馬 納，秦莉莉，尚冰冰，2，齊寶平，2?

1. 湖北民族大學(xué)生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施445000；2. 湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北恩施445000

0 引言

納米酶(nano-enzyme) 是具有類酶活性的納米催化材料，與天然酶和傳統(tǒng)人工酶相比，具有穩(wěn)定性好、成本低、可重復(fù)利用、便于修飾等優(yōu)點(diǎn)[1～3]。納米酶已經(jīng)成功模擬了包括氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和水解酶等天然酶，在生物傳感、癌癥診斷、組織工程、環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[4～9]。碳質(zhì)納米材料作納米酶具有穩(wěn)定性好、廉價(jià)易得、生物毒性低以及易于化學(xué)修飾等特點(diǎn)，受到廣泛的關(guān)注[10]。1996 年，Dugan 等[11]首次報(bào)道富勒烯及其衍生物具有類似超氧化物歧化酶(SOD) 的活性[11]，隨后越來越多的碳質(zhì)納米材料，包括 碳 納 米 管[12，13]、石 墨 烯 量 子 點(diǎn)(GQDs)[14，15]、氮 化碳[16，17]等相繼被發(fā)現(xiàn)具有類酶活性。Zheng 等[18]報(bào)道了GQDs 具有高效的類過氧化物酶催化活性，其活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大尺寸氧化石墨烯。Sun 等[15]通過選擇性失活特定的含氧官能團(tuán)，探究了GQDs 表面官能團(tuán)對(duì)GQDs 衍生物作為過氧化物酶模擬物的催化活性，發(fā)現(xiàn)GQDs 表面的羰基(—C=O) 是催化活性位點(diǎn)，羧基(—COOH) 可作為底物的結(jié)合位點(diǎn)，羥基(—OH) 對(duì)催化反應(yīng)起到抑制作用。Nirala等[14]研究了外界因素對(duì)GQDs 作為類過氧化物酶的催化活性的影響，發(fā)現(xiàn)GQDs 的催化活性與催化劑的用量、底物的濃度、檢測(cè)液的pH 值和溫度密切相關(guān)。目前，GQDs 的過氧化物酶性質(zhì)研究還處于初期階段，尚缺乏深入的基礎(chǔ)研究。因此，如何提高GQDs 作過氧化物酶的活性以促進(jìn)GQDs 在催化領(lǐng)域的應(yīng)用，具有重要意義。

本文采用超聲剝離法與化學(xué)氧化法分別制備了含氧量較低的GQDs 與含氧量較高的GOQDs，用于3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)與過氧化氫(H2O2) 體系(TMB/H2O2)的催化，探討了GQDs 表面的含氧量對(duì)其類過氧化物酶催化活性的影響，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的一種基于GOQDs 的H2O2分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

試劑：石墨納米顆粒（GNPs，純度高于93%，平均直徑為3～4 nm）購(gòu)自SkySpring 納米材料公司；C2H5OH、H2SO4、K4[Fe(CN)6]?3H2O、K3[Fe(CN)6]、KMnO4、H2O2(30%)、HCl等試劑均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

儀器：JEM-2100F 型高辨透射電子顯微鏡(TEM, JEOL 公司)、Autolab PGSTAT302N 型 電化學(xué)工作站(Metrohm 公司)、Avatar 360 型Fourier變換紅外光譜儀(FT-IR, Thermo Nicolet 公司)、RF-6000 型 熒光分光光度計(jì)(Shimadzu 公司)、TU-1901 (UV-Vis)型雙光束紫外-可見光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 GQDs、GOQDs 及修飾電極的制備

1.2.1 GQDs 的制備

將30 mg GNPs 加入到100 mL 圓底燒瓶中，加入30 mL 乙醇/水(體積比1∶1)，在冰浴中超聲振蕩6 h，所得懸濁液以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min，收集上層清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，重新分散到超純水中，所得淺棕色分散液記為GQDs。

