劉 璐， 楊金月， 王 瑩， 何建瑜， 張曉林， 何夢(mèng)嵐， 嚴(yán)小軍， 廖 智

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院海洋生物資源與分子工程研究室, 浙江 舟山 316022)

貽貝在全球有著廣泛的分布, 是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雙殼貝類。貝類因其濾食性特征導(dǎo)致其在生存過程中會(huì)富集水體中大量的微生物。同時(shí)，貝類作為無(wú)脊椎動(dòng)物僅具有先天免疫系統(tǒng)。因此, 在當(dāng)前貝類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展過程中, 因高密度養(yǎng)殖以及水體污染等導(dǎo)致養(yǎng)殖貝類大規(guī)模病害甚至死亡的事件時(shí)有發(fā)生[1-4]。但令人感興趣的是, 同樣是雙殼貝類, 貽貝在養(yǎng)殖過程中卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的疾病耐受性。迄今為止, 尚無(wú)貽貝屬(Mytilus)在養(yǎng)殖過程中大規(guī)模病害的報(bào)道[4,5]。在貽貝、牡蠣以及蛤類混養(yǎng)海域中, 高密度的弧菌、病毒以及寄生蟲等通常造成牡蠣及蛤類的大量死亡, 但并未對(duì)同海域生存的貽貝產(chǎn)生明顯危害[4-6]。上述研究結(jié)果表明, 相較于其他貝類, 貽貝具有獨(dú)特而強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)。因此, 貽貝已成為海洋無(wú)脊椎動(dòng)物免疫相關(guān)研究的重要對(duì)象[6,7]。目前, 已知貽貝的免疫系統(tǒng)對(duì)病原微生物表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐受性[8, 9], 表明貽貝獨(dú)特的免疫防御機(jī)制能有效抵御水體中各種微生物的侵襲。因此, 對(duì)貽貝的免疫系統(tǒng)及其分子機(jī)制研究具有重要的科學(xué)意義[10]。

目前的研究結(jié)果表明, 貽貝具有一套復(fù)雜的免疫體系。其先天免疫系統(tǒng)可分為粘液免疫體系, 細(xì)胞免疫體系以及體液免疫體系三個(gè)子系統(tǒng)[11]。其免疫體系的基本工作機(jī)制包括免疫感受、識(shí)別和效應(yīng)三個(gè)方面, 涉及的分子過程包括免疫吞噬、包裹、免疫細(xì)胞聚集、酚氧化酶系統(tǒng)、氮自由基系統(tǒng)、裂解酶系統(tǒng)以及免疫細(xì)胞釋放免疫效應(yīng)因子等[7,11-13]。值得關(guān)注的是, 在當(dāng)前對(duì)于貽貝免疫效應(yīng)分子研究中, 貽貝抗菌肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的分子多樣性和廣譜的抗菌活性。目前，已報(bào)道的貽貝抗菌肽已超過10種不同家族[7]。且在同一家族內(nèi), 貽貝抗菌肽也表現(xiàn)出極強(qiáng)的分子多樣性特征, 具有不同的轉(zhuǎn)錄本。例如，貽貝抗菌肽myticin，其家族成員(轉(zhuǎn)錄本)數(shù)量超過20種[14]；而另一種貽貝抗菌肽mytimycin, 被發(fā)現(xiàn)在貽貝屬中具有106種不同亞型，并可歸納為13個(gè)亞家族[15]。從已報(bào)道的貽貝屬物種的基因組序列來(lái)看, 貽貝抗菌肽的分子多樣性可能來(lái)自于其在基因組中的高拷貝數(shù)量、基因的可變剪切、以及不同貽貝個(gè)體間存在的高度差異化的非必需基因(dispensable genes)[16,17]。目前, 貽貝已成為海洋生物中發(fā)現(xiàn)抗菌肽數(shù)量最為豐富的物種之一, 其豐富的抗菌肽分子多樣性也為開發(fā)貽貝抗菌肽為來(lái)源的新型生物抗生素提供了一個(gè)資源寶庫(kù)。

厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)是我國(guó)東部海域最重要的養(yǎng)殖貝類之一。此前的研究已從厚殼貽貝中鑒定到豐富的各類抗菌肽分子, 包括mytilin[18], myticin[19], myticusin[20]以及mytichitin[21]等。為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和篩選厚殼貽貝新型抗菌肽分子, 通過對(duì)厚殼貽貝血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組[22]進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘, 從中篩選到2種新型的貽貝抗菌肽分子。序列分析結(jié)果表明, 該新型抗菌肽與節(jié)肢動(dòng)物防御素具有較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)相似性, 因而被命名為類節(jié)肢動(dòng)物防御素(arthropod like defensin, ALD)。盡管此前已有報(bào)道，發(fā)現(xiàn)在地中海貽貝(Mytilusgalloprovincialis)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中存在ALD, 但對(duì)于該類抗菌肽在貽貝體內(nèi)的免疫功能并未開展相關(guān)研究。為此, 以厚殼貽貝新發(fā)現(xiàn)的2種ALD為研究對(duì)象, 在序列分析的基礎(chǔ)上, 開展了2種ALD在厚殼貽貝體內(nèi)的分布特征及其在貽貝免疫過程中的作用研究; 同時(shí)也對(duì)2種厚殼貽貝ALD分子開展了固相化學(xué)合成以及功能驗(yàn)證。上述研究一方面為深入了解厚殼貽貝的抗菌肽分子多樣性以及新型防御素在貽貝免疫過程中的分子角色奠定了基礎(chǔ), 也為后續(xù)開發(fā)厚殼貽貝新型防御素為來(lái)源的生物抗生素提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘與序列分析

此前已完成厚殼貽貝血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 共獲得63 942條單基因簇(unigene)[22]。采用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的BlastX程序?qū)駳べO貝血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組unigene進(jìn)行同源序列搜索, 數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBI的非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI non-redundant protein sequences), 閾值(E-value)設(shè)置為小于1E-05。從序列搜索結(jié)果中篩選與節(jié)肢動(dòng)物防御素(arthropod defensin)具有較高相似性(序列一致性大于40%)，且開放閱讀框完整的unigene序列。

Unigene的開放閱讀框采用Lasergene軟件的Editseq模塊(版本7.1.0)進(jìn)行分析。開放閱讀框推導(dǎo)的氨基酸序列采用在線網(wǎng)站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)以及SignalP 4.0[23]分析序列中的結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。序列中成熟肽采用ProP軟件[24]進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)利用在線網(wǎng)站Prabi(http://pbil.ibcp.fr/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SWISS MODEL服務(wù)器在線進(jìn)行。多序列比對(duì)于網(wǎng)站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在線進(jìn)行。進(jìn)化樹采用MEGA X軟件以鄰近法(Neighbor-Joining method)進(jìn)行分析[25]。

1.2 PCR分析

對(duì)篩選到的厚殼貽貝ALD序列首先進(jìn)行序列驗(yàn)證。根據(jù)其序列中開放閱讀框兩端的核酸序列設(shè)計(jì)特異性引物(Table 1), 利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增, 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并將所測(cè)序列與原始序列進(jìn)行比較。進(jìn)一步利用厚殼貽貝ALD開放閱讀框內(nèi)序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR(quantitative PCR, qPCR)引物(Table 1)并開展基因表達(dá)分析。

Table 1 Primers for qPCR analysis

組織表達(dá)差異分析步驟如下。成年厚殼貽貝個(gè)體采集自浙江舟山嵊泗海域的貽貝養(yǎng)殖場(chǎng)。收集厚殼貽貝各組織(后閉殼肌、血細(xì)胞、外套膜、消化腺、性腺、足和鰓),經(jīng)液氮研磨后, 以TRIzol試劑進(jìn)行總RNA提取。采用試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit, TaKaRa公司)進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄; 逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板用于厚殼貽貝ALD的組織表達(dá)差異分析。

厚殼貽貝的細(xì)菌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[26]。事先對(duì)厚殼貽貝進(jìn)行不同微生物誘導(dǎo), 包括金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(CGMCC1.128), 溶藻弧菌Vibrioalginolyticus(CGMCC1.1616), 和白色念珠菌Candidaalbicans(CGMCC1.1630)。將金黃色葡萄球菌和溶藻弧菌接種于Luria-Bertani培養(yǎng)基中, 白色念珠菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h至A600值為0.4～0.6，離心(2 000 ×g,5 min)收集菌體,分別重懸于滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)，調(diào)菌濃度至A600為0.4，取菌液100 μL，從貽貝后閉殼肌內(nèi)注射。貽貝經(jīng)誘導(dǎo)后分別于0.5, 2, 4, 8, 24和48 h采集外套膜和血淋巴。其中, 血淋巴采用內(nèi)含抗凝劑阿氏液注射器進(jìn)行收集，離心(1 000 ×g,5 min)獲得血細(xì)胞。分別對(duì)外套膜和血細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄, 所得血細(xì)胞cDNA作為模板開展后續(xù)熒光定量PCR分析。

