張 齊，李勝忠*，邱弈樹，劉長龍

（1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2福?？h海富特種魚養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，新疆阿勒泰 836400）

0 引言

【研究意義】湖擬鯉（）隸屬于鯉科（Cyprinidae）擬鯉屬（），廣泛分布在歐洲各水域及亞洲東部的鄂畢河和勒拿河，在我國僅見于新疆額爾齊斯河、烏倫古湖、博斯騰湖及賽里木湖（李鴻，2009）。近年來，受水利工程建設(shè)、過度捕撈和環(huán)境變化等因素的影響，額爾齊斯河水系湖擬鯉種群數(shù)量急劇下降，2019年湖擬鯉被列為新疆Ⅱ級保護(hù)魚類（郭炎等，2021）。因此，開展湖擬鯉繁殖生物學(xué)研究對其人工繁殖和增殖放流等具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】在湖擬鯉繁殖生物學(xué)特性方面，左昌培等（2001）曾指出布倫托海湖擬鯉為一次性產(chǎn)卵魚類，黏性卵，水溫在12～23 ℃時其孵化期為8～9 d；李鴻（2009）研究得出烏倫古湖湖擬鯉個體絕對繁殖力（）與全長（TL）的回歸方程式為=2.0×10TL，個體絕對繁殖力與體質(zhì)量（）的回歸方程式為=165.87-850.7。精子活力是決定精液質(zhì)量及其受精能力的先決條件之一，Na和K等離子調(diào)節(jié)魚類精子細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，葡萄糖和果糖等糖類補償魚類精子運動過程中的能量消耗，pH和溫度則直接影響魚類精子的存活，因此，魚類精子活力受滲透壓、離子、糖類、pH及溫度等因素的多重影響（鄧岳松和林浩，1999）。Mansour等（2002）研究發(fā)現(xiàn)非洲鯰魚（）精子在水中的持續(xù)運動時間為30 s，而在NaCl溶液中可延長至40 s；Linhart等（2003）研究證實Na、K是長吻鱘（）精漿中的主要金屬離子；He等（2004）研究發(fā)現(xiàn)條紋鱸魚（）精子在與精漿等滲350 mOsm/kg溶液中能保持運動狀態(tài)，當(dāng)滲透壓達(dá)600 mOsm/kg時精子運動受到抑制；Wilson-Leedy等（2009）研究發(fā)現(xiàn)pH、Ca或K對斑馬魚（）精子的運動速度影響不明顯；Lahnsteiner和Mansour（2012）研究發(fā)現(xiàn)，溫度過低或過高均會影響魚類精子活力，春季產(chǎn)卵的茴魚（）較冬季產(chǎn)卵的褐鱒（）和江鱈（）溫度適應(yīng)范圍廣；Bondarenko等（2014）研究表明，在相同滲透壓下，美洲紅點鮭魚（）精子在Na溶液中的活力比在果糖溶液中的強；張濤等（2017）研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度為180 mmol/L時高體雅羅魚（）的快速運動壽命（Fast movement time，F(xiàn)T）和壽命時間（Life time，LT）最長；Dumomé等（2018）研究表明，1 mmol/L K可抑制鮭魚（）精子運動，但K濃度被稀釋即可觸發(fā)cAMP依賴性信號級聯(lián)反應(yīng)，精子解除抑制效果開始運動；胡瓊等（2019）采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到厚唇裂腹魚（）精子FT最長時的復(fù)方激活液為氯化鈉164.78 kPa、丙三醇216.55 kPa、葡萄糖208.43 kPa；韓峰等（2021）研究得出北方須鰍（）的適宜pH范圍為7.0～8.0。【本研究切入點】體外受精魚類的精子活力受滲透壓、離子、溫度及pH等因素影響，但至今鮮見有關(guān)湖擬鯉精子活力調(diào)控的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究Na、K、pH及3種單糖對湖擬鯉精子活力的單獨調(diào)控和綜合調(diào)控，篩選出湖擬鯉精子的適宜激活配方，為其人工繁殖及種質(zhì)資源保護(hù)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湖擬鯉于2021年4月28日—5月5日采自新疆福?？h烏倫古湖，根據(jù)鱗片年齡鑒定法選取體長相近的性成熟野生雄魚共15尾，2～3齡，體長7.2～10.0 cm，體質(zhì)量7.50～17.32 g。氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、果糖、半乳糖、氫氧化鈉及鹽酸均為國產(chǎn)分析純，溶劑為蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 精液采集 挑選成熟度好的湖擬鯉雄魚，用干凈毛巾擦去魚體表面及生殖孔附近的水分，輕壓魚腹部使精液流出，滴入準(zhǔn)備好的干燥潔凈培養(yǎng)皿中備用。采集精液時要避免陽光和高溫的影響，試驗精液應(yīng)為乳白色、黏稠狀，無血無尿液等污染。

