李法杰，谷金玉，張 悅，沈 碩，姚 瑤，萬田豪，夏 迪，張 清

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700；3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

傷害性刺激引起的機(jī)體持續(xù)疼痛及炎癥反應(yīng)是臨床最常見的伴隨癥狀，也是全球重要健康問題之一，可導(dǎo)致個(gè)體痛苦、生活質(zhì)量惡化、家庭負(fù)擔(dān)沉重及巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。針對(duì)骨科術(shù)后、跌倒損傷等軀體急、慢性疼痛和炎癥反應(yīng)，臨床常用的一線藥物有阿片類鎮(zhèn)痛藥和非甾體類抗炎藥等，然而上述藥物可引起惡心、嘔吐等胃腸道毒性和耐藥、成癮、嗜睡、骨脆性增加等副作用［2］。中藥經(jīng)皮給藥對(duì)防治疼痛及減少炎癥反應(yīng)療效確切、毒副作用少，是一種頗具前景的補(bǔ)充替代療法［3］。海桐皮湯首見于《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》，由海桐皮、透骨草、乳香、沒藥、當(dāng)歸、川椒、紅花、川芎、防風(fēng)、白芷、威靈仙、甘草組成，具有祛濕溫經(jīng)散寒、活血消腫止痛的功效［4］。臨床常用海桐皮湯熏洗患處，通過經(jīng)皮給藥以促進(jìn)患者骨折術(shù)后愈合，并治療骨關(guān)節(jié)炎、跟痛癥、跌打損傷等骨傷科疾?。?-7］；基礎(chǔ)研究表明，海桐皮湯熏蒸可降低軟骨細(xì)胞凋亡率、減少白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素6（interleukin-6，IL-6）等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［8，9］。但原處方藥味較多且劑型為湯劑，存在不便攜帶、需要煎煮、藥物利用不充分等弊端。為此，本團(tuán)隊(duì)按照海桐皮湯的經(jīng)典原方，制備成海桐皮湯提取膏，以期為臨床骨傷科等疾病提供一種抗炎、鎮(zhèn)痛的外用中藥藥膏。

本研究應(yīng)用海桐皮湯提取膏對(duì)小鼠經(jīng)皮給藥，采用熱板法、角叉菜膠導(dǎo)致的足跖腫脹及醋酸扭體反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)各組小鼠血漿中的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-6 等炎性細(xì)胞因子的含量，以闡釋海桐皮方提取膏的抗炎、鎮(zhèn)痛效果及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)KM 小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院（北京大興）提供，許可證號(hào)：SCXK（京）-2017-0005。常規(guī)飼養(yǎng)于通風(fēng)、光照12/12 h，溫 度 為21°C±2°C，相 對(duì) 濕 度 為50%±10%，大鼠自由攝食和飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查，倫理審查申請(qǐng)?zhí)枺褐锌漆槀怐2022-04-11。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵照“3R”原則及科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備工藝

1.2.1實(shí)驗(yàn)藥物 海桐皮湯提取膏的中藥組成：海桐皮（批號(hào)：20211116，北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司）、紅花、醋沒藥、醋乳香、威靈仙、防風(fēng)（批號(hào)分別 為：21072701、21032201、21062301、21040601、2108098，北京四方中藥飲片有限公司）、酒當(dāng)歸、甘草、川椒、透骨草（批號(hào)分別為：211035、211099、211033、211121，北京盛世龍藥業(yè)有限公司）、白芷、川芎（批號(hào)分別為：B9051511、B8291511，北京金崇光藥業(yè)有限公司），上述藥物經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所鑒定為正品，均符合《中國(guó)藥典》2020 年版檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（批號(hào)：8P3U，規(guī)格20 g/支，中美天津史克制藥有限公司）。

1.2.2制備工藝 制備工藝1：按照海桐皮湯原方比例稱取適量處方中乳香、沒藥、酒當(dāng)歸、川芎、川椒、白芷、防風(fēng)，于10 倍量水中用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，并另存揮發(fā)油及水煎液，藥渣與海桐皮、透骨草、威靈仙、紅花、甘草5 味藥材合并水提，兩處水煎液合并減壓濃縮后揮發(fā)油，攪勻，制成每克含生藥1.512 g（1.512 g/g）的中藥制劑，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们笆覝亟鈨觯尤胨z基質(zhì)中，調(diào)整生藥濃度為2.0 g/mL。

