基于ITS2 DNA序列的雷公藤屬藥材資源譜系地理學(xué)研究

勵(lì) 娜，王 丹，陳一龍，姚媛媛，張小梅*，李勝容*

基于ITS2 DNA序列的雷公藤屬藥材資源譜系地理學(xué)研究

勵(lì) 娜1, 2，王 丹1, 2，陳一龍1, 2，姚媛媛3，張小梅1, 2*，李勝容1, 2*

1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065 2. 重慶市中藥研究院 重慶市中藥藥學(xué)評價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶 400065 3. 嘉興學(xué)院生物與化學(xué)化工學(xué)院，浙江 嘉興 314001

采用ITS2 DNA條形碼技術(shù)，研究雷公藤屬3種藥用植物的遺傳特性，揭示其地理分布格局的形成原因。收集雷公藤屬植物28個(gè)居群223份樣本，提取基因組DNA，擴(kuò)增ITS2基因序列并測序，并進(jìn)行遺傳多樣性分析，繪制失配分布曲線檢測群居歷史動(dòng)態(tài)變化情況，估算雷公藤屬種間、種內(nèi)群體間和群體內(nèi)的差異及遺傳分化系數(shù)。雷公藤屬28個(gè)居群223份樣本共檢測到12個(gè)堿基突變位點(diǎn)，構(gòu)成10個(gè)單倍型。昆明山海棠共有7個(gè)單倍型，H2～H7為特有單倍型；雷公藤共有4個(gè)單倍型，H8為特有單倍型；東北雷公藤共有3個(gè)單倍型，無特有單倍型；H1為3個(gè)物種間的共有單倍型，H9和H10為雷公藤和東北雷公藤共有單倍型。群體遺傳多樣性分析顯示，雷公藤屬具有較高的單倍型多態(tài)性（d＝0.615±0.024）和核苷酸多態(tài)性[i＝（9.47±0.58）×10?3]。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，雷公藤屬的變異主要存在于物種之間（76.14%），種內(nèi)群體間和群體內(nèi)的變異分別為11.42%、12.44%。群體動(dòng)態(tài)歷史分析表明，雷公藤屬、雷公藤和東北雷公藤曾經(jīng)歷過擴(kuò)張，而昆明山海棠未經(jīng)歷過擴(kuò)張。雷公藤屬及其屬下的昆明山海棠和雷公藤的遺傳多樣性水平較高，而東北雷公藤遺傳多樣性水平較低。雷公藤屬植物在第4紀(jì)冰期時(shí)，將中國西南、華中和華東的部分地區(qū)作為冰期避難所，冰期后以冰期避難所為中心向四周擴(kuò)散，形成當(dāng)前雷公藤屬植物的分布格局。

雷公藤屬；昆明山海棠；雷公藤；東北雷公藤；ITS2序列；譜系地理學(xué)；遺傳特性

第4紀(jì)冰期的氣候震蕩顯著改變了北半球溫帶地區(qū)的大多數(shù)物種的地理分布，產(chǎn)生了不同程度的范圍擴(kuò)展和收縮，影響了種群內(nèi)部和種群間遺傳變異的地理格局[1-2]。近年，基于DNA條形碼技術(shù)的分子譜系地理學(xué)是國際上研究居群遺傳分化進(jìn)化歷史的熱點(diǎn)和亮點(diǎn)[3]。分子譜系地理學(xué)研究技術(shù)在藥用植物遺傳多樣性、歷史進(jìn)化、地理分布格局歷史成因和資源保護(hù)等方面的研究中發(fā)揮著日益重要的作用[4-5]。ITS2基因序列常用于植物屬間、種間甚至居群間的系統(tǒng)關(guān)系探究，對于植物居群的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、歷史事件的發(fā)生過程有清晰的認(rèn)識，能全面的反應(yīng)居群的進(jìn)化歷史[6-7]。

