對(duì)新型AKAV建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒、竹鼠圓環(huán)病毒和布魯氏桿菌,測定各樣品值;同時(shí)檢測轉(zhuǎn)染新型AKAV的Vero細(xì)胞,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.4.2 靈敏性和檢測范圍 分別以濃度為1.0×10~1.0×10copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-AKAVS、1.0×10~1.0×10copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-AKAVM為模板,應(yīng)用建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測。
1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別以濃度為1.0×10~1.0×10copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-AKAVS、1.0×10~1.0×10copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-AKAVM為模板,進(jìn)行3次批內(nèi)和3次批間的SYBR Green I熒光定量RT-PCR重復(fù)試驗(yàn),即每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。計(jì)算每個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV),以評(píng)價(jià)SYBR Green I熒光定量RT-PCR的可重復(fù)性(馬玲等,2014)。
2019年6—10 月,在廣西邊境地區(qū)、口岸城市的防城港市、東興市、北海市、寧明縣、龍州縣、大新縣、靖西縣及那坡縣等8個(gè)市(縣)采集阿蚊(760只)、伊蚊(41只)、按蚊(48只)和庫蚊(3038只)共3887只,根據(jù)采樣地和蚊種合并為139份,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
將139份蚊樣品置于無菌EP管中,每份加入500~800 μL PBS,用組織研磨儀研磨蚊樣品;12000 r/min離心20 min,取上清液;按照病毒RNA提取試劑盒說明提取病毒RNA,分別采用RT-PCR和SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測新型AKAV。同時(shí),采用熒光定量RT-PCR引物AKAVSF/AKAVSR通過RTPCR擴(kuò)增新型AKAV,回收陽性樣品目的基因片段進(jìn)行測序,采用ClustalW構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。
2.1.1 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序優(yōu)化 根據(jù)t值、標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增效率及準(zhǔn)確性等指標(biāo),確定新型AKAV的S基因和M基因SYBR Green I熒光定量RT-PCR最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。其中,2對(duì)引物的最佳使用濃度均為4 μmol/L(圖1),退火溫度分別64和66 ℃(圖2);由于添加Mg對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不明顯,故不再額外添加。即SYBR Green I熒光定量RTPCR最佳反應(yīng)體系:SYBR Premix ExII 10.0 μL,上、下游引物(4 μmol/L)各1.0 μL,標(biāo)準(zhǔn)品或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL,雙蒸水補(bǔ)齊至20.0 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃30 s,64 ℃(S基因)/66 ℃(M基因)30 s,72 ℃30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 采用優(yōu)化的SYBR Green I熒光定量RT-PCR擴(kuò)增梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品,每濃度標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)平行。以標(biāo)準(zhǔn)樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、值為縱坐標(biāo),采用Excel 2013繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。結(jié)果(表2)顯示,新型AKAV的S基因、M基因分別在1.0×10~1.0×10copies/μL和1.0×10~1.0×10copies/μL間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增效率分別為98.61%和105.81%。優(yōu)化的SYBR Green I熒光定量RT-PCR敏感性好、檢測范圍寬,且無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增,適合臨床檢測。根據(jù)SYBR Green I熒光定量RT-PCR收集的熒光信號(hào),若待測樣品熒光信號(hào)超過閾值且≤35,同時(shí)擴(kuò)增曲線為平滑的S形,則可判定待測樣品中含有新型AKAV。
2.2.1 檢測特異性 選取牛、羊、竹鼠病原進(jìn)行新型AKAV的S基因和M基因檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒、竹鼠圓環(huán)病毒和布魯氏桿菌均不能有效擴(kuò)增,僅新型AKAV擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。說明針對(duì)新型AKAV S基因和M基因設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物可與新型AKAV特異性結(jié)合,但不能結(jié)合其他牛、羊、竹鼠病原,即建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR特異性強(qiáng)。