1.2.2 單因素調(diào)控試驗設(shè)計 以氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、果糖、半乳糖為溶質(zhì)，根據(jù)范特霍夫公式計算并配制不同滲透壓梯度的激活液（胡瓊等，2019），以蒸餾水（0 kPa）為對照組。由于試劑受配制時溫度、試驗操作等影響，調(diào)控試劑以校準(zhǔn)值為準(zhǔn)，其中，Na滲透壓梯度為0、94.12、188.24、282.36、376.48、470.60 和564.72 kPa；K滲 透 壓 梯 度 為0、70.59、141.18、211.77、282.36和352.95 kPa；葡萄糖、果糖、半 乳 糖 滲 透壓 梯 度 為0、117.65、235.30、352.95、470.60和588.25 kPa。用0.1 mol/L鹽酸溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液與蒸餾水分別配制7種不同pH的激活液，激活液pH梯度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。

1.2.3 多因素調(diào)控試驗設(shè)計 根據(jù)單因素調(diào)控試驗結(jié)果，以魚類精子的FT和LT為指標(biāo)，選取果糖、pH和Na為綜合調(diào)控因素進(jìn)行L（3）正交試驗設(shè)計，每個試驗點重復(fù)3次。

1.3 精子活力觀察

在10×40倍顯微鏡視野下用牙簽蘸取少許精液與載玻片上的激活液迅速混合均勻，觀察并記錄湖擬鯉精子活動時間。每個滲透壓梯度重復(fù)3次。精子活力觀察標(biāo)準(zhǔn)參照蘇德學(xué)等（2004a，2004b）的方法，當(dāng)視野中有70%以上的精子從呈黑點狀看不清運動軌跡到可看清運動軌跡，即為精子的FT；當(dāng)視野中有95%以上的精子從激活到停止顫動，則為精子的LT；精子激活后視野中運動精子占所有精子的百分?jǐn)?shù)即為精子激活率（Activation rate，AR）。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0分別進(jìn)行單因素方差分析、Duncan’s多重比較、正交試驗分析及多因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖擬鯉精子活力單獨調(diào)控結(jié)果

湖擬鯉精子活力指標(biāo)（FT、LT和AR）在Na溶液中的整體調(diào)控效果優(yōu)于K溶液（圖1）。在94.12～564.72 kPa的Na溶液中，湖擬鯉精子活力隨滲透壓的增加呈先升后降的變化趨勢，當(dāng)滲透壓為282.36 kPa時，F(xiàn)T和LT達(dá)最大值，分別為40.00和285.33 s，F(xiàn)T和LT顯著高于其他滲透壓處理組（0.05，下同），滲透壓超過282.36 kPa時，湖擬鯉精子活力逐漸下降。在70.59～211.77 kPa的K溶液中，湖擬鯉精子的FT和LT隨滲透壓的增加而逐漸上升，在211.77 kPa時達(dá)峰值，分別為36.00和130.33 s，二者也顯著高于其他滲透壓處理組，滲透壓超過211.77 kPa時，湖擬鯉精子活力開始下降?？梢姡谶m宜滲透壓條件下，Na和K對湖擬鯉精子活力均有促進(jìn)作用。

湖擬鯉精子活力指標(biāo)（FT、LT和AR）在葡萄糖和果糖溶液中的整體調(diào)控效果優(yōu)于半乳糖溶液。在117.65～588.25 kPa的葡萄糖、果糖和半乳糖溶液中，湖擬鯉精子活力隨滲透壓的增加均呈先升后降的變化趨勢。其中，葡萄糖溶液的滲透壓為352.95 kPa時，湖擬鯉精子的FT和LT達(dá)最大值，分別為43.67和355.33 s，二者極顯著高于對照組（0.01，下同）；果糖溶液的滲透壓為352.95 kPa時，湖擬鯉精子活力最強，F(xiàn)T、LT和AR分別為45.00 s、372.67 s和90%，顯著高于其他滲透壓處理組；半乳糖溶液的滲透壓為235.30 kPa時，湖擬鯉精子活力最強，F(xiàn)T、LT和AR分別為40.00 s、357.00 s和90%，也顯著高于其他滲透壓處理組?？梢?，在適宜滲透壓條件下，葡萄糖、果糖和半乳糖3種單糖對湖擬鯉精子活力均有促進(jìn)作用。

湖擬鯉精子在pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)均有一定活力，尤其在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)湖擬鯉精子的FT、LT和AR均隨pH的升高而呈逐漸上升趨勢。在pH 8.0時，湖擬鯉精子的FT、LT和AR達(dá)峰值，分別為30.00 s、100.33 s和90%，其中，F(xiàn)T顯著高于其他pH處理組；LT則表現(xiàn)為除pH 8.5組外，極顯著高于其他pH處理組。表明湖擬鯉精子在弱堿性溶液中的活力更強。

