促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2(EphA2)SAM結(jié)構(gòu)域?qū)っ附Y(jié)構(gòu)域的脂質(zhì)體結(jié)合能力與激酶活性的調(diào)控研究

吳 霞， 陳倩茍， 王 玥， 劉 偉

(深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心生物醫(yī)學(xué)研究所,深圳市神經(jīng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東， 深圳 518036)

促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體(erythropoietin-producing hepatocellular receptor, Eph receptor)是單次跨膜的受體酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinase, RTK)，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、黏附、運(yùn)動(dòng)、增值、生存與分化等生理過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。根據(jù)其結(jié)合Ephrin配體的特異性，可將Eph受體分為EphA與EphB兩個(gè)亞型，EphA受體亞家族包含9個(gè)成員(EphA1-EphA8、EphA10)，EphB受體亞家族包含了5個(gè)成員(EphB1-EphB4、EphB6)。Eph受體結(jié)構(gòu)均十分相似，由胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段3部分組成。胞外段包含了配體結(jié)合位點(diǎn)(ligand binding domains，LBD)，半胱氨酸密集區(qū)(cysteine rich domain，CRD)，又稱sushi區(qū)，以及2個(gè)Ⅲ型絲連蛋白質(zhì)重復(fù)區(qū)(fibronectin Ⅲ repeats，F(xiàn)N Ⅲ)?？缒^(qū)為一段主要由亮氨酸重復(fù)序列形成的疏水區(qū)組成[2]。胞內(nèi)段由一段包含YxxxxxY (YVDPHTY in EphA2, 589-595) 的近膜段序列(juxtamembrane segment，JMS)、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(tyrosine kinase domain)、SAM(sterile-alpha motif)結(jié)構(gòu)域以及PBM(PDZ domain binding motif)組成(Fig.1A)[3, 4]。

Eph受體的表達(dá)異常和突變與眾多疾病，包括白內(nèi)障、癌癥(例如前列腺癌、乳腺癌)等密切關(guān)聯(lián)。在EphA2受體中，包括T940I在內(nèi)的14個(gè)錯(cuò)義突變可誘導(dǎo)白內(nèi)障的產(chǎn)生[5, 6]。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，EphA2受體與乳腺癌關(guān)系密切，74.80%的乳腺癌組織存在EphA2受體的高表達(dá)[7]。此外，EphA2受體的G391R突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌中增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的生存和侵襲能力[8]。而EphA3在小細(xì)胞肺癌中則表現(xiàn)為一個(gè)抑癌因子，過(guò)表達(dá)EphA3能促進(jìn)細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，并降低腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，受體酪氨酸激酶的激酶結(jié)構(gòu)域可通過(guò)與細(xì)胞膜結(jié)合，調(diào)控其激酶活性。例如，表皮生長(zhǎng)因子受體 (epidermal growth factor receptor, EGFR)的相關(guān)研究表明，其近膜端、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜的結(jié)合對(duì)EGFR的受體活性有著重要的調(diào)控作用[10-12]；EphA2胞外段的FN-Ⅲ2及胞內(nèi)段的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜的結(jié)合會(huì)分別引起胞外、胞內(nèi)段蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變[13, 14]。而EphA2的胞內(nèi)段除了激酶結(jié)構(gòu)域以外，還存在與之相鄰的SAM結(jié)構(gòu)域。研究表明：SAM結(jié)構(gòu)域?qū)っ附Y(jié)構(gòu)域的激酶活性存在抑制作用[16,17]，但是其對(duì)激酶結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜結(jié)合以及由此帶來(lái)的激酶活性的影響并不清楚。在此項(xiàng)研究中，本文采用牛的大腦提取物進(jìn)行了脂質(zhì)體的構(gòu)建以模擬細(xì)胞膜的脂質(zhì)環(huán)境，測(cè)試了EphA2的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域在有無(wú)SAM結(jié)構(gòu)域的情況下結(jié)合脂類的能力差異，并探索了磷酸化后的激酶-SAM串聯(lián)結(jié)構(gòu)域?qū)δそY(jié)合能力的變化，以及細(xì)胞膜對(duì)EphA2胞內(nèi)段激酶-SAM串聯(lián)結(jié)構(gòu)域的激酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 分子克隆