我國傳統(tǒng)藥用植物昆明山海棠(Lévl.) Hutch.和雷公藤Hook均屬于衛(wèi)矛科（Celastraceae）雷公藤屬L.植物，同屬植物還包括東北雷公藤Sprague et Takeda，其中前兩者廣泛分布于我國長江中、下游以南及西南地區(qū)，后者主要分布于我國東北地區(qū)[8]。作為自身免疫性疾病臨床常用中藥，昆明山海棠與雷公藤植物藥材目前主要采自野生，經(jīng)過近30年的開發(fā)利用和適生環(huán)境被侵占，呈現(xiàn)資源銳減、供應(yīng)嚴(yán)重匱乏等現(xiàn)象，甚至部分地區(qū)面臨資源枯竭的危險(xiǎn)[9-10]。因此，本研究旨在通過分析我國雷公藤屬植物28個(gè)居群223份個(gè)體的ITS2的序列變異，闡明雷公藤屬植物遺傳特性及地理分布格局的歷史成因，以期為該屬植物的資源保護(hù)策略的制定提供一定的參考。

1 材料

1.1 藥材

本研究共收集3種雷公藤屬植物28個(gè)居群223份樣本，經(jīng)重慶市中藥研究院瞿顯友研究員分別鑒定為昆明山海棠(Lévl.) Hutch.、雷公藤Hook和東北雷公藤Sprague et Takeda的干燥根。具體信息見表1。

表1 樣品來源

Table 1 Source of samples

編號品種產(chǎn)地海拔/m經(jīng)度緯度 S1昆明山海棠四川米易普威2226E101°59′31″N27°03′33″ S2四川米易橫山1824E102°00′40″N26°59′26″ S3四川德昌1772E102°08′21″N27°23′44″ S4四川冕寧林里1624E102°11′57″N28°22′43″ S5四川冕寧石龍1840E102°12′14″N28°31′21″ S6云南南華2507E101°01′23″N25°19′30″ S7云南大理2450E100°07′31″N25°41′59″ S8云南南澗1696E100°32′51″N24°48′37″ S9云南保山2280E99°06′58″N25°07′30″ S10貴州雷山1160E108°13′43″N26°25′07″ S11貴州劍河 811E108°33′18″N26°37′58″ S12貴州印江 873E108°36′48″N27°56′27″ S13重慶武隆1589E107°42′24″N29°30′23″ S14重慶石柱1580E108°23′01″N30°13′23″ S15重慶江津1164E106°26′06″N28°36′21″ S16湖南南岳 764E112°38′18″N27°14′06″ S17湖南新寧1094E110°54′04″N26°26′07″ S18湖南武岡1415E110°37′21″N26°39′02″ S19湖北利川 738E108°39′50″N30°25′25″ S20雷公藤湖北通城 152E113°45′37″N28°07′20″ S21浙江龍泉1208E118°58′14″N28°05′21″ S22江西灣里 168E115°43′10″N28°48′29″ S23江西婺源 60E117°32′45″N29°05′40″ S24江西修水 152E114°02′41″N28°55′40″ S25東北雷公藤吉林通化 650E126°04′26″N41°34′02″ S26吉林江源1024E126°42′09″N41°55′39″ S27吉林臨江 739E126°55′20″N41°50′11″ S28吉林池北1090E128°10′59″N42°11′07″

1.2 試劑與儀器

植物基因組DNA試劑盒，天根生化科技有限公司；TIANGel Midi純化試劑盒，天根生化科技有限公司；UV-1100 SPECTROPHOTMETER，MAPADA有限公司；BP121S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；AEG-45SM型電子天平，日本島津公司；BJ-100型多功能粉碎機(jī)，德清拜杰電器有限公司；KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器，鞏義市予華儀器有限公司；HH-S24型恒溫水浴鍋水浴鍋，金壇梅香儀器有限公司；SCIENTZ-48 DNA提取研磨機(jī)；9700 GeneAmp PCR儀，Applied Biosystems公司；ABI 3730XL測序儀，Applied Biosystems公司。

2 方法

2.1 DNA提取、擴(kuò)增和測序

根據(jù)植物基因組DNA試劑盒說明書提取上述28個(gè)居群223份雷公藤屬植物樣本總基因，參考Chen等[11]操作步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ITS2引物序列：正向?yàn)?’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’；反向?yàn)?’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并使用TIANGel Midi試劑盒進(jìn)行純化。使用ABI 3730XL測序儀對純化后的樣品進(jìn)行測序。