2.2 湖擬鯉精子活力綜合調(diào)控結(jié)果

2.2.1 果糖、pH和Na對湖擬鯉精子活力綜合調(diào)控的極差分析結(jié)果 極差分析結(jié)果（表1）表明：果糖、pH、Na的FTk最大值分別為47.55（FTk）、42.33（FTk）和44.44（FTk），LTk最大值分別為296.44（LTk）、260.00（LTk）和263.33（LTk），說明果糖、pH和Na對湖擬鯉精子的FT和LT調(diào)控結(jié)果一致，因此確定綜合調(diào)控湖擬鯉精子活力的最佳配方為：果糖溶液滲透透壓117.65 kPa，pH 8.0，Na溶液滲透透壓188.24 kPa，對應(yīng)的FT和LT分別達(dá)58.33和370.00 s。果糖、pH和Na的FTR分別為19.89、7.11和17.00，LTR分別為119.11、51.89和103.89，即果糖、pH和Na對湖擬鯉精子活力的調(diào)控力度為果糖＞Na＞pH。

2.2.2 果糖、pH和Na對湖擬鯉精子活力綜合調(diào)控的方差分析結(jié)果 由表2可知：果糖、pH、Na的分別為25.03、3.29和22.30，果糖和Na的均大于，pH的則小于，說明果糖和Na對湖擬鯉精子的FT調(diào)控有顯著效果，而pH對湖擬鯉精子的FT影響不顯著（0.05，下同）。由表3可知：果糖、pH、Na的分別為26.36、5.43和24.73，果糖和Na的大于，pH的也小于，說明果糖和Na對湖擬鯉精子的LT調(diào)控有顯著效果，而pH對湖擬鯉精子的LT影響不顯著。綜上所述，果糖和Na對湖擬鯉精子的FT和LT調(diào)控效果有顯著影響，而pH的影響不顯著。

3 討論

3.1 Na+和K+對湖擬鯉精子活力的影響

Na和K是魚類血漿、精漿的主要組分，也是構(gòu)成精漿滲透壓的主要離子。外界環(huán)境滲透壓及離子濃度是激活或抑制魚類精子活力的關(guān)鍵。Na是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡的主要因素，適宜濃度的Na可顯著提高黃顙魚（）（楊彩根等，2003）、厚唇裂腹魚（胡瓊等，2019）及拉氏鱥（）（吳晨等，2022）等魚類的精子活力。本研究結(jié)果表明，Na在滲透壓94.12～282.36 kPa范圍內(nèi)，湖擬鯉精子的FT和LT均隨Na滲透壓的增加而逐漸上升，當(dāng)滲透壓為282.36 kPa時FT和LT達(dá)最大值，說明適宜濃度的Na可顯著提高湖擬鯉精子活力。已有研究表明，K對鮭科魚類精子活化存在一定抑制作用，但對鯉科魚類精子活力有明顯促進(jìn)作用，如適宜濃度的K可顯著提高丁鱥（）（蘇德學(xué)等，2004b）、蛇鮈（）（丁淑荃等，2012）及大鱗鲃（）（丁辰龍等，2018）等鯉科魚類精子的運動能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，K在滲透壓70.59～211.77 kPa范圍內(nèi)，湖擬鯉精子的FT和LT均隨K滲透壓的增加而逐漸上升，在211.77 kPa的K溶液中FT和LT達(dá)峰值，說明適宜濃度的K對湖擬鯉精子活力具有明顯促進(jìn)作用。K提升湖擬鯉精子運動時間和延長壽命的效果不及Na，尤其是延長湖擬鯉精子LT的作用不明顯，與K在翹嘴紅鲌（）（王芳等，2011）和高體雅羅魚（張濤等，2017）精子LT上的表現(xiàn)相似。K延長精子存活時間的作用不僅與滲透壓有關(guān)，還與溶質(zhì)自身有關(guān)，究其原因可能是：（1）湖擬鯉的物種屬性不同所致；（2）K對湖擬鯉精子LT的調(diào)控不敏感。綜上所述，Na和K主要是通過改變滲透壓來調(diào)控湖擬鯉精子活力。

