齊超，鐘玉虹，王小粉，付鑫焱，喬賽，金紅，楊肅文，張鈞（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 10000；2.浙江省醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)檢驗(yàn)與監(jiān)測(cè)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 10000；.凱德諾醫(yī)療器械（武漢）有限公司醫(yī)學(xué)事務(wù)部，武漢 40000）

細(xì)胞形態(tài)學(xué)（morphology）、免疫學(xué)（immunology）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetics）、分子生物學(xué)（molecular biology）相結(jié)合的MICM 分型方案是目前全世界通用的血液系統(tǒng)疾病診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)［1］。其中，骨髓涂片人工顯微鏡檢查作為形態(tài)學(xué)評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)，是血液系統(tǒng)疾病診斷和預(yù)后評(píng)估不可缺少的重要環(huán)節(jié)。然而，人工顯微鏡檢查既耗時(shí)又繁瑣，并且需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)和具有一定經(jīng)驗(yàn)積累的醫(yī)生來完成［2］。這種人工顯微鏡檢查項(xiàng)目相比于自動(dòng)化的檢驗(yàn)項(xiàng)目而言，其效率顯然不能滿足臨床對(duì)患者診療和評(píng)估的需求。全玻片成像（WSI）、人工智能（AI）、計(jì)算機(jī)深度學(xué)習(xí)算法、聚焦算法等新技術(shù)已被應(yīng)用于骨髓細(xì)胞形態(tài)分析儀的研發(fā)當(dāng)中，但由于骨髓標(biāo)本涉及轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種形態(tài)異常細(xì)胞，其復(fù)雜性和特殊性使得骨髓細(xì)胞形態(tài)分析儀的普及應(yīng)用仍面臨很大的挑戰(zhàn)［3-6］。目前，國(guó)際上對(duì)于骨髓涂片檢查這一項(xiàng)目，仍舊以人工顯微鏡檢查為主要手段。

Morphogo骨髓細(xì)胞形態(tài)分析系統(tǒng)集成掃描硬件和基于計(jì)算機(jī)智能學(xué)習(xí)的軟件系統(tǒng)，能自動(dòng)掃描骨髓涂片，隨后生成骨髓涂片的全數(shù)字圖像，根據(jù)內(nèi)部細(xì)胞識(shí)別算法對(duì)有核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和預(yù)分類，隨后由形態(tài)學(xué)醫(yī)生對(duì)儀器預(yù)分類結(jié)果進(jìn)行審核，最后出具診斷性報(bào)告［6］。本研究采用儀器預(yù)分類輔助下人工審核、傳統(tǒng)人工顯微鏡檢查這2種方式對(duì)正常、感染及多發(fā)性骨髓瘤骨髓涂片進(jìn)行分析與診斷，探討Morphogo能否輔助提高診斷效率。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2020年1月至2021年12月在我院行骨髓穿刺患者的骨髓涂片90 例，其中正常、感染、多發(fā)性骨髓瘤各30例，采用瑞氏-吉姆薩染色對(duì)涂片進(jìn)行染色。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者臨床資料（基本資料、主訴、既往史、現(xiàn)病史、相關(guān)輔助檢查、臨床診斷等）完整；（2）骨髓涂片取材良好，骨髓小粒豐富；（3）骨髓涂片制片良好，涂片頭、體、尾分明。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）排除既往血液系統(tǒng)疾病史者（包括良性、惡性血液系統(tǒng)疾病患者及治愈者）；（2）感染組需排除骨髓穿刺前進(jìn)行抗感染治療者；（3）排除外周血部分稀釋及外周血稀釋者；（4）排除骨髓穿刺前使用過細(xì)胞毒性藥物者。收集上述90例患者的臨床資料，正常組年齡（52.0±17.7）歲，男性20 例，女性10 例；感染組年齡（56.5±16.7）歲，男性12例，女性18例；多發(fā)性骨髓瘤組（67.8±9.3）歲，男性11例，女性19例。

1.2 儀器與試劑 Morphogo-MG-G0R-BA1-027 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)（杭州智微信息科技公司）；瑞氏-吉姆薩染液（貝索公司）；Nikon ECLIPSE 50i顯微鏡（日本尼康公司）

1.3 對(duì)骨髓有核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、預(yù)分類及人工審核 不參與骨髓涂片閱片和審核者對(duì)90 例標(biāo)本進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)（1～90 號(hào)），并且記錄編號(hào)對(duì)應(yīng)的患者信息。標(biāo)本信息對(duì)于儀器操作者和負(fù)責(zé)閱片、審核者雙盲。閱片、審核者具有3年以上細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析經(jīng)驗(yàn)，定期參與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部形態(tài)學(xué)培訓(xùn)，并且通過ISO15189及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)學(xué)考核。