2.2 遺傳多樣性分析

使用DnaSP v5軟件確定雷公藤屬3個(gè)物種28個(gè)居群ITS數(shù)據(jù)的單倍型，并統(tǒng)計(jì)多態(tài)位點(diǎn)和信息位點(diǎn)的數(shù)目，計(jì)算群體單倍型多樣性（haplotype diversity，d）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，i）。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

使用PERMUT軟件計(jì)算雷公藤屬的遺傳分化參數(shù)（st、st），并檢驗(yàn)差異的顯著性。使用Arlequin3.5軟件進(jìn)行分子方差分析（AMOVA）估算屬內(nèi)種間、種內(nèi)群體間和群體內(nèi)的差異，以及種間和群體間遺傳分化系數(shù)。

2.4 中性檢驗(yàn)

使用DnaSP v5軟件計(jì)算中性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)值Tajima’s（值）和Fu’（值）。中性學(xué)說認(rèn)為分子水平上的突變大多是中性或接近中性，對生物體的生存不存在任何有利或不利影響，且不受自然選擇的影響。突變是自然種群隨機(jī)遺傳漂變的結(jié)果，因此，核酸替換率只與它的突變率相關(guān)，它們概率是相等的。通過檢驗(yàn)來判斷這些位點(diǎn)是否符合中性進(jìn)化模式。如果值為負(fù)值，說明種群內(nèi)存在大量低頻率的等位基因，暗示著種群曾經(jīng)經(jīng)歷過擴(kuò)張和或凈化選擇；如果值為正，則說明種群內(nèi)中等頻率的等位基因較多，那么種群可能經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)和或平衡選擇。值亦如此。但是值反映的是群體動(dòng)態(tài)的古老事件，而值反映的則是近期發(fā)生的群體動(dòng)態(tài)。

2.5 失配分析

失配分布是檢測群體大小變化的一種方法，可以推測群體是否經(jīng)歷過快速擴(kuò)張事件。失配分布檢驗(yàn)主要是將種群中的任意兩個(gè)序列進(jìn)行比較進(jìn)而得到兩個(gè)序列間差異的分布情況，其結(jié)果可用于計(jì)算雷公藤屬各水平類群在歷史上的種群動(dòng)態(tài)。通過觀察值與模擬值間的離差平方和和反映擬合曲線平滑度的RAG值，可以判斷雷公藤屬種群是否經(jīng)歷過種群擴(kuò)張或是瓶頸效應(yīng)。因?yàn)榉N群大小如果長期保持穩(wěn)定的話，那么它的分布曲線應(yīng)該出現(xiàn)至少2個(gè)峰值，而經(jīng)歷過快速擴(kuò)張的種群則會(huì)呈現(xiàn)為泊松分布。用DnaSP v5軟件繪制失配分布曲線，用Arlequin 3.5計(jì)算相關(guān)參數(shù)。

2.6 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析

以獨(dú)子藤Roxb.作為外類群，利用Network構(gòu)建基于Median joining算法的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，并對該圖進(jìn)行手工調(diào)整。

2.7 單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

使用Modeltest 3.7軟件對ITS2單倍型序列進(jìn)行計(jì)算，以得到DNA序列替代模型的最佳模型。利用MrBayes 3.1.2軟件對ITS2序列數(shù)據(jù)進(jìn)行貝葉斯分析，構(gòu)建以獨(dú)子藤為外類群的雷公藤屬的單倍型系統(tǒng)樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 ITS2序列變異分析和單倍型分布