1.2.2 GOQDs 的制備

將0.5 g GNPs 加入到含17 mL H2SO4與0.38 g NaNO3的250 mL 圓底燒瓶中，置于冰浴中，劇烈攪拌下緩慢加入2.5 g KMnO4，反應(yīng)2 h 后，向反應(yīng)體系中加入50 mL 超純水。然后，向上述溶液中滴加2 mL 30% 的H2O2，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)入到250 mL HCl/H2O（體積比為1∶10）溶液中，以20 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，去除上清液，反復(fù)加入超純水洗滌，直至懸浮液接近中性。將上述懸浮液在冰浴中超聲3 h，以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上層棕色清液，記為GOQDs。

1.2.3 修飾電極的制備

采用粒徑為0.3 mm 和0.05 mm Al2O3粉末依次對(duì)玻碳電極(GCE，直徑3.0 mm) 進(jìn)行拋光，超聲清洗后，用N2吹干電極表面。電極倒置，將5 μL GQDs 溶液滴在GCE 表面，室溫風(fēng)干，得到GQDs修飾的GCE 電極，記為GQDs/GCE。

同上述步驟，制備GOQDs 修飾的GCE 電極，記為GOQDs/GCE。

1.3 電化學(xué)檢測(cè)

循環(huán)伏安法（CV）、電化學(xué)阻抗法（EIS）與電流-時(shí)間曲線（I-t）測(cè)試均在電化學(xué)工作站上進(jìn)行。以飽和甘汞電極作參考電極、鉑絲作對(duì)電極、GCE及其修飾電極(GQDs/GCE、GOQDs/GCE)作工作電極，組成三電極體系。

CV 測(cè)試在0.2 mol/L pH 3.8 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液(CPBS)中進(jìn)行，電勢(shì)掃描范圍為-1.0～+0.2 V，掃描速率為50 mV/s，測(cè)試過程中采用N2保護(hù)。 EIS 測(cè)試在含10 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(摩爾比1∶1)的0.1 mol/L KCl溶液中。在0.2 mol/L pH 3.8 CPBS 中，連續(xù)加入不同濃度的H2O2，采集GOQDs/GCE 修飾電極的I-t數(shù)據(jù)。

1.4 GQDs 和GOQDs 的類過氧化物酶活性測(cè)試

以TMB/H2O2體系的顯色反應(yīng)考察GQDs 和GOQDs 的類過氧化物酶活性，操作步驟如下：依次將10 μL GQDs (0.2 mg/mL)、100 μL H2O2(50 mmol/L)、100 μL TMB (0.8 mmol/L) 和1 mL 乙酸鹽緩沖液(0.2 mol/L, pH 3.5) 加入到離心管中，置于50 ℃水浴中反應(yīng)10 min，測(cè)試反應(yīng)后的溶液在500～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜。

同上述步驟，考察GOQDs 的類過氧化物酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 TEM 分析

采用TEM 對(duì)GQDs 與GOQDs 的粒徑與形貌進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，所制備的GQDs 與GOQDs 粒徑較均一,形狀接近圓形,且具有較好的分散性。分別對(duì)200 顆左右的GQDs 與GOQDs進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì)，GQDs 與GOQDs 的平均粒徑分別為（3.3±0.2）nm 與（3.4±0.5）nm，兩種碳質(zhì)納米顆粒的粒徑接近。

圖1 GQDs (a)與GOQDs (b)的TEM 表征Fig.1 TEM images of GQDs (a)and GOQDs (b)

2.1.2 FT-IR 分析

采用FT-IR 對(duì)GQDs 與GOQDs 表面的官能團(tuán)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，位于3 440、1 610、1 110 cm-1處的吸收峰分別歸屬于GQDs 與GOQDs 表面上羥基(—OH)伸縮振動(dòng)、羰基(C=O) 伸縮振動(dòng)及(C—O—C)醚鍵伸縮振動(dòng)。而GOQDs 譜圖在1 740、1 242 cm-1處有羧基中的C=O 伸縮振動(dòng)和C—O 伸縮振動(dòng)。由此可知，與GQDs 相比，GOQDs 表面具有更豐富的含氧官能團(tuán)，這歸因于GOQDs 制備過程中采用了強(qiáng)氧化反應(yīng)體系。