制備工藝2：藥材用量同上，全方水提，棄去藥渣，濃縮水煎液制成每克含生藥1.712 g（1.712 g/g）的中藥制劑，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们笆覝亟鈨?，加入水凝膠基質(zhì)中，調(diào)整生藥濃度為2.0 g/mL。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)：Cat.#ELS286，上海艾來薩生物科技有限公司）、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)分別為：ab197742、ab222503，英國(guó)Abcam 公司）；角叉菜膠（批號(hào)：20170912，北京索萊寶科技有限公司）；甲醛、冰醋酸均為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)提供。

1.3.2 主要儀器 爪腫脹測(cè)量?jī)x（Ahlborn Almemo，2450）、冷熱板（Ugo Basile，35150）、微量電子天平（Mettler Toledo，ML204）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge，5430R）、打孔器（直徑6mm，澤亞科教，ZEYA/EP-1）。

1.4 給藥劑量

實(shí)驗(yàn)前1 d 在小鼠腹部大約3 cm2范圍電動(dòng)推剪脫毛。參照文獻(xiàn)［10］、［11］，小鼠與人體劑量換算：（1.44×10 000 cm2×0.05 mL/cm2×0.003）÷67 cm2=0.03 mL/cm2，其 中，1.44×10 000 cm2是 人（50 kg）的體表面積，0.05 mL/cm2是外用藥物人體常用劑量，0.003 是小鼠與人按照體表面積折算的等效劑量換算系數(shù)，67 cm2是小鼠體表面積。計(jì)算所得，本實(shí)驗(yàn)小鼠用藥劑量為0.03 g/cm2×3 cm2=0.09 g/只。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 鎮(zhèn)痛作用

1.5.1.1 熱板法實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組前，首先對(duì)SPF 級(jí)正常雄性KM 小鼠進(jìn)行痛閾篩選，冷熱板測(cè)痛儀溫度調(diào)節(jié)在（55±0.5）℃，取雄性KM 小鼠分別置于熱板上，測(cè)量小鼠從后足接觸熱板至添足時(shí)間，即為痛閾值，每隔5 min 測(cè)一次，共3 次，篩選均值5～30 s 的入組。將痛閾篩選合格的雄性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組（予以空白凝膠，0.09 g/只）、工藝1 組（予以工藝1 提取膏，0.09 g/只）、工藝2 組（予以工藝2 提取膏，0.09 g/只）和扶他林組（予以雙氯芬酸鈉二乙胺乳膠劑，0.09 g/只），每組10 只。將相應(yīng)劑量的藥膏均勻涂抹于對(duì)應(yīng)小鼠的腹部脫毛處，1 次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。于初次給藥前及末次給藥后30、60、90、120 min 按上法分別測(cè)定痛閾值。如超過60 s 仍無添后足反應(yīng)，應(yīng)立刻停止觀察并按60 s計(jì)算［12］。

1.5.1.2 扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn) SPF 級(jí)正常雄性KM 小鼠40 只，分組、用藥及干預(yù)方式同1.5.1.1，1 次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。末次給藥半小時(shí)，各組小鼠腹腔注射冰醋酸（0.6%，10 mL/kg），觀察并記錄小鼠15 min 內(nèi)第一次出現(xiàn)扭體的時(shí)間（即扭體潛伏期）和扭體次數(shù)。主要表現(xiàn)為腹部?jī)?nèi)凹、軀干扭曲、后肢伸展及臀部抬高［13］。

1.5.2 抗炎作用

1.5.2.1 足腫脹實(shí)驗(yàn) SPF 級(jí)正常雄性KM 小鼠50只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，除空白組外，其余分組及干預(yù)方法同1.5.1.1，1 次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。于末次給藥半小時(shí)后，各組在右后足跖皮下注射1%角叉菜膠30 μL 致炎。借助爪腫脹測(cè)量?jī)x依次測(cè)定致炎前（0 h）和致炎后1、2、3、4 h 各組小鼠右后足容積[14]，并計(jì)算各組小鼠右后足腫脹度(mL)=致炎后右后足容積(mL)-致炎前右后足容積(mL)；腫脹率(%)=腫脹度/致炎前右后足容積×100%。

