劉海濤，王 嬌，劉大群，2，李亞寧*

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

0 引言

【研究意義】煙草灰霉病是煙草整個生長期尤其是育苗期常發(fā)的世界性真菌病害（盧燕回等，2012），近年來，由于育苗集中化，該病害發(fā)生越發(fā)頻繁，適宜條件下短時間內(nèi)即可造成大面積傳播和流行（陳宇春等，2020），嚴(yán)重時發(fā)病率可達(dá)100%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其病原為灰葡萄孢（）（董金皋，2007），可引起煙苗黑莖、枯萎和葉斑等癥狀，濕度大時葉斑及病莖上密生灰色霉層。該病具有潛伏期較短、傳播速度較快、易感染易發(fā)病等特點，且病原菌侵染煙草葉片可造成煙葉組織壞死、腐爛，對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)造成一定影響（鄧真等，2012）。世界上至少有97個國家和地區(qū)種植煙草，而我國煙葉產(chǎn)量約占世界煙葉總產(chǎn)量的36%，是最大的產(chǎn)煙國（張紅濤等，2020），且我國各大煙區(qū)的氣候及煙草種植品種等各不同，其中福建（鄧真等，2012）、廣西（譚海文，2012）、陜西（田佳等，2016）和黑龍江（周浩等，2019）等地?zé)煵莼颐共“l(fā)生較普遍。因此，煙草灰霉病防治是煙草生產(chǎn)中重要一環(huán)，對煙草產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】生產(chǎn)上防治煙草灰霉病的常用藥劑有多菌靈、甲基硫菌靈、異菌脲、乙烯菌核利和嘧菌環(huán)胺等（張銳，2017），但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用容易引起農(nóng)藥殘留、病原菌產(chǎn)生抗藥性等問題（鄭媛萍，2018；宋郝棋等，2022），因此，煙草綠色防控技術(shù)越來越受到人們的重視（曾濤等，2022），主要包括煙草抗病性誘導(dǎo)（Naidu，2001）、拮抗微生物（陳磊，2021；張蒙蒙等，2022）、生物農(nóng)藥（王軍等，2018；杜傳印等，2019；Tang et al.，2022）等。利用物理、化學(xué)和生物方法預(yù)先處理植物，使感病反應(yīng)產(chǎn)生局部或系統(tǒng)的抗性稱為誘導(dǎo)抗病性（張元恩，1987）。誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性（Induced systemic resistance，ISR）可有效提高植株抗病能力（Kloepper et al.，2004），芽孢桿菌、木霉菌和鏈霉菌等生防微生物均可引起ISR。在擬南芥上發(fā)現(xiàn)假單胞菌可誘導(dǎo)植株產(chǎn)生ISR（van Loon et al.，1998）。煙草誘導(dǎo)抗病性對環(huán)境毒副作用小，是一種有潛力的煙草病害防治手段（李巧玲等，2015）。楊獻(xiàn)營（1993）系統(tǒng)總結(jié)了用誘導(dǎo)抗病性的方法防治煙草病害的途徑；張莉等（2017）用易脆毛霉多糖抑制煙草花葉病毒，防效達(dá)62%。脂氧合酶（LOX）、過氧化氫酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶與植物的抗病性密切相關(guān)，可作為衡量誘導(dǎo)抗病性的重要指標(biāo)；此外，植物受到誘導(dǎo)物的刺激后，也會引發(fā)活性氧暴發(fā)、胼胝質(zhì)沉積和抗病相關(guān)基因上調(diào)（Lu et al.，2019；鳳琦和張晶鈺，2020），以及抗病相關(guān)蛋白PR蛋白的產(chǎn)生（梁穎博等，2019）。目前研究較多的PR基因有、和等，基因超量表達(dá)可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性（van Loon and van Strien，1999；田華，2016），基因表達(dá)產(chǎn)生的類甜蛋白可降解真菌細(xì)胞壁，起到抗病作用（李白，2011）?；虮磉_(dá)植物苯丙烷類代謝限速酶，可調(diào)控植保素等的合成（朱海生等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c】玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63是分離自馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤的生防鏈霉菌（Liu，1992），李亞寧等（2017）從該生防菌發(fā)酵液中提取到一組具有抑菌活性的多烯大環(huán)內(nèi)酯類代謝產(chǎn)物Roflamycoin和Menmyco-A（簡稱R&M）。本課題組前期研究表明R&M可誘導(dǎo)黃瓜植株產(chǎn)生對白粉病的抗性（甄丹妹等，2019）、煙草植株產(chǎn)生對煙草灰霉病的抗性，但R&M誘導(dǎo)的煙草植株產(chǎn)生對灰霉病抗性的作用機制尚待進(jìn)一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在實驗室條件下，采用生理生化及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測的方法，對4～5葉期本生煙草經(jīng)R&M誘導(dǎo)處理后植株非R&M接觸煙葉不同時間的抗病相關(guān)酶活性、抗病相關(guān)物質(zhì)含量及抗病相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行測定分析，旨在為利用R&M綠色防控植物灰霉病等重要病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：本生煙（），由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心保存提供。供試菌株：煙草灰霉病菌，采集自田間發(fā)病的煙草植株，用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行病原菌的單孢純化，4 ℃保存?zhèn)溆茫皇褂们霸赑DA培養(yǎng)基上保濕培養(yǎng)5～7 d。供試藥劑：玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產(chǎn)物R&M（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心自制）。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試煙草種植 溫室內(nèi)將本生煙播種于育苗穴盤中，25～30 ℃、光照14 h條件下土培（營養(yǎng)土∶蛭石=2∶1）種植，待長至2～3葉齡時移栽至直徑為13 cm的花盆中，每盆1株，4～5葉期時用于后續(xù)試驗。