雷公藤屬3個(gè)物種28個(gè)群體223份樣本成功擴(kuò)增出223 bp ITS2序列，共檢測到12個(gè)變異位點(diǎn)（Variable/polymorphic sites），全為堿基突變，共有11個(gè)信息位點(diǎn)（parsimony informative sites）（表2）。12個(gè)變異位點(diǎn)構(gòu)成了10個(gè)單倍型（H1～H10）。昆明山海棠共有7單倍型，其中6個(gè)為特有單倍型（H2～H7）；雷公藤共有4單倍型，其中1個(gè)為特有單倍型（H8）；東北雷公藤共有3單倍型，無特有單倍型；3個(gè)物種之間，H1是3個(gè)物種共有單倍型，H9和H10為雷公藤和東北雷公藤共有單倍型；除開H1，東北雷公藤和昆明山海棠之間、昆明山海棠和雷公藤之間再無其他共有單倍型（表3）。

表2 雷公藤屬10種單倍型和12個(gè)變異位點(diǎn)

Table 2 Ten haplotypes and 12 variant sites of Tripterygium

類型變異位點(diǎn) 123456789101112 H1GGAAGTCATCCT H2?A?????????? H3??????????T? H4A?????T????? H5??????T????? H6?????CT????? H7?????C?????? H8??G????????? H9???T???GCT?A H10????A???????

表3 雷公藤屬物種的單倍型多態(tài)性、核酸多態(tài)性和單倍型分布

Table 3 Haplotype polymorphism, nucleic acid polymorphism and haplotype distribution in Tripterygium

編號單倍型數(shù)量HdPi /(×10?3)單倍型種類及頻次 S01130.410±0.154 1.95±0.90H1(10)、H2(2)、H3(1) S02120.485±0.106 2.17±0.48H1(8)、H2(4) S03 90.000±0.000 0.00±0.00H1(9) S04120.000±0.000 0.00±0.00H1(12) S05 70.000±0.000 0.00±0.00H1(7) S06100.000±0.000 0.00±0.00H1(10) S07110.327±0.153 2.94±1.38H1(9)、H4(2) S08110.000±0.000 0.00±0.00H1(11) S09110.000±0.000 0.00±0.00H1(11) S10110.000±0.000 0.00±0.00H5(11) S11110.000±0.000 0.00±0.00H5(11) S12 50.000±0.000 0.00±0.00H5(5) S13120.485±0.106 2.17±0.48H1(4)、H2(8) S14130.000±0.00 0.00±0.00H5(13) S15120.409±0.133 1.83±0.60H1(3)、H5(9) S16120.000±0.000 0.00±0.00H1(12) S17 60.000±0.000 0.00±0.00H1(6) S18 31.000±0.272 5.98±1.99H1(1)、H6(1)、H7(1) S19 60.000±0.000 0.00±0.00H1(6) S20 80.000±0.000 0.00±0.00H1(8) S21100.000±0.000 0.00±0.00H8(10) S22150.590±0.07712.13±1.55H1(8)、H9(6)、H10(1) S23100.000±0.000 0.00±0.00H1(10) S24 90.000±0.000 0.00±0.00H1(9) S25100.000±0.000 0.00±0.00H9(10) S26180.000±0.000 0.00±0.00H9(18) S27200.468±0.10410.36±2.12H1(5)、H9(14)、H10(1) S28180.000±0.000 0.00±0.00H9(18)

3.2 群體遺傳多樣性分析

雷公藤屬28個(gè)群體共檢測到12種單倍型，每個(gè)群體的單倍型及個(gè)體數(shù)見表3。在28個(gè)群體中，8個(gè)群體具有單倍型多態(tài)性，其中4個(gè)群體具有2種單倍型，4個(gè)群體具有3種單倍型，無群體具有3個(gè)以上的單倍型。如表4所示，雷公藤屬具有較高的單倍型多態(tài)性（d＝0.615±0.024）和核苷酸多態(tài)性[（i＝9.47±0.58）×10?3]，在物種水平上3個(gè)物種的多態(tài)性水平均小于雷公藤屬多態(tài)性水平，d的變化范圍為（0.170±0.060）（東北雷公藤）～（0.506±0.069）（雷公藤），i的變化范圍為（2.22±0.21）×10?3（昆明山海棠）～（6.26±1.51）×10?3（雷公藤）。群體水平上，d的變化范圍為（0.327±0.153）（大理）～（1.000±0.272）（武岡），i的變化范圍為（1.83±0.60）×10?3（江津）～（12.13±1.55）×10?3（南昌）。