將從小鼠cDNA文庫(kù)中PCR獲取的EphA2 (NCBI accession number：NP_034269.2)不同片段的cDNA序列, 包括 EphA2激酶結(jié)構(gòu)域(EphA2 KD, aa 571～901), EphA2 激酶-SAM串聯(lián)結(jié)構(gòu)域 (EphA2 CT, aa 571～977)，分別插入pET32 M.3C載體以及預(yù)裝GST-PTP1B (NCBI accession number：NP_002818.1, aa 1-301) cDNA的pET-duet-1載體。克隆質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化、復(fù)制，獲得上述質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

1.2 蛋白質(zhì)表達(dá)與純化

將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)菌株 (Novagen)，37 ℃條件下平板培養(yǎng)8 h，挑單克隆點(diǎn)接入10 mL培養(yǎng)基，在37 ℃搖床搖菌過(guò)夜后放大至1 L培養(yǎng)基，培養(yǎng)至濁度為0.6～0.8，降溫至16 ℃，加入終濃度為100 μmol/L的硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG) 誘導(dǎo)培養(yǎng)16～18 h。

離心收菌后用40 mL 結(jié)合緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl, pH7.5，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑)重懸菌液，用高壓均質(zhì)儀(上海永聯(lián))在600～700 MPa壓力下4 ℃勻漿破碎2 min，收集菌液。將細(xì)菌細(xì)胞裂解液在高速離心機(jī)(Beckman)中以48 384 g的速度離心20 min。取上清加入Ni2+-Sepharose 6 Fast Flow (Cytivia)親和層析柱料上，結(jié)合15 min。用30 mL 結(jié)合緩沖液洗1次，用20 mL 沖洗緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5，500 mmol/L NaCl，30 mmol/L咪唑)洗2次，加入15 mL 洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)，孵育15 min，將蛋白質(zhì)從填料中洗脫下來(lái)。經(jīng)鎳柱洗脫的蛋白質(zhì)再用HiLoad 26/600 Superdex 200 PG (Cytivia)凝膠過(guò)濾色譜柱進(jìn)一步純化(用 GB緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA) 預(yù)先平衡好)，收集的目的蛋白質(zhì)用His-3C酶切割N-端Trx標(biāo)簽，再用HiPrep Q HP 16/10離子交換色譜將目的蛋白質(zhì)與His-3C 蛋白酶、His-Trx融合標(biāo)簽進(jìn)行分離。最后，使用 PD-10 (Cytivia)重力色譜柱將離子交換色譜純化所得的目標(biāo)蛋白質(zhì)的緩沖溶液進(jìn)一步更換為200GB (50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2) 。

1.3 脂質(zhì)體結(jié)合檢測(cè)

稱取10 mg牛的大腦提取物(貨號(hào)：B3635，Sigma-Aldrich)溶于200 μL 的200GB緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2)中，用超聲法獲得脂質(zhì)體(HD3100超聲破碎儀(BANDELIN), 30%功率,“5 s工作/5 s停止”循環(huán), 每次超聲2 min, 重復(fù)5次)。

根據(jù)以上體系(Table 1)將蛋白質(zhì)混合均勻，室溫靜置孵育20 min，用436 000 g 速度在4 ℃的超高速離心機(jī)離心40 min，分離沉淀與上清。其中，沉淀P為與脂質(zhì)體結(jié)合的蛋白質(zhì)，上清S為游離蛋白質(zhì)，15% SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。

Table 1 Reagents of lipid binding assay

1.4 磷酸化水平分析

根據(jù)以下體系(Table 2)將蛋白質(zhì)混合均勻，置于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min。磷酸化完成后，取樣用phos-tag 膠或蛋白質(zhì)免疫印跡的方法驗(yàn)證其磷酸化水平。

Table 2 Reagents of phosphorylation assay

1.5 磷酸化蛋白質(zhì)免疫印跡

將磷酸化反應(yīng)后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)膠(12%)分離，將蛋白質(zhì)膠上的樣品電泳轉(zhuǎn)移到適當(dāng)大小的NC膜上，用0.5%(W/V)的脫脂乳封閉后，取1∶1 000一抗鼠源anti-p-tyr抗體(Cell Signaling Technology)4 ℃孵育4 h，再以1∶10 000的比例加入抗小鼠IgG的二抗室溫孵育2 h，顯影，獲得磷酸化水平結(jié)果。

1.6 phos-tag膠

在常規(guī)12% SDS-PAGE分離膠中加入phos-tag丙烯酰胺(貨號(hào)：300-93523，Wako)得phos-tag膠(Table 3)。