1.2.2 玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液的制備及R&M提取按照張艷（2006）的方法進(jìn)行玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液的制備，按照趙志泉等（2007）的方法進(jìn)行玫瑰黃鏈霉菌活性代謝產(chǎn)物R&M的提取。

1.2.3 過敏反應(yīng)（HR）的染色驗證 采用0.4%臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行驗證。依據(jù)本課題組前期R&M對煙草灰霉病誘導(dǎo)抗病性最佳誘抗?jié)舛仍囼灲Y(jié)果，將80 mg/L的R&M注射于4～5葉期本生煙葉片中，以清水作對照（CK），每處理1株，3次重復(fù)，處理12 h后觀察，待有明顯壞死斑出現(xiàn)后將葉片剪下，與對照組一起放入抽濾瓶中，加入0.4%臺盼藍(lán)染色液，真空抽濾5 min，用95%乙醇脫色至組織透明，于顯微鏡下觀察。

1.2.4 R&M誘導(dǎo)抗病標(biāo)志基因的表達(dá) 依據(jù)本課題組前期R&M對黃瓜白粉病誘導(dǎo)抗病性最佳誘抗?jié)舛仍囼灲Y(jié)果，將100 mg/L的R&M注射于4～5葉期本生煙葉片中，以清水作對照（CK），每處理1株，3次重復(fù)，處理后4 h剪下處理葉片（約100 mg），用錫箔紙包裹后，迅速放入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎冒攵康姆椒z測基因的表達(dá)情況。PCR擴(kuò)增引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×PCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 模板2.0 μL，ddHO 6.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.5 非藥劑接觸煙葉中CAT和LOX活性及過氧化氫（HO）含量測定 將溫室種植的4～5葉期本生煙幼苗分成2組，每組處理18株，3次重復(fù)，一組植株的一側(cè)全部葉片進(jìn)行套袋，不進(jìn)行任何藥劑處理，另一側(cè)葉片進(jìn)行噴施80 mg/L R&M藥劑處理；對照組植株的一側(cè)全部葉片進(jìn)行套袋，不進(jìn)行任何藥劑處理，另一側(cè)葉片進(jìn)行噴施清水處理（CK）。分別于處理0、1、2、3、5和7 d時取本生煙幼苗非藥劑接觸葉片（即套袋一側(cè)無R&M接觸葉片）（胡能等，2017），采用北京索萊寶生物技術(shù)有限公司的相關(guān)試劑盒測定CAT和LOX活性及HO含量。