圖2 GQDs 與GOQDs 的FT-IR 圖Fig.2 FT-IR spectra of GQDs and GOQDs

2.1.3 XPS 分析

采用XPS 技術(shù)對(duì)GQDs 與GOQDs 的組成進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，GQDs 與GOQDs 均 由C 和O 組 成，位 于284. 2 eV 和534.5 eV 的特征峰分別歸屬于C 1s 與O 1s。對(duì)目標(biāo)元素C 1s 和O 1s 的峰面積進(jìn)行積分，采用相對(duì)靈敏度因子法[19]得到各目標(biāo)元素的百分含量，GQDs 與GOQDs 中O/C 的含量之比分別為0.11 與0.52。由此可以得出，與GQDs 相比較，GOQDs 表面具有更豐富的含氧官能團(tuán)，與FT-IR 測(cè)試結(jié)果一致。

圖3 GQDs 與GOQDs 的XPS 圖Fig.3 XPS spectra of GQDs and GOQDs

2.1.4 熒光分析

采用熒光分光光度計(jì)，在240～500 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)，以20 nm 幅度改變激發(fā)波長(zhǎng)，觀察GQDs 與GOQDs 的水溶液發(fā)射波長(zhǎng)的變化，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，GQDs 與GOQDs 的熒光發(fā)射波長(zhǎng)隨激發(fā)波長(zhǎng)的改變而改變，其熒光性能表現(xiàn)出激發(fā)依賴性；GQDs 的最佳發(fā)射波長(zhǎng)位于390 nm，GOQDs 的最佳發(fā)射波長(zhǎng)位于536 nm；在365 nm 紫外燈照射下，GQDs 水溶液呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，而GOQDs 水溶液呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光。與GQDs 相比較，GOQDs 的熒光發(fā)射波長(zhǎng)有比較明顯的紅移，這歸因于GOQDs表面含氧官能團(tuán)的增加[19,20]。

圖4 GQDs (a)與GOQDs (b)水溶液的熒光發(fā)射光譜插圖：GQDs（a）與GOQDs（b）水溶液在365 nm 紫外燈照射下的照片F(xiàn)ig.4 Fluorescence emission spectra of GQDs (a)and GOQDs (b)dispersed in water Inset:photos of GQDs (a)and GOQDs (b)under 365 nm UV lamp excitation

2.2 GQDs 與GOQDs 的類過氧化物酶催化活性

2.2.1 GQDs/GCE 與GOQDs/GCE 修飾電極的CV分析

將GQDs 與GOQDs 分別修飾到GCE 電極上，在含6 mmol/L H2O2的0.2 mol/L pH 3.8 CPBS 中采用CV 測(cè)試考察GQDs 與GOQDs 作為類過氧化物酶對(duì)底物H2O2的催化能力，結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可知，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，相對(duì)于裸電極GCE，GQDs/GCE 與GOQDs/GCE 對(duì) 底 物H2O2均 有 較大的響應(yīng)電流，這歸因于GQDs 與GOQDs 的類過氧化物酶催化活性[14，15]；相 對(duì) 于GQDs/GCE，GOQDs/GCE 上的響應(yīng)電流增加顯著，在-0.92 V附近，GQDs/GCE 與GOQDs/GCE 對(duì)H2O2的還原電流峰值分別為0.38、1.65 mA，GOQDs 展現(xiàn)出更好的催化活性。CV 測(cè)試結(jié)果表明，GQDs 與GOQDs 均對(duì)H2O2展現(xiàn)出類過氧化物酶活性，含氧量較高的GOQDs 展現(xiàn)出更好的催化活性。

圖5 GCE、GQDs/GCE 及GOQDs/GCE 在含6 mmol/L H2O2的0.2 mol/L pH 3.8 CPBS 中的CV 曲線Fig.5 CV curves of GCE, GQDs/GCE, and GOQDs/GCE in 0.2 mol/L pH 3.8 CPBS containing 6 mmol/L H2O2