1.5.2.2 耳腫脹實(shí)驗(yàn) 采用二甲苯致耳腫脹實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證藥物的抗炎作用。SPF 級(jí)正常雄性KM 小鼠40 只，分組及干預(yù)方法同1.5.1.1，1 次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。于末次給藥1 h 后，在小鼠右耳廓內(nèi)外面涂抹30 μL 二甲苯致炎，左耳作為對(duì)照組不涂抹任何藥物。二甲苯干預(yù)1 h 后處死小鼠，沿耳廓基線剪下小鼠雙耳，并在雙耳同一部位借助6 mm 直徑的打孔器打下圓形耳片，借助微量電子稱稱重后，進(jìn)行耳腫脹度及腫脹抑制率［15］的計(jì)算，腫脹度（mg）=右耳耳片質(zhì)量（mg）-左耳耳片質(zhì)量（mg）；腫脹抑制率（%）=［（對(duì)照組小鼠腫脹度-給藥組小鼠腫脹度）/對(duì)照組小鼠腫脹度］×100%。

1.5.2.3 ELISA 足腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘除小鼠眼球取血并離心保存，室溫靜置20 min 后，4 ℃、3 500 r/min 離心15 min，上清液置于-80 ℃冰箱保存，借助ELISA 試劑盒進(jìn)行TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。

1.5.2.4 HE 足腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取右后足足跖皮下組織，置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃、固定48 h，隨后將其放于25%蔗糖溶液中脫水24 h，將脫水后的組織取出，石蠟包埋，并用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，隨后進(jìn)行HE 染色，在顯微鏡下觀察皮下組織病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，分別進(jìn)行正態(tài)分布、方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析判斷組間差異，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)；使用GraphPad8.0.1 做圖。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠熱板實(shí)驗(yàn)痛閾值比較

給藥前各組小鼠的基線痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；末次給藥后30 min，與模型組比較，其余各組小鼠的痛閾值明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與工藝1、工藝2 組相比，扶他林組痛閾值明顯提高差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。末次給藥后60 min，與模型組相比，工藝1 組和扶他林組的痛閾值提高（P＜0.01）；與工藝1 相比，扶他林組的痛閾值提高更為明顯（P＜0.05）。末次給藥后90 min，與模型組相比，扶他林組痛閾值仍明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），工藝1 和2 組雖有上升趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與扶他林組相比，工藝1 和2 組的痛閾值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。末次給藥后120 min，與模型組相比，扶他林組痛閾值明顯提高（P＜0.01），工藝1 組痛閾值有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 各組小鼠熱板實(shí)驗(yàn)痛閾值的比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of pain thresholds in the hot plate test of mice in each group（n=10，±s）

表1 各組小鼠熱板實(shí)驗(yàn)痛閾值的比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of pain thresholds in the hot plate test of mice in each group（n=10，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與工藝1 組比較，#P＜0.05；與工藝2 相比，△P＜0.05。

組別模型組工藝1 組工藝2 組扶他林組給藥前11.82±3.57 11.89±3.50 11.44±3.78 11.41±3.50 0.048 0.986給藥后30 min 8.24±2.64 13.33±4.38**10.87±2.25*15.92±4.81**#7.972 0.000給藥后60 min 11.26±2.34 16.78±4.84**12.89±4.39 18.44±5.25**#5.866 0.002給藥后90 min 11.62±2.39 15.33±5.20 14.30±5.68 20.59±8.25**#Δ 4.234 0.012給藥后120 min 12.97±5.79 15.88±5.86 13.87±2.72 18.90±5.43*Δ 2.595 0.067 F P

2.2 各組小鼠扭體反應(yīng)潛伏期及扭體次數(shù)的比較

結(jié)果顯示，給藥14 d 后，與模型組比較，工藝1、工藝2 及扶他林組小鼠的扭體潛伏期明顯延長(zhǎng)，且扭體次數(shù)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與工藝1 相比，工藝2 組的扭體次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），扭體潛伏期有縮短趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與扶他林組相比，工藝2 組的扭體潛伏期縮短更明顯，其扭體次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。

表2 各組小鼠扭體反應(yīng)潛伏期及扭體次數(shù)的比較（n=10，±s）Tab 2 Comparison of the latency period and number of torsional reactions of mice in various groups（n=10，±s）

表2 各組小鼠扭體反應(yīng)潛伏期及扭體次數(shù)的比較（n=10，±s）Tab 2 Comparison of the latency period and number of torsional reactions of mice in various groups（n=10，±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與工藝1 組比較，#P＜0.05；與工藝2 組比較，△△P＜0.01。