1.2.6 木質(zhì)素合成基因及病程相關(guān)蛋白基因和相對表達(dá)量測定 將溫室種植的4～5葉期本生煙幼苗分成2組，每組處理10株，3次重復(fù)，一組用100 mL濃度為80 mg/L的R&M溶液灌根處理2 d后，于上部第3片葉采用灰霉菌孢子懸浮液進(jìn)行摩擦接種；對照組用100 mL清水灌根處理2 d后，于上部第3片葉采用清水進(jìn)行摩擦接種（CK）。接種處理后1、12、24、48、72和120 h，用去酶、滅菌剪刀剪下各處理組煙苗對應(yīng)時間段的非接種灰霉病菌葉片的相同部位（約100 mg），采后立即稱重，并放入-80 ℃冰箱中低溫保存。采用實時熒光定量PCR檢測樣品、和基因的相對表達(dá)量。qRT-PCR擴(kuò)增引物序列見表1，試驗所用試劑均購自TaKaRa公司。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×TransStartR Top Green qPCR SuperMix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddHO 7.2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性0.5 min；94 ℃5 s，56 ℃15 s，72 ℃10 s，進(jìn)行40個循環(huán)，設(shè)置熔解曲線。反應(yīng)結(jié)束后，查看結(jié)果，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，基因的相對表達(dá)量利用2方法分析基因轉(zhuǎn)錄的差異。

1.3 統(tǒng)計分析

運用SPSS 21.0和Excel 2016進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 R&M誘導(dǎo)抗病性驗證結(jié)果

2.1.1 HR反應(yīng)染色結(jié)果 將80 mg/L的R&M注射于4～5葉期本生煙葉片中，以清水作對照。參照郭景紅等（2018）的方法進(jìn)行樣品的采集、處理、顯微觀察。結(jié)果（圖1-a和圖1-b）顯示，經(jīng)R&M處理的煙草葉片在臺盼藍(lán)作用下被染成藍(lán)色，CK的煙草葉片未能被染色，表明出現(xiàn)了micro-HR反應(yīng)，R&M能使煙葉細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。

2.1.2 抗病標(biāo)志基因的表達(dá) 植株受到病蟲害等外界刺激后，常出現(xiàn)一系列生理反應(yīng)，在受害部位出現(xiàn)壞死斑，伴隨HR反應(yīng)的標(biāo)志基因的表達(dá)。由圖1可知，100 mg/L R&M處理后，經(jīng)RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)，煙草葉片中基因明顯上調(diào)表達(dá)，而清水對照中基因不表達(dá)，表明R&M可誘導(dǎo)煙草葉片出現(xiàn)過敏反應(yīng)。

2.2 R&M處理后煙草葉片中CAT和LOX活性及H2O2含量變化

2.2.1 CAT活性變化 CAT是一種誘導(dǎo)酶，由生物刺激素引起的植物體內(nèi)CAT活性的增強與植株抗病性呈正相關(guān)。由圖2可知，噴施R&M 2 d后CAT活性一直處于增強狀態(tài)，且活性始終顯著高于CK（＜0.05，下同），表明噴施R&M可誘導(dǎo)煙葉CAT活性增高，從而提高植物抗病性。

2.2.2 LOX活性變化 圖3顯示，噴施R&M后第3 d ，煙草葉片中LOX活性開始顯著高于CK，第7 d達(dá)最高值，為3600 U/g，是對照的1.66倍。LOX是茉莉酸（JA）形成的關(guān)鍵酶，推測R&M通過誘導(dǎo)煙葉LOX活性增強而參與JA合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而提高植物抗病性。