表4 雷公藤屬群體的單倍型多態(tài)性、核酸多態(tài)性和單倍型分布

Table 4 Haplotype polymorphisms, nucleic acid polymorphisms, and haplotype distribution in Tripterygium

樣本單倍型數(shù)量HdPi/(×10?3) 昆明山海棠1870.448±0.0352.22±0.21 雷公藤 520.506±0.0696.26±1.51 東北雷公藤 660.170±0.0603.90±1.36 雷公藤屬2230.615±0.0249.47±0.58

3.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA分析顯示，雷公藤屬的變異主要存在于物種之間（76.14%），種內(nèi)群體間和群體內(nèi)的變異分別為11.42%、12.44%。物種水平上，雷公藤的變異在群體間和群體內(nèi)差異不大，分別為47.66%和52.34%；昆明山海棠的變異主要存在于群體間（65.54%），群體內(nèi)的變異為34.46%；東北雷公藤的變異主要存在于群體內(nèi)（76.64%），群體間的變異為23.36%（表5）。

表5 雷公藤屬分子變異分析(AMOVA)

Table 5 Molecular variation analysis of Tripterygium(AMOVA)

樣本 變異來源自由度平方和變異百分比/%F值 雷公藤屬物種間2211.05976.14FCT=0.761 36 種內(nèi)群體間2554.11211.42FSC=0.478 64 群體內(nèi)27755.68812.44FST=0.875 58 東北雷公藤群體間36.30823.36 群體內(nèi)6221.95076.64FST= 0.233 61 昆明山海棠群體間1831.14265.54FST= 0.655 44 群體內(nèi)16814.80534.46 雷公藤群體間416.66347.66FST= 0.476 56 群體內(nèi)4718.93352.34

3.4 群體動(dòng)態(tài)歷史分析

分別在屬水平、物種水平進(jìn)行值和值中性檢驗(yàn)（表6），結(jié)果顯示值和值的正負(fù)不一，均未到達(dá)顯著水平，因此不能拒絕中性假說。說明雷公藤屬在屬水平和物種水平均未經(jīng)歷過群體擴(kuò)張或瓶頸事件。

分別對雷公藤屬以及3個(gè)物種進(jìn)行了失配分布檢驗(yàn)（表6）。雷公藤屬水平上，SSD＝0.072 78，＝0.19，RAG＝0.156 17，＝0.32，不能拒絕擴(kuò)張假說。物種水平上，雷公藤和東北雷公藤的SSD和RAG的值都不顯著，不能拒絕擴(kuò)張假說；而昆明山海棠的SSD的值顯著，RAG的值不顯著，從SSD的結(jié)果看需要拒絕擴(kuò)張假說，而從RAG的結(jié)果看，不能拒絕擴(kuò)張假說，結(jié)果不一致。另外從失配分布曲線看，雷公藤屬、雷公藤和東北雷公藤的觀察曲線為雙峰，而昆明山海棠呈現(xiàn)的是比較完整的單峰分布，說明雷公藤屬、雷公藤和東北雷公藤曾經(jīng)經(jīng)歷過擴(kuò)張，而昆明山海棠未經(jīng)歷過擴(kuò)張（圖1）。

中性檢驗(yàn)、失配分析的曲線以及SSD和RAG分析對雷公藤屬、昆明山海棠、雷公藤和東北雷公藤的群體動(dòng)態(tài)結(jié)果不一致，可能是由于ITS2一個(gè)片段的信息位點(diǎn)太少導(dǎo)致，需要進(jìn)一步增加片段進(jìn)行分析。

3.5 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析

如圖2所示，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析顯示雷公藤屬的10個(gè)單倍型構(gòu)成一個(gè)星狀的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中單倍型H1和H5處于星狀結(jié)構(gòu)的中心，與其他單倍型具有最近的親緣關(guān)系，說明H1和H5是最原始的單倍型。根據(jù)星狀的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，雷公藤屬10個(gè)單倍型大致可以分成3個(gè)支系，其中2個(gè)支系分別以H1和H5為祖先單倍型，H9單獨(dú)成為一個(gè)分支構(gòu)成一個(gè)支系。