2.2.2 檢測靈敏性及其范圍 由圖1可確定,SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測新型AKAV S基因和M基因的拷貝數(shù)范圍分別為1.0×10~1.0×10copies/μL和1.0×10~1.0×10copies/μL,對(duì)應(yīng)的檢測限為1.0×10copies/μL和1.0×10copies/μL。
2.2.3 檢測重復(fù)性 SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測新型AKAV S基因的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)CV為0.15%~2.88%,批間重復(fù)試驗(yàn)CV為0.49%~3.56%(表3);SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測新型AKAV M基因的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)CV為0.16%~1.09%,批間重復(fù)試驗(yàn)CV為0.20%~4.35%(表4)??梢?,建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR均具有較好的重復(fù)性。
采用建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR對(duì)139份廣西邊境地區(qū)蚊樣品進(jìn)行新型AKAV檢測,結(jié)果表明,在采自防城港市(阿蚊和庫蚊)、東興市(庫蚊)、北海市(阿蚊和庫蚊)、寧明縣(庫蚊)和大新縣(阿蚊)的蚊樣品中檢出新型AKAV S基因和M基因的熒光信號(hào)均超過閾值且≤35,同時(shí)擴(kuò)增曲線(圖4)呈平滑的S形,故判定這些蚊樣品中含有新型AKAV。同時(shí)使用RT-PCR進(jìn)行檢測,結(jié)果也均呈陰性。
以來自防城港市、東興市、北海市、寧明縣及大新縣的新型AKAV陽性樣品為模板,采用RT-PCR擴(kuò)增新型AKAV的S基因,分別命名為GX2019-FC、GX2019-Dox、GX2019-BH、GX2019-NM和GX2019-DX,并與近年來周邊省份的AKAV毒株及國內(nèi)外的AKAV代表毒株進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5株毒株均屬于基因Ia型(圖5),且與廣西竹鼠源新型AKAV的相似性高達(dá)95.6%~100.0%,均為新型AKAV;與近年來云南、湖南、廣東從迷糊蚊子、中華按蚊、三帶喙庫蚊和蠓蟲分離毒株的相似性為87.4%~98.5%,尤其與廣東和湖南的AKAV分離毒株相似性較高。
蚊子是蚊媒病毒的重要傳播媒介,目前已知蚊子可傳播包括乙型腦炎、登革熱和寨卡等在內(nèi)的300余種人獸共患傳染病。其中,AKAV于1961年在日本首次被發(fā)現(xiàn),之后相繼在澳大利亞、韓國、美國、東南亞及非洲部分國家出現(xiàn),1972—1975年曾在日本暴發(fā)而造成約42000頭小牛出生缺陷(任鵬飛,2019)。AKAV于1994年首次在我國被報(bào)道,1996年在上海暴發(fā)導(dǎo)致大量胎牛死亡;目前已證實(shí)我國有24個(gè)?。ㄊ小^(qū))暴發(fā)流行,其中廣西的牛羊抗體陽性率高達(dá)54.11%(林俊等,2014)。廣西擁有約800 km的邊境線,邊境地區(qū)主要位于北回歸線以南,氣候溫暖、降雨豐沛,非常適合蚊蟲孳生。隨著“一帶一路”倡議的提出,我國與東盟國家的貿(mào)易、人口流動(dòng)越來越頻繁,廣西也成為多種新發(fā)和再發(fā)傳染病的高危地區(qū),不僅威脅著居民的公共衛(wèi)生安全,還給動(dòng)物疫病防控帶來一定壓力。
本課題組于2016年首次在廣西竹鼠中分離獲得新型AKAV,隨后周邊省份云南、四川、湖南、廣東及海南也相繼在蚊蠓中檢出與新型AKAV高度同源的AKAV,但尚未證實(shí)廣西蚊子攜帶有新型AKAV(Tang et al.,2017;宋頌,2018;范娜,2019;吳德等,2019;Cao et al.,2019)。唐海波等(2018)針對(duì)新型AKAV的M基因建立了RT-PCR檢測方法,其最低檢測限為1.0×10copies/μL。在此基礎(chǔ)上,本研究針對(duì)新型AKAV的S基因和M基因建立SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法,最低檢測限分別為1.0×10copies/μL和1.0×10copies/μL,更適用于檢測病毒拷貝數(shù)低的樣品,同時(shí)具有較好的特異性和重復(fù)性。采用建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR成功從廣西邊境地區(qū)防城港市、東興市、寧明縣、大新縣及北海市的阿蚊和庫蚊中檢出新型AKAV。與周邊省份不同,本研究在阿蚊中檢出新型AKAV,但未在按蚊中檢出,證實(shí)阿蚊也是新型AKAV的傳播媒介。
此外,與云南分離株DHL10M110(GenBank登錄號(hào)KY284023)相比,新型AKAV毒株GXLCH16-70在NSs蛋白氨基酸序列中存在2處氨基酸位點(diǎn)差異,即S22N和F70S。為此,設(shè)計(jì)S基因擴(kuò)增引物(AKAVSF/AKAVSR),使擴(kuò)增片段涵蓋這2處氨基酸差異位點(diǎn)而用于毒株鑒別。除了可用于SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測外,AKAVSF/AKAVSR還能用于S基因片段克隆。本研究結(jié)果表明,從廣西邊境地區(qū)蚊樣品中檢出的AKAV毒株為新型AKAV,S基因變異分析結(jié)果顯示這些毒株均屬于基因Ia型,與廣東和湖南蠓蟲、中華按蚊、致倦庫蚊分離毒株具有較高的相似性,推測新型AKAV已在廣西周邊省份流行,但是否能感染牛羊尚有待進(jìn)一步探究。
針對(duì)新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn),更適用于檢測病毒拷貝數(shù)低的樣品。此外,從廣西邊境地區(qū)蚊樣品中檢出的AKAV毒株均為新型AKAV,屬于基因Ia型,與廣東和湖南蠓蟲、中華按蚊、致倦庫蚊分離毒株具有較高的相似性,推測新型AKAV已在廣西周邊省份流行。