扭體次數(shù)/(次)41.50±10.51 22.20±5.71**29.20±7.15**#19.20±5.96***ΔΔ 17.110 0.000組別模型組工藝1 組工藝2 組扶他林組F P扭體潛伏期/（s）179.80±18.20 329.00±64.38***275.50±53.42**374.30±47.54***ΔΔ 29.172 0.000

2.3 各組小鼠右后足腫脹度的比較

與空白組相比，模型組小鼠右后足跖注射角叉菜膠后腫脹度及腫脹率均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明小鼠急性炎癥造模成功；與模型組比較，工藝1 組、工藝2 組、扶他林組在各時(shí)間點(diǎn)均能顯著降低小鼠右后足腫脹度及腫脹率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與工藝1 組相比，工藝2組在致炎后1～3 h 小鼠足趾的腫脹度及腫脹率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），扶他林組在致炎后1～2 h 腫脹度降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與工藝2 組相比，工藝1 組致炎后1～3 h、扶他林組致炎后1～4 h 的小鼠足部腫脹度及腫脹率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 各組小鼠右后足腫脹度的比較（n=10，±s）Tab 3 Comparison of swelling degree of right hind paw of mice in each group（n=10，±s）

表3 各組小鼠右后足腫脹度的比較（n=10，±s）Tab 3 Comparison of swelling degree of right hind paw of mice in each group（n=10，±s）

注：與空白組比較，&&P＜0.01，&&&P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與工藝1 組比較，#P＜0.05；與工藝2 相比，△P＜0.05。

組別劑量（g） 給藥前足容積（mL）致炎后1 h腫脹度（mL） 腫脹率（%）致炎后2 h腫脹度（mL） 腫脹率（%）致炎后3 h腫脹度（mL） 腫脹率（%）腫脹率（%）空白組模型組工藝1 組—0.09 0.09 0.263±0.028 0.286±0.033 0.262±0.034 0.022±0.018 0.110±0.031&&&0.054±0.027***Δ 7.9 39.5 19.7 0.015±0.012 0.118±0.037&&0.048±0.012**Δ 5.2 41.3 17.8 0.010±0.011 0.096±0.028&&0.039±0.019**Δ 3.5 34.5 14.6致炎后4 h腫脹度（mL）0.012±0.009 0.071±0.016&&0.037±0.020*4.3 25.3 13.9工藝2 組0.09 0.259±0.032 0.062±0.029**22.3 0.056±0.023*21.5 0.049±0.018*19.8 0.046±0.023*17.6扶他林組0.09 0.049±0.026***Δ#18.9 0.042±0.014**Δ#17.1 0.034±0.013**Δ 13.9 0.030±0.010**Δ 25.3 F P 0.263±0.028 1.298 0.285 15.569 0.000 32.951 0.000 29.468 0.000 18.641 0.000

2.4 各組小鼠耳廓腫脹度及腫脹抑制率的比較

與模型組相比，其余3 組小鼠耳廓腫脹度均有顯著的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），工藝1 組的耳廓腫脹抑制率為43.86%，工藝2 組的耳廓腫脹抑制率為25.79%，扶他林組的耳廓腫脹抑制率為61.27%。與工藝1 組相比，工藝2 組的耳廓腫脹度增加，而扶他林組的耳廓腫脹度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與扶他林組比較，工藝2 組的耳廓腫脹度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而工藝1 組有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表4）。

表4 各組小鼠耳廓腫脹度及腫脹抑制率的比較（n=10，±s）Tab 4 Comparison of ear swelling and swelling inhibition rate of mice in each group（n=10，±s）

表4 各組小鼠耳廓腫脹度及腫脹抑制率的比較（n=10，±s）Tab 4 Comparison of ear swelling and swelling inhibition rate of mice in each group（n=10，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與工藝1 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與工藝2 相比，△P＜0.05。

組別模型組工藝1 組工藝2 組扶他林組腫脹抑制率（%）腫脹度（mg）13.3±2.0 7.5±1.9**△9.9±2.9*#5.1±1.4**##△27.914 0.000 43.86 25.79 61.27——--F P

2.5 各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的比較

相比于空白組，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；相比于模型組，工藝1 組、工藝2 組及扶他林組的IL-1β 的含量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），工藝1 組和扶他林組的TNF-α 含量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），扶他林組的IL-6 含量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），工藝1 組和工藝2 組的IL-6 有降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；相比于工藝1 組扶他林組的TNF-α 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相比于工藝2 組扶他林組的TNF-α 降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），工藝1 組和扶他林組的IL-1β 降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表5）。