結(jié)合單倍型分布圖分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)為一個(gè)支系的單倍型H9為東北雷公藤獨(dú)有單倍型，4個(gè)東北雷公藤群體均有該單倍型，因此H9的分布與東北雷公藤的分布范圍一致，在我國東北部。以H5為祖先單倍型的支系，主要分布在云南北部、貴州、重慶南部和湖南西部地區(qū)，該支系為昆明山海棠所獨(dú)有。剩余單倍型的以H1為祖先單倍型，雷公藤屬的3個(gè)物種都有該支系的單倍型，分布范圍最為廣闊。

表6 雷公藤屬中性檢驗(yàn)和失配分析結(jié)果

Table 6 Tripterygium neutrality test and mismatch analysis results

樣本SSDP值HRAGP值F值P值D值P值 雷公藤屬0.072 780.190.156 20.32 0.812 360.692 0.249 730.638 雷公藤0.040 260.140.160 90.49 1.927 540.850?0.259 580.474 東北雷公藤0.033 030.060.717 60.67 1.917 660.819?0.748 920.249 昆明山海棠0.008 700.040.152 90.11?3.201 470.070?0.825 290.245

圖1 雷公藤屬失配分布分析

圖2 雷公藤屬單倍型網(wǎng)絡(luò)局部圖

3.6 單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

使用貝葉斯法構(gòu)建的雷公藤屬系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，該系統(tǒng)樹中多數(shù)分支的支持率很低，其中H5、H4和H6構(gòu)成的分支的支持率超過0.5，與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果相似。系統(tǒng)樹中，H9依然是單獨(dú)夠成一支，與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果也類似。與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果不一樣的是在系統(tǒng)發(fā)育樹中剩余單倍型并未獨(dú)聚為一支，而是與H5、H4和H6一起構(gòu)成一個(gè)支持率為0.53的分支，而H7和H8未與他們聚在一起。

圖3 雷公藤屬單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

4.1 群體遺傳多樣性

在屬水平上，雷公藤屬具有較高的遺傳多樣性，d為0.615±0.024，i為（9.47±0.58）×10?3；物種水平上，雷公藤屬3個(gè)物種遺傳多樣性水平具有一定的差異，其中d由高到低依次為雷公藤（0.506±0.069）、昆明山海棠（0.448±0.035）、東北雷公藤（0.170±0.060）；與雷公藤屬屬水平遺傳多樣性相比，物種水平的遺傳多樣性較低。雷公藤屬及其屬下2個(gè)種昆明山海棠和雷公藤的遺傳多樣性水平較高，而東北雷公藤遺傳多樣性水平較低。東北雷公藤遺傳水平低的原因可能有2種，一個(gè)是第4紀(jì)冰期時(shí)，東北雷公藤已經(jīng)擴(kuò)散到我國東北地區(qū)，在冰期時(shí)群體收縮由于嚴(yán)重的遺傳漂變導(dǎo)致群體遺傳多樣性下降。第2個(gè)是東北雷公藤在擴(kuò)散到東北時(shí)，由于建群者效應(yīng)導(dǎo)致當(dāng)前的群體遺傳多樣性水平較低。

4.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

群體遺傳結(jié)構(gòu)方面，雷公藤屬3個(gè)物種群體水平的遺傳多樣性都很低。屬水平上，28個(gè)群體中只有8個(gè)群體具有遺傳多樣性。物種水平上，5個(gè)雷公藤群體只有1個(gè)群體具有遺傳多樣性，19個(gè)昆明山海棠群體只有6個(gè)群體具有遺傳多樣性，4個(gè)東北雷公藤群體只有1個(gè)群體具有遺傳多樣性。AMOVA分析顯示，雷公藤屬的變異主要存在于物種之間（76.14%），雷公藤屬物種間分化顯著。物種水平上，雷公藤的變異在群體間和群體內(nèi)差異不大；昆明山海棠的變異主要存在于群體間；東北雷公藤的變異主要存在于群體內(nèi)。Hamrick等[12]的研究認(rèn)為，在物種水平上植物群體遺傳多樣性水平主要收到系統(tǒng)分類地位、分布范圍、生活型、繁育系統(tǒng)和種子散播機(jī)制等因素的影響，群體水平上主要受到繁育系統(tǒng)、分布范圍、生活史、分類地位和種子的散播機(jī)制等因素的影響。根據(jù)Hamrick和Godt理論，多年生、異交為主、風(fēng)媒或水媒擴(kuò)散種子的植物群體間的分化程度較低，相反長壽的、自交為主的植物群體間的分化程度較高。