2.2.2 GQDs/GCE 與GOQDs/GCE 修飾電極的EI S分析

采用EIS 技術(shù)測(cè)試GQDs/GCE 與GOQDs/GCE 在含10 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1)的0.1 mol/L KCl 溶液中對(duì)電子的轉(zhuǎn)移能力[21]，結(jié)果如圖6 所示。由圖6 可知，以[Fe(CN)6]3-/4-作探針的交流阻抗圖譜中，裸電極GCE 的電子轉(zhuǎn)移阻礙常數(shù)(Ret) 為780 Ω；修飾電極GQDs/GCE 的Ret幾乎為0，表明GQDs 碳質(zhì)納米材料具有良好的導(dǎo)電性能；修飾電極GOQDs/GCE 的Ret增加至8 780 Ω，表明GOQDs 對(duì)探針具有較強(qiáng)的排斥作用，這歸因于GOQDs 表面豐富的含氧官能團(tuán)降低了碳質(zhì)納米材料的導(dǎo)電性能，抑制了電極表面的電子傳遞。

圖6 GCE、GQDs/GCE 及GOQDs/GCE 在0.1 mol/L KCl 溶液（含10 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1)）中的EIS 曲線Fig.6 EIS curves of GCE, GQDs/GCE and GOQDs/GCE in 0.1 mol/L KCl solution (containing 10 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 (1∶1))

2.2.3 GQDs 與GOQDs 的類過氧化物酶活性

采用TMB/H2O2體系的顯色反應(yīng)考察GQDs和GOQDs 的類過氧化物酶活性。如圖7(a)(b)所示，GQDs 和GOQDs 均可通過催化H2O2的反應(yīng)，將溶液中的TMB 氧化為氧化態(tài)TMB (oxTMB)，溶液由無色變?yōu)樗{(lán)色，oxTMB 在652 nm 處具有特征吸收峰(曲線e 與f)[22]；當(dāng)GQDs 或者GOQDs 單獨(dú)與TMB 反應(yīng)時(shí)，溶液仍然為無色，無法被氧化(曲線c與d)，從而證實(shí)GQDs 與GOQDs 具有類過氧化物酶活性。圖7(b)顯示了GOQDs 催化H2O2氧化TMB 顯色的過程。

采用酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)探究GQDs 與GOQDs 的類過氧化物酶活性，在保持TMB 或H2O2濃度不變的條件下，通過改變另一底物的濃度，進(jìn)行酶促反應(yīng)[22]。如圖7(c)～(f)所示，底物TMB 的濃度在0～0.12 mmol/L 或底物H2O2的濃度在0～300 mmol/L的范圍內(nèi)，GQDs 或GOQDs 與TMB/H2O2體系的催化反應(yīng)遵循Michaelis-Menten 動(dòng)力學(xué)模型[23]，即滿足1/v=Km/(vmax[S])+1/vmax，其中，v為不同底物濃度下的初始反應(yīng)速率；[S]為底物的濃度；Km為米氏常數(shù)（為反應(yīng)速度達(dá)到最大速度一半時(shí)的底物濃度，通常用于表示酶與底物的親和力，Km數(shù)值越小，酶與底物的親和力越強(qiáng)）；vmax為最大初始反應(yīng)速率。通過方程式的斜率和截距可以得出Km和vmax。

圖7 (a)TMB、TMB+H2O2、TMB+GQDs、TMB+GOQDs、TMB/H2O2+GQDs 和TMB/H2O2+GOQDs(曲線a～f)的吸收光譜及對(duì)應(yīng)顏色變化；(b)GOQDs 催化H2O2氧化TMB 顯色的示意圖；GQDs(c)與GOQDs(d)以TMB 為底物時(shí)的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)；GQDs (e)與GOQDs (f)以H2O2為底物時(shí)的Michaelis-Menten 動(dòng)力學(xué)Fig.7 (a)Absorption spectra and the corresponding color changes of the TMB, TMB+H2O2, TMB+GQDs, TMB+GOQDs,TMB/H2O2+GQDs and TMB/H2O2+GOQDs (a-f)solutions;(b)Schematic diagram of GOQDs catalyzed oxidation of TMB into oxidized TMB (oxTMB)in the presence of H2O2;Michaelis-Menten kinetics of GQDs (c)and GOQDs(d)towards TMB;Michaelis-Menten kinetics of GQDs (e)and GOQDs(f)towards H2O2

