何世芳，孫光軍，曾隕濤，潘忠梅，陳興江，桑維鈞，曹 毅*

（1貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州貴陽(yáng) 550081；2貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；3中國(guó)煙草總公司貴州省公司煙葉處，貴州貴陽(yáng) 550004）

0 引言

【研究意義】貴州煙草種植歷史悠久，近5年來(lái)，年均種植面積達(dá)12余萬(wàn)ha（閆新甫等，2021），為我國(guó)煙草生產(chǎn)第二大省份?？緹熥鳛橘F州最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在全省財(cái)政收入及脫貧致富方面發(fā)揮十分顯著的作用（馬云飛等，2020）。近年來(lái)，由于氣候條件變化、種植品種單一和煙田連作比例較高等原因，導(dǎo)致烤煙病害發(fā)生呈上升趨勢(shì)（商勝華等，2016）?？緹熞允斋@葉片為主，葉斑類病害是影響其產(chǎn)、質(zhì)量最重要的因素之一。附球菌屬真菌是一種重要的植物病原菌，其在煙草上可危害大田期成熟煙葉（Guo et al.，2020），也可侵染烤煙根部引起根腐病（Gai et al.，2020）。煙草附球菌葉斑病在貴州的危害有上升趨勢(shì)，因此，明確貴州省內(nèi)該病害的病原菌種類及生物學(xué)特性，對(duì)其有效防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】附球菌屬（）隸屬子囊菌門（Ascomycota）座囊菌綱（Dothideomycetes）格孢腔菌目（Pleosporales）亞隔孢殼科（Didymellaceae），該屬真菌寄主范圍廣，可侵染火龍果、高粱、獼猴桃和燕麥等多種作物（王俊麗等，2014；Stokholm et al.，2016；聶秀美等，2019；張國(guó)輝等，2021），引起根腐、葉斑、枝枯和果腐爛等癥狀，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。是2017年發(fā)表的新種，被認(rèn)為屬于內(nèi)生菌、腐生菌或半寄生菌，但對(duì)該菌病理學(xué)方面的研究較少（Chen et al.，2017）；方麗等（2021）于2018—2019年調(diào)查浙江省桐鄉(xiāng)、武義等地的杭白菊種植基地的病蟲害發(fā)生種類，發(fā)現(xiàn)sp.可引起杭白菊葉斑病，但未明確其菌株的分類地位。目前有關(guān)煙草附球菌葉斑病的研究主要集中在病害發(fā)生及病原鑒定方面，付景圓（2014）首次報(bào)道重慶地區(qū)煙草附球菌葉斑病，使用形態(tài)學(xué)觀察以及rDNA-ITS和2種序列鑒定病原菌種類，但未能鑒定到種級(jí)；Guo等（2020）報(bào)道了貴州由附球菌屬引起的煙草葉斑病，通過(guò)多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將其病原菌鑒定為；同年云南報(bào)道了由引起的煙草根腐?。℅ai et al.，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2020年本課題組在對(duì)貴州主產(chǎn)煙區(qū)煙草葉斑類病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)煙草附球菌葉斑病類似癥狀病葉，通過(guò)鏡檢測(cè)定初步判斷病原菌為附球菌屬；現(xiàn)有關(guān)于煙草附球菌葉斑病的報(bào)道主要集中在癥狀描述和病原鑒定上，尚無(wú)針對(duì)煙草附球菌葉斑病病原菌生物學(xué)特性的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)采集自貴州省的煙草附球菌葉斑病病葉進(jìn)行分離、Koch’s法則驗(yàn)證，使用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、28S rRNA（LSU）、-微管蛋白（）和RNA聚合酶II第二大亞基（）部分序列的多核苷酸序列系統(tǒng)學(xué)分析等方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，從而明確貴州煙草附球菌葉斑病的病原菌種類及生物學(xué)特性，為煙草附球菌葉斑病的綜合防治及抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年在貴州省興義市種植的云煙87采集到煙草葉斑病標(biāo)本，保濕后將其帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離純化。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、玉米粉瓊脂（CMA）、麥芽汁瓊脂（MEA）、燕麥瓊脂（OA）、察氏瓊脂（CDA）、高氏合成1號(hào)瓊脂（GSA）、水瓊脂（WA：瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）、煙葉煎汁瓊脂（TA：新鮮煙葉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、胡蘿卜瓊脂（CA：胡蘿卜200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）和松針瓊脂（PNA：新鮮松針葉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）共12種培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化及鑒定 病原菌的分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定：采用常規(guī)組織分離法對(duì)煙草附球菌葉斑病病原菌進(jìn)行分離和純化（方中達(dá)，1998），純化鑒定的菌株保存于貴州省煙草科學(xué)研究院真菌實(shí)驗(yàn)室，菌株編號(hào)YC1105。將純化菌株分別接種于PDA、OA和MEA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d后，在顯微鏡下觀察菌落和菌絲形態(tài)，同時(shí)在菌落邊緣滴加2滴1 mol/L NaOH溶液10 min后開始觀察，并記錄培養(yǎng)基的顏色變化（韓帥等，2019），繼續(xù)培養(yǎng)菌株待產(chǎn)生分生孢子后，挑取分生孢子在顯微鏡下觀察病原菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子等形態(tài)，并參照Boerema等（2004）的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：采用試劑盒（DNeasy Ultra-Clean Microbial Kit，Qiagen）提取病原菌DNA，詳細(xì)操作參照使用說(shuō)明書；將提取的DNA作為模板，使用表1引物（上海捷瑞生物工程有限公司合成）擴(kuò)增菌株序列，反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參照Chen等（2015b）的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得到的核苷酸序列通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比較，依據(jù)比對(duì)結(jié)果下載相關(guān)序列，使用MAFF（http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）和Trim AI（v.1.3）分別對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和剪切（Chen et al.，2015a），通過(guò)raxml-GUI 2.0使用最大似然法（Maximumlikelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Edler et al.，2020）。