2.2.3 HO含量變化 活性氧暴發(fā)在HR反應(yīng)中起著非常重要的作用，活性氧主要有超氧陰離子、羥自由基和HO。由圖4可看出，噴施R&M后第1 d，煙葉中HO含量迅速達(dá)最高值，為CK的1.13倍；噴施R&M 3 d后，可能由于體內(nèi)防御酶活性增高，將HO分解為水，導(dǎo)致HO含量降低，且第2 d后HO含量逐漸降低，使植物避免了活性氧含量長時間過高對細(xì)胞的損害。

2.3 R&M處理后PAL、PR1和PR5基因相對表達(dá)量變化

2.3.1基因相對表達(dá)量變化基因是植物體內(nèi)控制木質(zhì)素合成的關(guān)鍵基因，其表達(dá)的苯丙氨酸解氨酶可促進(jìn)酚類相關(guān)物質(zhì)的合成，以及合成與抗病相關(guān)的木質(zhì)素（朱海生等，2018）。如圖5所示，R&M處理葉片中基因的相對表達(dá)量在處理后24 h達(dá)最高值，為CK的25.37倍，此后基因表達(dá)量下降；在1～120 h，R&M處理的基因表達(dá)量均顯著高于CK。表明R&M可誘導(dǎo)煙草抗病相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強植株系統(tǒng)抗病性。

2.3.2相對表達(dá)量的變化基因表達(dá)產(chǎn)物為類似β-1，3-葡聚糖酶活性的PR1蛋白，在抗真菌病害中發(fā)揮重要作用（Somssich et al.，1988）。由圖6可見，R&M處理葉片中基因的相對表達(dá)量在處理后24 h達(dá)最高值，為CK的11.23倍。表明R&M通過增強基因的表達(dá)而提高煙草植株對灰霉病菌的抗性。

2.3.3基因相對表達(dá)量變化基因產(chǎn)物為類甜蛋白，可降解真菌細(xì)胞壁，起到抗真菌病害的作用（李白，2011）。由圖7可見，R&M處理葉片中基因的相對表達(dá)量在處理后72 h達(dá)最高值，為CK的11.17倍。表明R&M通過增強基因的表達(dá)而提高煙草植株對灰霉病菌的抗性。

3 討論

在生產(chǎn)實際中，通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性防控植物真菌病害是一種安全有效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的病害防治途徑，已受到研究者們的關(guān)注和重視，如化學(xué)誘抗劑BABA、BTH和CTS等的使用（朱路路，2014）。農(nóng)用抗生素誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性，其誘抗效果可通過植株內(nèi)相關(guān)防御酶活性變化、防御物質(zhì)含量變化及抗病相關(guān)基因表達(dá)量變化等反映出來（Lu et al.，2019；鳳琦和張晶鈺，2020）。甄丹妹等（2019）研究了R&M誘導(dǎo)黃瓜白粉病抗性，發(fā)現(xiàn)這種誘導(dǎo)作用在病原菌侵染的條件下表現(xiàn)得更明顯。

正常生長的植株受到誘導(dǎo)處理后，與抗病反應(yīng)相關(guān)的酶活性升高是誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的作用機制之一，其中CAT（Ehret et al.，2010）和LOX（Il' inskaya et al.，2000）活性的變化通常作為衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)抵制病原微生物侵染的重要指標(biāo)。已有研究表明，CAT活性可由生物刺激素誘導(dǎo)增強，進(jìn)而誘導(dǎo)植株產(chǎn)生對病原菌的抗病性。本研究表明，溫室條件下，用80 mg/L R&M噴霧處理4～5葉期本生煙草植株，可誘導(dǎo)煙草葉片中CAT和LOX活性增強，噴施R&M 1 d后CAT活性即處于增強狀態(tài)，且1～7 d持續(xù)顯著高于CK；LOX活性在80 mg/L R&M處理的前2 d活性幾乎無變化，第3 d后LOX活性顯著增強。R&M誘導(dǎo)煙草植株煙葉中CAT和LOX活性增強，與杜亞楠等（2012）研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌702中分離純化的新型多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素農(nóng)抗702通過誘導(dǎo)增強CAT活性進(jìn)而增強植株抗病力的結(jié)論一致，亦與本課題組甄丹妹等（2019）前期研究發(fā)現(xiàn)R&M能誘導(dǎo)黃瓜葉片中CAT活性提高的結(jié)論一致。LOX是形成JA的關(guān)鍵酶（Oliw，2022），說明R&M也可能通過促使JA的形成，在植物體內(nèi)充當(dāng)抗病相關(guān)信號分子以促進(jìn)JA介導(dǎo)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而起到誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生抗灰霉病菌的作用。