Table 3 Reagents of phos-tag ge

在樣品中加入4×SDS-loading dye (80 mmol/L Tris-HCl，pH6.8, 10%(W/V) SDS, 0.5%(W/V)溴酚藍(lán), 50%(V/V)甘油, 1 mmol/L DTT)，并以 100 ℃加熱10 min處理，再取20 μL加入到蛋白質(zhì)膠的點(diǎn)樣孔中。在運(yùn)行緩沖液(25 mmol/L Tris , 250 mmol/L 甘氨酸, 1% (W/V) SDS)中以恒壓(200 V)方式電泳100 min，取出分離膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染料染色，獲得磷酸化膠結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 與磷脂酶PTP1B共表達(dá)提升了促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2胞內(nèi)段蛋白質(zhì)的純化質(zhì)量和均一性

EphA2受體是經(jīng)典的酪氨酸激酶受體，具有自磷酸化的能力[15]。本文首先構(gòu)建了Trx蛋白質(zhì)融合的EphA2受體胞內(nèi)段的激酶-SAM串聯(lián)結(jié)構(gòu)域(以下簡(jiǎn)稱為EphA2 CT)的表達(dá)質(zhì)粒(Fig.1B)。由于Trx-EphA2 CT蛋白質(zhì)具有一定的自磷酸化的能力，在Trx-EphA2 CT的陰離子交換Q柱色譜圖與凝膠圖中，目的蛋白質(zhì)洗脫峰不僅在低鹽濃度可被洗脫，同時(shí)也在高鹽濃度被洗脫出來(lái)，且洗脫位置與酶切后的Trx標(biāo)簽重疊 (Fig.2A, B)。該現(xiàn)象表明，單獨(dú)表達(dá)的EphA2胞內(nèi)段蛋白質(zhì)的表面電荷并不均一。表面攜帶負(fù)電荷較少的目標(biāo)蛋白質(zhì)在較低的鹽濃度中被洗脫下來(lái)；而表面攜帶負(fù)電荷較多的目標(biāo)蛋白質(zhì)則在高鹽濃度中與Trx標(biāo)簽一起被洗脫出來(lái)(Fig.2A, B)。由于單獨(dú)表達(dá)的EphA2胞內(nèi)段蛋白質(zhì)表面電荷狀態(tài)不均一，因此，本文將帶GST標(biāo)簽的磷酸酶PTP1B(protein tyrosine phosphatase1B)的1～301片段，與帶Trx標(biāo)簽的EphA2受體片段共表達(dá)(Fig.1B)，試圖通過(guò)與PTP1B的共表達(dá)降低EphA2的自磷酸化水平，以得到純凈和穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。與單獨(dú)表達(dá)的EphA2胞內(nèi)段蛋白質(zhì)相比，磷酸酶PTP1B 1～301活性片段共表達(dá)的Duet-EphA2 CT胞內(nèi)段蛋白質(zhì)的陰離子交換色譜的洗脫模式明顯不同：目標(biāo)蛋白質(zhì)只在低鹽濃度下被洗脫，不與Trx蛋白質(zhì)共同洗脫，結(jié)果提示，其表面電荷的帶電狀態(tài)相對(duì)于單獨(dú)表達(dá)的Trx-EphA2 CT存在明顯差異，攜帶更少的表面負(fù)電荷 (Fig.2C, D)。

Fig.1 Domain organization and protein expression strategies of different EphA2 fragments (A) Schematic diagrams showing the domain organization of EphA2 full-length, the KD (EphA2 kinase domain, aa 571-901, including juxtamembrane segment and kinase domain) and CT (EphA2 cytoplasmic tail, aa 571-977, including juxtamembrane segment, kinase domain, SAM domain and PBM). (B) Schematic diagrams showing the protein expression strategies of EphA2 CT and KD (Left: Constructs of target proteins; Right: overexpression products). RBS: ribosome binding site

對(duì)比2種表達(dá)載體的蛋白質(zhì)磷酸化水平，單獨(dú)表達(dá)的Trx-EphA2 CT的磷酸化水平較高，表面電荷存在至少2種帶電狀態(tài)，而與PTP1B共表達(dá)的Trx-EphA2 CT表面電荷較少，磷酸化水平較低或接近于“無(wú)磷酸化”(Fig.2E)。就蛋白質(zhì)的性質(zhì)而言，由于單獨(dú)表達(dá)的Trx-EphA2 CT的自我磷酸化，使其蛋白質(zhì)性質(zhì)表現(xiàn)為穩(wěn)定性差和容易沉淀。因此，在經(jīng)過(guò)表達(dá)純化條件的優(yōu)化和摸索后，通過(guò)EphA2與PTP1B共表達(dá)的方式，得到了穩(wěn)定而均一的目的蛋白質(zhì)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了便利。