表5 各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的比較（pg/mg，n=6，±s）Tab 5 Comparison of TNF-α、IL-1β、IL-6 content of mice in each group（pg/mg，n=6，±s）

表5 各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的比較（pg/mg，n=6，±s）Tab 5 Comparison of TNF-α、IL-1β、IL-6 content of mice in each group（pg/mg，n=6，±s）

注：與空白組比較，&&P＜0.01，&&&P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與工藝1 組比較，#P＜0.05；與工藝2相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別空白組模型組工藝1 組工藝2 組扶他林組TNF-α 49.10±8.12 71.21±12.86&&60.55±15.00**66.79±7.80 52.12±7.94**#△△IL-1β 30.12±5.56 62.21±8.86&&&36.00±11.25**51.86±10.58*#34.12±6.01**△△IL-6 68.00±19.29 95.08±26.36&&82.15±23.55 90.13±17.85 73.21±27.29*1.464 0.243 F P 4.552 0.007 14.349 0.001

2.6 各組小鼠右后足足跖皮下組織HE 的比較

結(jié)果顯示，空白組皮下組織的嗜中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞表達(dá)較少，無明顯炎性反應(yīng)（圖1A）；模型組小鼠致炎后皮下組織腫脹、增厚，鏡下可見間隙疏松增寬、彌漫性中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴細(xì)胞增多聚集、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生（圖1B）；工藝1 組和工藝2組嗜中性粒細(xì)胞增多伴散在分布，但工藝2 的組織細(xì)胞聚集傾向較工藝1 加重，且血管擴(kuò)張明顯（圖1C、D）；扶他林組致炎后皮下組織腫脹度較輕，大量肌纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)伴中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞散在分布（圖1E）。結(jié)果顯示，工藝1、2 組和扶他林組均可抑制二甲苯所致的小鼠足跖腫脹，且扶他林的效果最明顯，工藝1 優(yōu)于工藝2。

圖1 各組小鼠右后足足跖皮下組織HE 的比較（×20，bar=100 μm）Fig 1 Comparison of HE of Subcutaneous tissue of the right foot（×20，bar=100 μm）

3 討論

海桐皮湯中的海桐皮、透骨草、乳香、沒藥、川椒、川芎、白芷、紅花、甘草等中藥含有揮發(fā)油類、多糖類及黃酮類活性成分，具有抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抑菌等藥理作用，防治頸肩腰腿痛、跌打損傷及筋翻骨錯(cuò)等疼痛性疾病的療效顯著［16-26］。吳尚先《理瀹駢文》記載：“凡湯丸之有效者，皆可熬膏”［27］，為解決該方攜帶不便、需要煎煮、藥物利用不充分等弊端，本團(tuán)隊(duì)按照海桐皮方的經(jīng)典原方比例稱取藥物，通過兩種不同工藝制備成膏劑，其中工藝1 首先對(duì)含揮發(fā)油類的藥物進(jìn)行揮發(fā)油及水煎液提取另存，然后與水提煎液濃縮的清膏混合；工藝2 為全方水提，直接水煎液濃縮為清膏。臨床常用扶他林軟膏治療骨關(guān)節(jié)炎類疾病，可抗炎鎮(zhèn)痛，提高患者的痛閾值［28-30］，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇扶他林軟膏作為陽性對(duì)照藥，通過熱板痛、扭體反應(yīng)、足跖腫脹和耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)等，初步探討經(jīng)不同工藝制備的海桐皮湯提取膏的抗炎鎮(zhèn)痛作用及其可能機(jī)制。

抗炎藥物需要同時(shí)具有鎮(zhèn)痛活性，熱板痛和扭體反應(yīng)是兩種常用評(píng)價(jià)藥物鎮(zhèn)痛潛能的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在末次給藥后30、60 min 及90 min 工藝1 組、工藝2 組、扶他林組的痛閾值均明顯高于模型組，工藝1 組的痛閾值高于工藝2 組，且在末次給藥60、120 min 后，工藝1 組的痛閾值與扶他林組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究表明，腹腔注射醋酸可導(dǎo)致小鼠腹膜緊張，并激活血清素、組胺、緩激肽和前列腺素等炎癥介質(zhì)的合成和釋放，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)腹部收縮、身體扭曲、背部拱起及活動(dòng)減少等扭體反應(yīng)［31］。本實(shí)驗(yàn)顯示，兩種不同工藝獲取的海桐皮湯提取膏均可起到延長(zhǎng)小鼠扭體潛伏期，減少小鼠扭體次數(shù)的作用，且工藝1 組的作用效果與扶他林組相似。結(jié)果表明，海桐皮湯提取膏具有外周鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且將含揮發(fā)油類的藥物進(jìn)行揮發(fā)油及水煎液提取另存的工藝1 制備方法更優(yōu)。