3.2 葡萄糖、果糖和半乳糖對湖擬鯉精子活力的影響

葡萄糖、果糖和半乳糖是魚類精漿中的主要碳水化合物，對調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡具有重要作用。體外受精魚類的精子具有三羧酸循環(huán)代謝能力，可通過氧化作用利用外界環(huán)境中的小分子單糖，以補充自身能量消耗，為精子運動提供能量（Kruger et al.，1984）。已有研究證實，適宜濃度的葡萄糖、果糖和半乳糖對凹目白鮭（）（李勝忠等，2005）、白緣?（）（柴毅等，2009）及大鱗副泥鰍（）（蘇應(yīng)兵等，2011）等魚類的精子活力有良好提升作用，但存在物種屬性差異。此外，不同魚類對單糖的吸收和利用也存在差異，如葡萄糖對光唇魚（）（張玉明等，2009）、細(xì)鱗斜頜鲴（）（徐萬土等，2013）及馬口魚（）（鄭學(xué)斌等，2018）等魚類的精子活力無明顯促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明，適宜濃度的葡萄糖、果糖和半乳糖均可提高湖擬鯉精子活力，當(dāng)葡萄糖和果糖溶液的滲透壓為352.95 kPa或半乳糖溶液的滲透壓為235.30 kPa時，湖擬鯉的精子活力最強；湖擬鯉精子在3種單糖溶液中的FT和LT變化規(guī)律與在Na和K溶液中的變化規(guī)律相似，均隨滲透壓的增加呈先升后降的變化趨勢，說明糖類和離子一樣都具有調(diào)節(jié)滲透壓平衡的作用。

3.3 pH對湖擬鯉精子活力的影響

pH是影響魚類精子活力的重要因素之一。已有研究表明，魚類精子處于酸性環(huán)境中其活力會受到抑制或減弱，大多數(shù)淡水魚類的精漿pH保持在7.0～9.0，即在偏堿性溶液中精子活力較強（楊彩根等，2003；王位瑩，2015；王雨等，2020；韓峰等，2021）。翹嘴紅鲌精子在pH 8.5的條件下活力最高，其FT和LT分別為25.17和38.15 s（王芳等，2011）；薩羅羅非魚（）精子在pH 7.5的條件下活力最強，對應(yīng)的FT、LT、AR 分別為66.33 s、933.17 s和90%（羅明坤等，2014）；在pH 8.0的條件下拉氏鱥的精子活力最強，其FT和LT分別為45.42和475.02 s（吳晨等，2022）。本研究結(jié)果表明，在pH 7.5～8.5的范圍內(nèi)湖擬鯉精子活力較強，于pH 8.0時FT和LT達(dá)最大值，分別為30.00和100.33 s，與上述研究結(jié)果基本一致。

3.4 果糖、pH和Na+對湖擬鯉精子活力的綜合影響

魚類精子在精巢和精漿中一般不活動，只有當(dāng)精子被排到體外并被激活液或水環(huán)境稀釋后才能運動。單因素激活液和多因素激活液對魚類精子活力均有較好的調(diào)控效果，但多因素激活液對魚類精子活力調(diào)控機制更復(fù)雜、調(diào)控效果更豐富。王位瑩（2015）研究得出氯化鈉42.3 mmol/L、葡萄糖124.5 mmol/L，pH 8.1時，江鱈精子活力的調(diào)控效果最佳；韓峰等（2021）研究發(fā)現(xiàn)北方須鰍精子在Na68 mmol/L、K80 mmol/L、Ca50 mmol/L、葡萄糖180 mmol/L的混合激活液中活力最強；吳晨等（2022）研究證實Na100 mmol/L、K75 mmol/L的復(fù)合激活液對拉氏鱥精子FT無顯著效果，但對提高精子LT效果極顯著。本研究的正交試驗結(jié)果顯示，果糖、pH和Na對湖擬鯉精子活力的調(diào)控力度為果糖＞Na＞pH；最優(yōu)激活配方為果糖溶液滲透壓117.65 kPa、pH 8.0、Na溶液滲透壓188.24 kPa，較單因素最佳滲透壓對湖擬鯉精子活力的調(diào)控效果更優(yōu)。究其原因可能是：果糖作為單糖物質(zhì)能被精子直接利用轉(zhuǎn)化為能量；Na通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，減少魚類精子維持滲透壓平衡消耗的能量；大多數(shù)魚類精漿pH偏堿性，其精子在中性或弱堿性環(huán)境中的活力好且運動時間長。多因素對精子活力呈協(xié)同調(diào)節(jié)作用，使激活液對精子活力具有最佳的調(diào)控效果，但在實際生產(chǎn)中影響魚類精子活力的因素更多，對于優(yōu)化湖擬鯉精子活力的激活配方仍需進(jìn)一步研究驗證。

4 結(jié)論

適宜濃度的Na、K、葡萄糖、果糖及半乳糖對湖擬鯉精子活力均具有較好的促進(jìn)作用，主要是通過改變滲透壓來調(diào)控湖擬鯉精子活力；適宜的pH為7.5～8.5。通過正交試驗篩選出的湖擬鯉進(jìn)展最優(yōu)激活配方為果糖溶液滲透壓117.65 kPa、pH 8.0、Na溶液滲透壓188.24 kPa，其調(diào)控效果優(yōu)于單因素最優(yōu)滲透壓，調(diào)控力度為果糖＞Na＞pH。