4.3 冰期避難所

氣候波動(dòng)對植物地理分布格局的影響非常大，第4紀(jì)冰期是對當(dāng)前我國植物地理分布格局影響最大的一次歷史氣候[13-14]。在第4季冰期時(shí)，亞洲、美洲和歐洲都有明顯的大陸冰川，但是在我國范圍內(nèi)沒有明顯的大陸冰川，只有部分山地冰川[15]。冰期避難所是指在冰期尤其是盛冰期時(shí)，許多物種分布范圍收縮后生存下來的區(qū)域[16]。避難所區(qū)域的群體比其他區(qū)域群體的遺傳多樣性高，根據(jù)這一特性及雷公藤屬單倍型分布格局，認(rèn)為在第4紀(jì)冰期時(shí)，云南北部及四川南部的橫斷山脈、重慶的大巴山脈、湖南南部的南嶺和江西北部的廬山是雷公屬植物的冰期避難所。

云南北部及四川南部地處我國橫斷山脈，橫斷山脈地區(qū)位于青藏高原東南部外圍，地質(zhì)構(gòu)造上十分活躍。該區(qū)域具有復(fù)雜的種子植物區(qū)系和豐富的特有種，是潛在的第4季冰期避難所[17]。大巴山脈具有山高、坡陡、谷深的地貌特點(diǎn)。秦巴山地是北部冷空氣南下的重要屏障，使得這一地區(qū)保存有第3紀(jì)植物最具豐富性和完整性[18]。周先容等[19-20]研究指出大巴山、武陵山、神農(nóng)架地區(qū)具有較大比例的古特有屬和珍稀瀕危物種，無遺是古植物區(qū)系的重要避難所。南嶺地區(qū)是熱帶和亞熱帶的過度地區(qū)，長期保持濕熱的氣候環(huán)境，對中生代和新生代的植物進(jìn)化起著重要的作用。該區(qū)域中國特有種在總種數(shù)中占比高達(dá)59.9%，也是動(dòng)植物第4紀(jì)冰期的避難所。周秉根等[21-22]對揚(yáng)子鱷的研究認(rèn)為第四紀(jì)冰期是華中地區(qū)的中低山系（包括黃山、廬山、九華山和天目山等）不具備發(fā)育冰川的條件，而是季風(fēng)性冰緣環(huán)境且為溫暖帶氣候，很可能是第4紀(jì)冰期避難所。

結(jié)合雷公藤屬植物單倍型分布圖和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)，雷公藤屬植物具有中國西南至華中，然后到華東，最后擴(kuò)散到東北的歷史遷移路線。筆者認(rèn)為，雷公藤屬植物在第4紀(jì)冰期時(shí)以云南北部及四川南部的橫斷山脈、重慶的大巴山脈、湖南南部的南嶺和江西北部的廬山作為冰期避難所，冰期后以冰期避難所為中心向四周擴(kuò)散，形成當(dāng)前雷公藤屬植物的分布格局。

4.4 資源狀況分析

雷公藤屬藥用植物資源目前主要來自野生，其中昆明山海棠分布面積較雷公藤和東北雷公藤更廣，野生資源較為豐富，在四川涼山等地成片生長，但由于過度開采及存在大量紫莖澤蘭惡性競爭其適生環(huán)境，其蘊(yùn)藏量已急劇減少。雷公藤多以散生為主，在本次實(shí)地取樣過程種未見大面積群落，一個(gè)地方僅有幾株、幾十株，重復(fù)取樣具有一定困難。且雷公藤喜陰濕，但需要一定陽光，郁閉度稍高，長勢就變?nèi)酢，F(xiàn)華東地區(qū)嚴(yán)禁砍伐木材后，山區(qū)森林郁閉度增高，雷公藤長勢漸弱，進(jìn)一步不利于雷公藤的生長繁殖。東北雷公藤的群落主要集中在長白山地區(qū)。由于其尚未開發(fā)利用，野生資源還未被破壞，但分布區(qū)較小，資源蘊(yùn)藏總量不多。