GQDs 的類過氧化物酶活性：對(duì)于TMB，Km=0.040 mmol/L，vmax=3.69×10-8mol/(L·s)；對(duì) 于H2O2，Km=26.19 mmol/L，vmax=30.92×10-8mol/(L·s)。GOQDs 的類過氧化物酶活性：對(duì)于TMB，Km=0.011 mmol/L，vmax=3.11×10-8mol/(L·s)；對(duì)于H2O2，Km=15.880 mmol/L，vmax=13.64×10-8mol/(L·s)。 GOQDs 的Km值低于GQDs，說明GOQDs 對(duì)于底物H2O2具有更好的親和力。與目前報(bào)道的其他碳質(zhì)納米材料的類過氧化物酶活性相比（見表1），本文中GOQDs 的Km值更低，具有更高的催化活性[15]。

表1 GQDs、GOQDs 與其他碳質(zhì)納米材料作為類過氧化物酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 1 Enzymatic kinetic constants of GQDs and GOQDs in this work with other carbon nanomaterials as peroxidase

2.2.4 GOQDs/GCE 的I-t曲 線 分 析

通過施加-0.92 V 外加電場(chǎng)，在0.2 mol/L CPBS (pH 3.8) 中連續(xù)加入H2O2，測(cè)試GOQDs/GCE 對(duì)目標(biāo)物H2O2的響應(yīng)電流。如圖8(a)所示，加入低至0.002 mmol/L H2O2時(shí)，催化電流有明顯的增加，隨著H2O2的連續(xù)加入，相應(yīng)電流呈階梯式增加。如圖8(b)所示，在0.002～2.4 mmol/L 范圍內(nèi)，GOQDs/GCE 的電流響應(yīng)與H2O2的濃度有較好的線性關(guān)系，線性擬合方程為I(mA)=-0.357 3c(mmol/L) -0.120 9 (R2=0.995)，檢 出 限 為0.4 μmol/L (信噪比S/N=3)。在H2O2濃度低至0.002 mmol/L 時(shí)，響應(yīng)電流在3 s 內(nèi)能達(dá)到穩(wěn)態(tài)，表明GOQDs/GCE 對(duì)小分子有較好的響應(yīng)，歸因于GOQDs 表面上存在類過氧化物酶的活性位點(diǎn)[15]。

圖8 (a)GOQDs/GCE 對(duì)連續(xù)加入H2O2的電流響應(yīng)；(b)GOQDs/GCE 的穩(wěn)態(tài)電流響應(yīng)信號(hào)對(duì)H2O2濃度的線性關(guān)系Fig.8 (a)Amperometric response of GOQDs/GCE to continuous addition of H2O2;(b)the linear relationship between the steady-state current GOQDs/GCE and the different concentrations of H2O2

3 結(jié) 語(yǔ)

本文以GNPs 為原料，制備了含氧量低的GQDs 與含氧量高的GOQDs，探究了含氧量對(duì)GQDs 類過氧化物酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于修飾電極GQDs/GCE，GOQDs/GCE 對(duì)電子具有較大排斥作用，但對(duì)小分子H2O2具有更大響應(yīng)電流；GQDs 與GOQDs 均具有類過氧化物酶活性，相對(duì)于GQDs，GOQDs 的Km數(shù)值更小，對(duì)底物具有更好的親和力；含氧量高的GOQDs 展現(xiàn)出更好的類過氧化物酶活性，證實(shí)豐富含氧官能團(tuán)對(duì)GQDs 的類過氧化物酶活性具有重要作用，為提高GQDs 過氧化物酶催化活性提供了思路。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建GOQDs/GCE 的檢測(cè)平臺(tái)對(duì)H2O2的檢出限為0.4 μmol/L (S/N=3)，在0.002～2.4 mmol/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，為H2O2檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便有效的方法。