1.2.2 病原菌致病性測(cè)定 選取盆栽管理的健康K326煙葉，采用離體葉片刺傷和無(wú)傷接種法進(jìn)行病原菌致病性測(cè)試（潘彤彤等，2020）：將菌餅（直徑6 mm）接種于有傷和無(wú)傷葉片上，用濕潤(rùn)滅菌棉花覆蓋菌餅，以接種空白PDA培養(yǎng)基作對(duì)照，每處理3次重復(fù)，于28 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，3 d后開始觀察并記錄發(fā)病情況，選取接種處產(chǎn)生明顯病斑的葉片，根據(jù)柯赫氏法則，重新分離純化并鑒定病原菌。

1.3 病原菌生物學(xué)測(cè)定

1.3.1 培養(yǎng)基對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 將培養(yǎng)5 d的菌株使用滅菌打孔器（直徑6 mm）在菌落邊緣打取菌餅，接種至12種培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基的配制參照吳希禹等（2019）的方法進(jìn)行，每種培養(yǎng)基重復(fù)3次，培養(yǎng)5和7 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況，使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.2 碳、氮源對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 參照高晉等（2020）的方法測(cè)定：以Czapek Dox Agar為基本培養(yǎng)基，以蔗糖為碳源，并用等量的葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、山梨糖醇和可溶性淀粉代替蔗糖；同理，以硝酸鈉為氮源，用等量的蛋白胨、牛肉浸粉、氯化銨、尿素、甘氨酸、丙氨酸和酵母浸粉代替硝酸鈉，以制備含有不同碳源和氮源的培養(yǎng)基。在含有不同碳、氮源的培養(yǎng)基上接種6 mm菌餅，每處理重復(fù)3次，25 ℃暗培養(yǎng)，5和7 d后測(cè)量菌落直徑。

1.3.3 溫度對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 參照郭強(qiáng)等（2019）的方法測(cè)定溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響，設(shè)5、10、15、20、25、28、30和35 ℃等8個(gè)處理，將6 mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)溫度重復(fù)3次，分別置于供試溫度的恒溫箱中培養(yǎng)，5和7 d后測(cè)量菌落直徑。

1.3.4 pH對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，pH設(shè)定為4、5、6、7、8、9和10，共7個(gè)處理，3次重復(fù)。用1 mol/LHCl和1 mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，將6 mm菌餅接種于培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)，5和7 d后測(cè)量菌落直徑。

1.3.5 光照對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 將6 mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基，設(shè)連續(xù)黑暗、連續(xù)光照和12 h/12 h光暗交替3種處理，每處理重復(fù)3次，25 ℃培養(yǎng)，5和7 d后測(cè)量菌落直徑。

1.3.6 菌絲體致死溫度測(cè)定 致死溫度參照劉思睿等（2019）的方法進(jìn)行測(cè)定：將6 mm菌餅放入無(wú)菌試管中，并加入2 mL無(wú)菌水，以45 ℃為基礎(chǔ)溫度，1 ℃為一個(gè)梯度，50 ℃為最高溫度，將其放入水浴鍋中處理10 min后迅速冷卻，轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，觀察各處理菌絲生長(zhǎng)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

病害發(fā)生于烤煙成熟期，主要危害葉片，主要癥狀為褐色病斑，圓形或橢圓形，病斑邊緣伴有黃色暈圈（圖1-A），病斑直徑0.45～0.60 cm，嚴(yán)重時(shí)病斑融合呈枯焦葉或碎葉。