正常生長的植株受到誘導(dǎo)后，與抗病反應(yīng)相關(guān)的活性物質(zhì)含量變化是誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的作用機制之一，其中HO含量的變化通常作為衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)抵制病原微生物侵染的重要指標(biāo)。HO具有毒性，該物質(zhì)產(chǎn)生的羥基自由基生物活性很強，因此，植株體內(nèi)過量的HO需要CAT進(jìn)行適量清除以維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)（Willekens et al.，1995）。本研究中，溫室條件下，80 mg/L R&M噴霧處理4～5葉期本生煙草植株，煙葉中防御物質(zhì)HO含量1 d后迅速達(dá)最高值，為CK的1.13倍，表明R&M能迅速激發(fā)植株細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生；在第2～3 d，可能由于體內(nèi)CAT防御酶活性持續(xù)增高，將HO分解為水，導(dǎo)致其含量第2 d后逐漸降低，并逐步穩(wěn)定在與CK相近水平，避免了植物由于活性氧長時間含量過高而損傷細(xì)胞。因此，本研究中80 mg/L R&M處理使煙葉HO含量先升高后降低這一結(jié)論符合科學(xué)邏輯，且與本課題組甄丹妹等（2019）前期研究發(fā)現(xiàn)R&M處理后1～5 d誘導(dǎo)黃瓜葉片中HO含量升高的結(jié)論一致，但相比第1張真葉展開和第2張真葉展開2/3時的黃瓜，R&M誘導(dǎo)4～5葉期本生煙草植株HO含量顯著升高出現(xiàn)的時間更早，為誘導(dǎo)處理后第1 d。研究結(jié)果充分證明R&M誘導(dǎo)植物抗病性的作用機制之一是由于R&M誘導(dǎo)了本生煙草植株體內(nèi)HO含量的暴發(fā)并最終維持其穩(wěn)態(tài)。

基因控制合成的木質(zhì)素與植物的抗病性相關(guān)聯(lián)，可參與植株的抗病防衛(wèi)反應(yīng)（朱海生等，2018）?？共∠嚓P(guān)PR基因和經(jīng)過誘導(dǎo)處理后其表達(dá)量的上調(diào)，可作為植物抗病能力增強的重要指標(biāo)（van Loon and van Strien，1999；李白，2011；田華，2016）。本研究使用80 mg/L R&M溶液灌根處理4～5葉期本生煙草2 d后接種灰霉菌孢子懸浮液，結(jié)果顯示，木質(zhì)素合成基因及病程相關(guān)PR蛋白基因、相對表達(dá)量均有不同程度上調(diào)，分別在24、24和72 h時相對表達(dá)量達(dá)最高值，R&M誘導(dǎo)不同時間后的表達(dá)量始終顯著高于CK，表明R&M的抗性誘導(dǎo)是玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63防治灰霉病的作用機制之一。

4 結(jié)論

R&M通過誘導(dǎo)煙葉產(chǎn)生過敏反應(yīng)、協(xié)調(diào)活性氧水平、增強防御酶活性、促進(jìn)抗病相關(guān)基因表達(dá)等提高煙草植株抗病性。R&M濃度在80 mg/L時即可誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生對灰霉病菌的抗病性，藥劑作用方式為噴霧，其操作簡便，發(fā)酵易獲得所需藥品。玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物R&M具有作為植物病害誘抗劑的潛力，有望應(yīng)用于植物灰霉病等重要病害的綠色防控。