將染色、晾干、編號(hào)后的骨髓涂片放入儀器中進(jìn)行全片掃描，儀器將在高倍鏡（40×）下計(jì)數(shù)全片巨核細(xì)胞數(shù)量，在油鏡（100×）下分類25 個(gè)巨核細(xì)胞及200 個(gè)有核細(xì)胞，儀器將對(duì)粒細(xì)胞系統(tǒng)（粒系）、紅細(xì)胞系統(tǒng)（紅系）、淋巴細(xì)胞系統(tǒng)（淋系）、單核細(xì)胞系統(tǒng)（單核系）、漿細(xì)胞系統(tǒng)（漿系）、巨核細(xì)胞系統(tǒng)（巨核系）的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)分類。對(duì)儀器預(yù)分類結(jié)果中的細(xì)胞圖像進(jìn)行審核，對(duì)預(yù)分類錯(cuò)誤的細(xì)胞進(jìn)行糾正?；谏鲜鲱A(yù)分類及糾正后的結(jié)果，在顯微鏡下對(duì)骨髓涂片進(jìn)行復(fù)核，給出診斷報(bào)告，記錄人工審核、復(fù)核及診斷過程的總耗時(shí)T1。

1.4 人工顯微鏡檢查 由該閱片、審核者對(duì)上述骨髓涂片進(jìn)行人工顯微鏡檢查，在低倍鏡下（10×）預(yù)覽全片并計(jì)數(shù)全片巨核細(xì)胞數(shù)量，在高倍鏡下評(píng)估有核細(xì)胞增生程度，在油鏡下分類25 個(gè)巨核細(xì)胞及200個(gè)有核細(xì)胞，分類部位為體尾交界細(xì)胞形態(tài)平展良好的區(qū)域，最后綜合全片情況給出診斷報(bào)告，記錄全過程的總耗時(shí)T2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。由上述編號(hào)人員將儀器預(yù)分類的原始結(jié)果、人工審核后的糾正結(jié)果及診斷意見導(dǎo)出，將數(shù)據(jù)整合到對(duì)應(yīng)的患者信息中，以人工糾正后的結(jié)果作為有核細(xì)胞分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”來評(píng)估儀器預(yù)分類結(jié)果的準(zhǔn)確度。以患者臨床診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”，分析閱片、審核者在儀器輔助下給出的診斷結(jié)果及人工顯微鏡檢查后給出的診斷結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”之間的符合率。T1、T2數(shù)據(jù)用中位數(shù)（第25 百分位數(shù)，第75 百分位數(shù)）表示，用Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，偏態(tài)分布采用Wilcoxon signed-rank 檢驗(yàn)來分析差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 儀器預(yù)分類準(zhǔn)確度 見表1。Morphogo 對(duì)于正常組和感染組有核細(xì)胞預(yù)分類結(jié)果的總準(zhǔn)確度分別為85.7%和84.4%，對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤組有核細(xì)胞預(yù)分類結(jié)果的總準(zhǔn)確度為63.0%。

表1 儀器預(yù)分類結(jié)果準(zhǔn)確度（%）

2.2 診斷意見符合率 形態(tài)學(xué)醫(yī)生在儀器輔助下的診斷意見、人工顯微鏡檢查后的診斷意見與臨床診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”之間的符合率均為100%。

2.3 T1與T2比對(duì) 見表2。對(duì)于正常組、感染組骨髓涂片的分片和診斷，儀器輔助下耗時(shí)T1 較人工顯微鏡鏡檢耗時(shí)T2 短，同組T1、T2 間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而多發(fā)性骨髓瘤組T1 與T2 之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組T1、T2耗時(shí)比較

3 討論

對(duì)于正常和感染患者的骨髓涂片，Morphogo是一種有效的輔助診斷工具。而對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤這類合并明顯形態(tài)學(xué)改變的疾病，建議以儀器預(yù)分類結(jié)果為示警，及時(shí)進(jìn)行人工顯微鏡鏡檢，第一時(shí)間為臨床醫(yī)生和患者出具診斷報(bào)告。

多發(fā)性骨髓瘤患者的漿細(xì)胞本質(zhì)上是異常的單克隆細(xì)胞株，其免疫表型及細(xì)胞形態(tài)均與正常漿細(xì)胞存在差異。尤其是惡性程度較高的骨髓瘤細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)存在明顯異質(zhì)性，呈聚集性分布。此外，部分患者會(huì)同時(shí)存在多種異常漿細(xì)胞［7］。目前，細(xì)胞識(shí)別算法不能完全準(zhǔn)確識(shí)別這些形態(tài)異常的漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。其次，由于免疫球蛋白的異常會(huì)增加細(xì)胞間的黏連性，導(dǎo)致細(xì)胞舒展欠佳，進(jìn)而影響人工顯微鏡鏡檢和儀器預(yù)分類［8］。這就導(dǎo)致了人工審核預(yù)分類結(jié)果耗時(shí)較久，儀器輔助下的診斷效率較人工顯微鏡鏡檢無明顯提高。

在后續(xù)工作中，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本庫(kù)中合并明顯形態(tài)學(xué)異常的病種類型和數(shù)量，以完善和升級(jí)骨髓細(xì)胞識(shí)別算法。同時(shí)，由于單核細(xì)胞和漿細(xì)胞在正常骨髓有核細(xì)胞組成中占比較低，也需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來降低儀器預(yù)分類準(zhǔn)確度結(jié)果的偏倚。此外，Morphogo清晰的全數(shù)字化圖片可以永久性保存骨髓涂片的原始數(shù)據(jù)，解決了目前臨床上骨髓涂片標(biāo)本保存10年所需的空間占用問題。中小醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以通過儀器采集的細(xì)胞全數(shù)字化圖片實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程會(huì)診，為分級(jí)診療提供新途徑，具有很好的臨床應(yīng)用前景。