2.2 病原菌致病性

接種6 d后葉片開始發(fā)病，葉片上產(chǎn)生直徑0.8～1.6 cm大小病斑，初期病斑呈淡黃色，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病斑逐漸變成褐色，外圍伴有黃色暈圈（圖1-B），無(wú)傷接種（圖1-B）及針刺接種（圖1-C）均能引起葉片發(fā)生病斑；對(duì)照葉片未產(chǎn)生病斑（圖1-D）；在發(fā)病處重新分離到的菌株與原接種的菌株一致，證明該菌株為煙草附球菌葉斑病致病菌。

2.3 病原菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)

菌株YC1105在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為67.5 mm，邊緣規(guī)則圓形，菌絲紅色，外緣白色，氈狀，致密，背面有紅色色素沉積（圖2-A）。在OA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為81.3 mm，菌絲較濃密，絨毛狀，背面無(wú)色素沉積（圖2-B）。在MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為76.4 mm，菌絲中央呈灰綠色，外緣白色，氈狀，較PDA培養(yǎng)基上菌絲更濃密，菌落背面中心呈墨綠色，外圍淺黃色（圖2-C）。使用1 mol/L NaOH溶液處理MEA培養(yǎng)基20 min后，培養(yǎng)基顏色變?yōu)槟G色，之后逐漸變?yōu)樽厣?，為?yáng)性反應(yīng)。分生孢子無(wú)色、無(wú)隔、橢圓形，單胞（圖2-E），大小為4.35～6.44 μm×2.10～3.27 μm，分生孢子器橢圓形（圖2-D），無(wú)剛毛，埋生或表生于培養(yǎng)基表面，菌絲末端著生淺粉色圓形膨大細(xì)胞（圖2-F），結(jié)合鑒定手冊(cè)描述細(xì)則可將菌株YC1105歸入section中。

2.4 病原菌分子鑒定結(jié)果

通過(guò)ITS、LSU、和基因序列擴(kuò)增和測(cè)序，分別獲得大小約536、1329、341和882 bp基因片段，NCBI 登 錄 號(hào) 分 別 為MZ496638、MZ496641、MZ672001和MZ672002。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示與和相似度高達(dá)100%，但未能準(zhǔn)確鑒定到種。將NCBI下載的對(duì)應(yīng)18條模式菌株基因序列與供試菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，從圖3可看出，供試菌株與（NCBI登錄號(hào)分別為：KY742102、KY742256、KY742344和KY742175）的遺傳距離最近，聚于同一分支，且支持率為100%。結(jié)合形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將煙草附球菌葉斑病致病菌鑒定為。

2.5 病原菌生物學(xué)特性分析結(jié)果

2.5.1 培養(yǎng)基對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 從表2可看出，菌株YC1105在12種培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度有所不同。該菌株在CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其次為OA培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑分別為73.00和63.33 mm；在WA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，菌絲稀疏，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑為28.67 mm，顯著小于其他處理菌落直徑（＜0.05，下同），不利于菌絲生長(zhǎng)。

2.5.2 碳源對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 如表3所示，菌株YC1105均能在供試的8種碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中在麥芽糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)較好，二者間無(wú)顯著差異（＞0.05，下同），培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑分別為69.17和66.67 mm；病原菌在山梨糖醇培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)較差，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑為44.50 mm，顯著小于其他碳源處理。

2.5.3 氮源對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 8種氮源對(duì)菌株YC1105的生長(zhǎng)影響結(jié)果（表4）表明，煙草附球菌葉斑病病原菌均能在供試的8種氮源上生長(zhǎng)，但存在顯著差異。其中在牛肉浸粉作氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為69.83 mm；而尿素不利于菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d后菌落直徑為33.00 mm，顯著小于其他處理的菌落直徑。

2.5.4 溫度對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 由表5可知，菌株YC1105可在5～35 ℃下生長(zhǎng)；在5 ℃條件下培養(yǎng)5 d菌絲不生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d后菌絲開始生長(zhǎng)，菌落直徑為6.67 mm；病原菌最適宜生長(zhǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)5和7 d的菌落直徑均最大，分別為54.50和71.00 mm；當(dāng)溫度超過(guò)28 ℃后，菌絲生長(zhǎng)速度開始下降。5和10 ℃菌絲生長(zhǎng)較慢。

2.5.5 pH對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 如表6所示，菌株YC1105在pH 4～10范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，pH為6時(shí)，培養(yǎng)5和7 d的菌落直徑均大于其他pH，分別為48.67和61.33 mm；菌絲在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)7 d的菌落直徑顯著大于堿性環(huán)境菌落直徑。綜上，菌株在偏堿性條件下生長(zhǎng)較緩慢，弱酸性則有利于菌株YC1105生長(zhǎng)。