Fig.2 Explosion of the expression and purification conditions of EphA2 intracellular portion (A, B) Anion ion exchange chromatography and corresponding SDS-PAGE (15%) results of Trx-EphA2 CT fusion protein. There is a two-peak distribution profile on the anion ion exchange column. The blue line in the figure A showing the UV absorption, and the red line showing the conductance. The red arrow in figure A&B shows the first elution peak of target protein, and the blue arrow showing the second elution peak, which is overlapped with the elution peak of Trx tag. (C, D) Anion ion exchange chromatography and corresponding SDS-PAGE (15%) results of Trx-EphA2 CT protein co-expressed with PTP1B 1-301 fragment. The elution peak of Trx-EphA2 CT protein on the anion ion exchange column is not overlapped with the elution peak of Trx tag. The blue line in the figure C showing the UV absorption, and the red line showing the conductance. The red arrow in figure C&D shows the elution peak of Trx-EphA2 CT protein, and the blue arrow shows the elution peak of Trx tag. (E). The auto-phosphorylation levels of purified EphA2 CT from two expression methods (non-PTP1B co-expression versus PTP1B co-expression) were measured by Western blot

2.2 SAM結(jié)構(gòu)域促進(jìn)了促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與脂質(zhì)體的結(jié)合。

先前研究表明，EphA2的酪氨酸激酶基團(tuán)有結(jié)合細(xì)胞膜的能力，其結(jié)合細(xì)胞膜后會(huì)影響其磷酸化活性[13]。而與激酶結(jié)構(gòu)域相鄰的SAM結(jié)構(gòu)域也被發(fā)現(xiàn)可負(fù)向調(diào)節(jié)其激酶活性[16-18]，但SAM結(jié)構(gòu)域是否參與激酶結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜結(jié)合的過(guò)程仍不清楚。因此，本文表達(dá)純化了不含SAM結(jié)構(gòu)域的EphA2激酶結(jié)構(gòu)域 (KD, Fig.1A)，通過(guò)比較EphA2 KD/EphA2 CT與脂質(zhì)體的結(jié)合，探索SAM結(jié)構(gòu)域?qū)っ附Y(jié)構(gòu)域結(jié)合細(xì)胞膜的影響。

利用牛的大腦提取物進(jìn)行了脂質(zhì)體的構(gòu)建，通過(guò)脂質(zhì)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，比較純化的CT與KD兩種蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體結(jié)合能力。結(jié)果正如Fig.3所示，在4 mg/mL的脂質(zhì)體濃度下，相比于激酶結(jié)構(gòu)域本身，包含SAM結(jié)構(gòu)域的EphA2CT與脂質(zhì)體的結(jié)合能力增強(qiáng)了6倍(P<0.001)，提示與激酶結(jié)構(gòu)域相鄰的SAM結(jié)構(gòu)域促進(jìn)了激酶結(jié)構(gòu)域與脂質(zhì)體的結(jié)合。

Fig.3 SAM domain of EphA2 enhances the lipid binding of kinase domain (A) Lipid binding results of 50 μmol/L EphA2 CT/KD and 4 mg/mL liposomes after the protein-lipid mixture was centrifuged for 40 min in 436 000 g. The P (precipitation) represents the proteins that bind to liposome, and the S (supernatant) represents the proteins that do not bind to liposome. (B) Quantification results of lipid binding assay (one-way ANOVA, *** P<0.001)

2.3 脂質(zhì)體結(jié)合能力與磷酸化能力相互促進(jìn)

由于EphA2受體作為酪氨酸激酶受體具有自磷酸化的能力，我們探討了磷酸化前后的EphA2 CT蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體的結(jié)合能力。結(jié)果顯示：在2 mg/mL的脂質(zhì)體濃度下，與未磷酸化的EphA2 CT相比，磷酸化后的EphA2 CT與脂質(zhì)體結(jié)合能力更強(qiáng) (約增強(qiáng)2.5倍，P<0.05)(Fig.4A-C)。同時(shí)，我們也好奇：與脂質(zhì)體結(jié)合對(duì)EphA2 CT的激酶活性是否產(chǎn)生影響？通過(guò)檢測(cè)EphA2 CT與脂質(zhì)體結(jié)合前后其自磷酸化能力的變化，我們發(fā)現(xiàn)：與脂質(zhì)體結(jié)合后，EphA2CT的磷酸化能力得到了也明顯增強(qiáng)(Fig.4D)。