綜上所述，基于ITS2基因序列對雷公藤屬藥用植物譜系地理學(xué)研究結(jié)果表明，該屬植物具有較高的遺傳多樣性，其下的3個(gè)物種群體水平的遺傳多樣性都很低。在第4紀(jì)冰期時(shí)以云南北部及四川南部的橫斷山脈、重慶的大巴山脈、湖南南部的南嶺和江西北部的廬山作為冰期避難所，冰期過后以冰期避難所為中心向四周擴(kuò)散，形成當(dāng)前雷公藤屬植物的分布格局。資源現(xiàn)狀分析提示雷公藤屬藥用植物野生資源匱乏，后續(xù)課題組將就此進(jìn)一步提出雷公藤屬藥用植物資源保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Phylogeography ofinferred based on ITS2 DNA sequence variation

LI Na1, 2, WANG Dan1, 2, CHEN Yi-long1, 2, YAO Yuan-yuan3, ZHANG Xiao-mei1, 2, LI Sheng-rong1, 2

1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China 2. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing 400065, China 3. College of Biological, Chemical Science and Engineering, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China

To studythe genetic characteristics and geographical distribution of three species of the genusby ITS2 DNA barcoding technique.A total of 223 samples from 28 populations ofwere collected. The genomic DNA extraction and ITS2 gene amplification and sequencing were performed on the above samples. Genetic diversity was analyzed by calculating haplotype diversity and nucleotide diversity. The dynamic change of social history was detected by drawing the curve of mismatch distribution. Based on the above data analysis, the differences among species, populations and populations, and the coefficient of genetic differentiation between species and populations were estimated.A total of 12 base mutation sites were detected in 223 samples from 28 populations of, which constituted 10 haplotypes. There were seven haplotypes in, and H2—H7 were unique haplotypes. There were four haplotypes in, and H8 was a unique haplotype. There were three haplotypes in. Among the three species, H1 is the haplotype of three species, H9 and H10 are the haplotypes ofand. The analysis of population genetic diversity showed thathad high haplotype and nucleotide polymorphism [d= 0.615 ± 0.024,i= (9.47 ± 0.58 )× 10?3] . The analysis of population genetic structure showed that the variation ofmainly existed among species (76.14%), and the variation of intraspecies and intrapopulation was 11.42% and 12.44%, respectively. The population dynamic analysis showed that,andhad experienced expansion, buthad not.The genetic diversity level of,andare higher than that of.used parts of Southwest China, Central China, and East China as refuges during the Quaternary ice age. After the ice age,spread around the refuge, forming the current distribution pattern.

;(Lévl.) Hutch.;Hook;Sprague et Takeda; ITS2 sequence; phylogeography; genetic characteristics

R282.12

A

0253 - 2670(2022)17 - 5476 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.024

2022-02-06

國家重大新藥創(chuàng)制科技專項(xiàng)（2017ZX09101002）；重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目（cstc2017jcyjAX0001，cstc2018jcyjAX0142）；重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)（cstc2017shms-zdyfX00012）

勵(lì) 娜，主任中藥師，從事中藥資源、質(zhì)量控制、中藥制劑、中藥炮制工藝及機(jī)制研究。E-mail: lina1281@163.com

張小梅，主任中藥師，從事中藥資源與物質(zhì)基礎(chǔ)研究、中藥品種品種評價(jià)、中藥新藥研究。E-mail: 605050963@qq.com

李勝容，主任藥師，從事中藥資源與質(zhì)量評價(jià)、中藥新藥研究開發(fā)。E-mail: 1079639273@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]