2.5.6 光照對(duì)菌株YC1105生長(zhǎng)的影響 如表7所示，菌株YC1105在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗和12 h/12 h光暗交替3種條件下菌絲生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)影響不明顯；培養(yǎng)7 d后病原菌在3種光照條件下均未產(chǎn)孢。

2.5.7 致死溫度的測(cè)定 菌株YC1105在45～50 ℃水浴10 min處理后菌絲生長(zhǎng)情況見表8，48 ℃水浴10 min后仍可見菌絲生長(zhǎng)，而49 ℃水浴10 min后未見菌絲生長(zhǎng)。因此，推斷菌株YC1105菌絲的致死溫度為49 ℃，水浴10 min。

3 討論

附球菌屬是亞隔孢殼科一類致病性較強(qiáng)的真菌（陳倩，2015），該屬早期鑒定主要采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定及寄主相關(guān)命名的方法，導(dǎo)致分類混亂，單靠形態(tài)學(xué)及ITS基因序列難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定（Deng et al.，2011）。Aveskamp 等（2010）利用4 個(gè) 基 因（LSU、、ITS和）對(duì)亞隔孢殼科進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，對(duì)該科進(jìn)行分類學(xué)修訂，并新建立附球菌屬，將原本屬于廣義莖點(diǎn)霉section部分的、和歸入新建立的附球菌屬中。Chen等（2017）年使用、LSU、ITS和進(jìn)行多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)附球菌屬進(jìn)行了補(bǔ)充和完善。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法，將煙草附球菌葉斑病病原菌鑒定為，其在3種培養(yǎng)基上的菌落直徑、分生孢子器、分生孢子大小，對(duì)NaOH反應(yīng)呈陽(yáng)性及菌絲末端分化出圓形膨大細(xì)胞，與Chen等（2015a）對(duì)的描述基本一致，但其菌絲顏色和產(chǎn)生的色素有所不同，可能與寄主、培養(yǎng)條件及生態(tài)適應(yīng)性有關(guān)。

在火龍果（肖顯梅等，2018）、山藥（韓帥等，2019）和胡頹子（Qi et al.，2021）等作物上均有報(bào)道，但對(duì)其生物學(xué)特性的研究甚少。本研究生物學(xué)特性結(jié)果表明，煙草附球菌葉斑病病原菌在胡蘿卜瓊脂（CA）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其次為燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基，與黃鈜琳等（2021）報(bào)道茶葉斑病病原菌（）在OA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最快的結(jié)果不一致，出現(xiàn)差異的原因可能與其試驗(yàn)設(shè)計(jì)未使用CA培養(yǎng)基有關(guān)；病原菌最適pH為6，與肖顯梅等（2018）報(bào)道火龍果莖斑病病原菌最適pH為6～7的研究結(jié)果基本相似。曾慧蘭等（2018）報(bào)道百合葉尖干枯病病原菌生物學(xué)特性，表明最適氮源為牛肉浸膏、最適碳源為乳糖和葡萄糖，與本研究得出最適氮源為牛肉浸粉、最適碳源為麥芽糖的結(jié)果存在一定差異。煙草附球菌葉斑病病原菌生長(zhǎng)最適溫度為28 ℃，與肖顯梅等（2018）報(bào)道火龍果莖斑病病原菌最適溫度為26 ℃的結(jié)果不一致。上述差異的產(chǎn)生可能與生態(tài)環(huán)境和寄主不同有關(guān)，表明來(lái)自不同寄主的生物學(xué)特性有所差異。煙草附球菌葉斑病病原菌致死溫度為49 ℃，水浴10 min，因此在生產(chǎn)上，播種前對(duì)種子進(jìn)行溫湯處理，可降低該病害的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究較系統(tǒng)地對(duì)引起貴州煙草附球菌葉斑病病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性分析，旨在為防治該病提供較全面的理論依據(jù)。鑒于葉斑病在煙草種植上造成的危害，今后應(yīng)對(duì)該病原菌的藥劑敏感性、發(fā)生流行規(guī)律及抗病品種的培育等開展系統(tǒng)、深入的研究，以有效控制煙草附球菌葉斑病的危害。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，將分離獲得的煙草附球菌葉斑病病原菌鑒定為；其菌絲生長(zhǎng)溫度和pH范圍較寬，最適溫度為28 ℃，弱酸性條件有利于菌絲生長(zhǎng)；病原菌能利用多種氮源和碳源，最適碳源為麥芽糖，最適氮源為牛肉浸粉，致死溫度為49 ℃，光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響不顯著。