二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹和角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足部腫脹是急性炎癥模型，被廣泛應(yīng)用于抗炎藥物的療效評(píng)價(jià)和化合物的抗炎活性篩選［32］。角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足部水腫主要為炎癥早期的滲出性水腫，其導(dǎo)致的滲出性水腫根據(jù)釋放炎性介質(zhì)的不同，可分為兩個(gè)階段：第一階段為足部注射角叉菜膠2 h 內(nèi)，炎性介質(zhì)主要為組胺、血清素和緩激肽；第二階段為角叉菜膠注射2 h 后，炎癥由前列腺素和環(huán)氧合酶等炎性物質(zhì)的釋放所介導(dǎo)，此外，第二階段與局部和全身炎癥有關(guān)，也是非甾體類抗炎藥的作用靶點(diǎn)［33，34］。本實(shí)驗(yàn)證明，工藝1、工藝2 制備的海桐皮湯提取膏均可明顯抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的兩個(gè)階段的滲出性水腫，減少小鼠足部腫脹度及腫脹率，且工藝1 優(yōu)于工藝2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，海桐皮湯提取膏抗炎與組胺、血清素、緩激肽和前列腺素表達(dá)下調(diào)及抑制環(huán)氧酶活性等相關(guān)。

TNF-α、IL-1β、IL-6 作為參與機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)及炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞因子已得到證實(shí)［35］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 通過旁分泌和自分泌的形式調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫，過量的TNF-α 可異常激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）等信號(hào)通路，可進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥、自身免疫性疾病的發(fā)生［41］。此外，還可大量誘導(dǎo)產(chǎn)生包括IL-1β、IL-6 在內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子［36］。簡(jiǎn)言之，上述細(xì)胞因子過度存在會(huì)使增加炎癥介質(zhì)，形成炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)，故對(duì)抑制細(xì)胞因子的過量釋放也是評(píng)價(jià)藥物抗炎潛能的重要指標(biāo)［37］。臨床試驗(yàn)證明，予以抗TNF-α 和抗IL-1β 治療對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有確切療效［38］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，工藝1 和工藝2制備的海桐皮湯提取膏可降低角叉菜膠誘導(dǎo)的足腫脹模型小鼠血清中的TNF-α、IL-1β 含量，且工藝1 組降低IL-1β 過度表達(dá)的效果優(yōu)于工藝2。

相比于現(xiàn)有的氮酮、二甲基亞砜等促滲劑，中藥揮發(fā)油兼具較強(qiáng)透皮吸收促進(jìn)作用與皮膚刺激及毒副作用小的同時(shí)，尚能與透皮吸收的藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，現(xiàn)已成為經(jīng)皮給藥吸收促進(jìn)劑的研究熱點(diǎn)［39］。研究顯示，已有34 味中藥揮發(fā)油被作為透皮促滲劑應(yīng)用，其中包含了海桐皮湯中的當(dāng)歸、川椒、川芎、紅花、白芷、防風(fēng)等中藥［40］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，工藝1 制備的海桐皮湯提取膏抗炎鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于工藝2，而工藝1 與工藝2 最大的區(qū)別在于對(duì)中藥揮發(fā)油的提取與另存，故推斷中藥揮發(fā)油的單獨(dú)提取與另存是工藝1 優(yōu)于工藝2 的主要原因所在。

綜上所述，兩種不同工藝制備的海桐皮湯提取膏均有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用，其可能的機(jī)制是抑制了TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎性細(xì)胞因子的釋放，尤其是IL-1β。就工藝制備而言，工藝1 的抗炎鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于工藝2，原因可能與中藥揮發(fā)油的單獨(dú)提取、儲(chǔ)存相關(guān)，此工藝保證了揮發(fā)油有較長(zhǎng)時(shí)效的藥理活性。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李法杰、谷金玉：設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)；李法杰、谷金玉、萬田豪、夏迪：負(fù)責(zé)動(dòng)物造模、藥物干預(yù)、取材、指標(biāo)檢測(cè)；沈碩、姚瑤：經(jīng)不同工藝制備了海桐皮湯提取膏；張悅：進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；李法杰：撰寫文章；張清：審核。