Fig.4 The positive feedback loop between the lipid binding and tyrosine phosphorylation (A, B) Lipid binding results of 50 μmol/L phosphorylated (Pi-CT) or dephosphorylated EphA2 CT (CT) after the protein-lipid mixture was centrifuged for 40 min in 436 000 g. The P (precipitation) represents the proteins that bind to liposome, and the S (supernatant) represents the proteins that do not bind to liposome. (C) Quantification results of lipid binding assay was performed by one-way ANOVA, * P<0.05, compared with the A2 group. (D) The results of phos-tag SDS-PAGE (12%) gel that showing the time-dependent phosphorylation differences between free and lipid-bound (2 mg/mL) EphA2 CT. The EphA2 (50 μmol/L) was auto-phosphorylated in the 200GB (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT, 5 mmol/L MgCl2) containing 2 mmol/L ATP in 37 ℃ water bath for 30 min. The migrated band shifts indicate the auto-phosphorylation levels of EphA2 CT

綜合以上結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)：EphA2 SAM結(jié)構(gòu)域的存在增強(qiáng)了EphA2激酶結(jié)構(gòu)域與脂質(zhì)體的相互作用。其次，磷酸化后的EphA2 CT與脂質(zhì)體的結(jié)合能力得到了增強(qiáng)；同時(shí)，在結(jié)合脂質(zhì)體后，EphA2 CT的激酶活性也進(jìn)一步增強(qiáng)，從而形成了一個(gè)脂質(zhì)體結(jié)合能力與激酶活性相互促進(jìn)的正反饋現(xiàn)象。

3 討論

Eph受體是單次跨膜的受體酪氨酸激酶，在細(xì)胞的形態(tài)、黏附、運(yùn)動(dòng)、增值、生存、分化等生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，探索其活性調(diào)控機(jī)制對(duì)研究Eph受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)具有重要的意義。在此項(xiàng)研究中，通過(guò)與磷酸酶PTP1B共表達(dá)的方式，我們得到了穩(wěn)定、接近于無(wú)磷酸化的均一性高的EphA2蛋白質(zhì)片段，這一探索為其它需要進(jìn)行重組表達(dá)純化的激酶研究提供了很好的借鑒。

脂質(zhì)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，EphA2受體SAM結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)了其相鄰的激酶結(jié)構(gòu)域與脂質(zhì)體的結(jié)合。結(jié)合之前EphA2 SAM結(jié)構(gòu)域抑制激酶結(jié)構(gòu)域活性的研究結(jié)果[16, 17]，提示EphA2胞內(nèi)段的SAM結(jié)構(gòu)域可能與激酶結(jié)構(gòu)域共同形成了一個(gè)完整的功能結(jié)構(gòu)單位，即超結(jié)構(gòu)域 (supramodule)。在后續(xù)研究中，通過(guò)解析EphA2胞內(nèi)段激酶-SAM串聯(lián)結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)并揭示激酶與SAM結(jié)構(gòu)域之間的相互作用面的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，將能夠很好地解釋這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間互相協(xié)調(diào)的分子機(jī)制。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)了EphA2 CT與脂質(zhì)體結(jié)合對(duì)其酶活的正反饋現(xiàn)象。猜想這種正反饋可能的作用機(jī)制是：通過(guò)與細(xì)胞膜的結(jié)合，提高了EphA2受體胞內(nèi)段激酶-SAM串聯(lián)結(jié)構(gòu)域 (EphA2 CT) 在細(xì)胞膜上相互碰撞和聚集的機(jī)會(huì)，從而促進(jìn)了其自身磷酸化?？紤]到EphA2是單次跨膜的蛋白質(zhì)，其激酶結(jié)構(gòu)域和SAM結(jié)構(gòu)域都與細(xì)胞膜非常接近，因此其“激酶結(jié)構(gòu)域的自磷酸化”與“膜脂結(jié)合”這兩種能力的相互促進(jìn)。提示EphA2受體在被配體激活時(shí)可能通過(guò)與細(xì)胞膜結(jié)合的方式進(jìn)一步放大自磷酸化的信號(hào)。在接下來(lái)的研究中，可通過(guò)調(diào)節(jié)EphA2與磷脂膜的相互作用來(lái)調(diào)控激其酶活，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游信號(hào)的調(diào)節(jié)。最后，對(duì)于Eph受體家族的其他亞型，目前仍不清楚它們是否也存在與EphA2類似的活性調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，在我們的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究Eph受體家族中其他亞型的胞內(nèi)段活性調(diào)控機(jī)制也將是一個(gè)有益的研究方向。