不同發(fā)育階段的厚殼貽貝幼蟲及成年貝采集自浙江舟山嵊泗的石柱山貽貝育苗廠。包括D型幼蟲(trochophore)、擔(dān)輪幼蟲(veliger)、殼頂幼蟲(metamorphosis)、匍匐幼蟲(pediveliger)、稚貝(juvenile), 以及3月齡, 6月齡和9月齡3種成年貝(adult), 共8種不同發(fā)育階段。幼蟲不同發(fā)育階段的判定參照文獻(xiàn)報(bào)道[27], 以及光學(xué)顯微鏡形態(tài)觀察判定。采集的不同發(fā)育階段貽貝樣本, 取全組織經(jīng)液氮研磨后, 進(jìn)行總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA用于后續(xù)熒光定量PCR分析。

熒光定量PCR在MX3000P實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)(Stratagene公司, 美國(guó))進(jìn)行。熒光染料為SYBR Green。PCR程序設(shè)置為95℃,預(yù)變性180 s, 之后為95℃變性20 s, 59℃退火20 s, 72℃延伸25 s，循環(huán)數(shù)為35，特異性引物及內(nèi)參基因引物見Table 1。表達(dá)量依據(jù)CT值采用2-△△Ct方法[28]進(jìn)行分析。

1.3 貽貝節(jié)肢動(dòng)物防御素的固相多肽化學(xué)合成及鑒定

多肽固相化學(xué)合成參照文獻(xiàn)[29], 在十二通道半自動(dòng)多肽合成儀(上海強(qiáng)耀公司自主專利產(chǎn)品)上合成, 合成方向?yàn)閺腃-端向N-端。合成后的線性多肽粗品以高效液相色譜儀(Agilent 1260, 美國(guó)安捷倫公司)進(jìn)行分離純化,色譜柱為 C8 反相柱(4.6×250 mm, 5 μm), 洗脫液分別為A液：含0.1%TFA的純水；B液：含0.1%TFA的乙腈；洗脫梯度為20 min內(nèi)B液比例由30%上升到65%；流速為1.0 mL/min；采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè), 檢測(cè)波長(zhǎng)為 220 nm, 收集洗脫目標(biāo)峰開展質(zhì)譜分析, 采用質(zhì)譜(ZQ2000, 美國(guó) Waters 公司)對(duì)合成后的多肽純品進(jìn)行分子量鑒定。質(zhì)譜檢測(cè)條件為: 氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI)；毛細(xì)管電壓為 2.5 kV；檢測(cè)器電壓為 1.5 kV；離子源溫度為450℃；離子檢測(cè)方式為選擇性離子檢測(cè)；離子極性為正離子。

參照文獻(xiàn)方法[29], 采用谷胱甘肽氧化型和還原型按1∶10配置混合溶液對(duì)固相合成后的ALD進(jìn)行復(fù)性; 復(fù)性在避光以及4 ℃條件下進(jìn)行, 復(fù)性時(shí)間為 24 h。復(fù)性后的多肽進(jìn)一步經(jīng)高效液相色譜純化, 收集目的峰, 經(jīng)凍干后開展抑菌活性分析。

1.4 抑菌活性測(cè)試

參照文獻(xiàn)方法[30], 對(duì)復(fù)性后的ALD采用生長(zhǎng)曲線抑制法進(jìn)行抑菌活性測(cè)試。測(cè)試菌種均購(gòu)自北京中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心, 包括大腸桿菌Escherichiacoli、巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium(ATCC 19161)、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC25923)、副溶血弧菌VibrioParahaemolyticus(ATCC17802)、白色念球菌Moniliaalbican(ATCC10231)以及藤黃疊球菌Sarcinalutea(ATCC4698)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 軟件(v25.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值±方差表示。數(shù)據(jù)圖以GraphPad Prism8.2軟件繪制。組間比較采用One-way ANOVA方法進(jìn)行顯著性差異分析,P<0.05代表具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝節(jié)肢動(dòng)物防御素具有典型的防御素結(jié)構(gòu)特征

經(jīng)序列驗(yàn)證后的厚殼貽貝ALD-1和ALD-2序列已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù), 序列號(hào)分別為MW922034.1(QXT26513.1)和MW922035.1(QXT26514.1)。ALD-1基因開放閱讀框長(zhǎng)度為291 bp, 編碼1條96個(gè)氨基酸殘基組成的前體多肽, 包括信號(hào)肽(22個(gè)氨基酸殘基)、pre-pro區(qū)(31個(gè)氨基酸殘基)和成熟肽(43個(gè)氨基酸殘基)(Fig.1A)。其成熟肽序列中含有6個(gè)半胱氨酸, 推測(cè)形成3對(duì)二硫鍵, 其半胱氨酸排列模式為C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C(C代表半胱氨酸; X代表其他氨基酸殘基, 數(shù)字代表殘基數(shù)目), 該排列模式與經(jīng)典的節(jié)肢動(dòng)物防御素基本一致[31]。ALD-2基因開放閱讀框長(zhǎng)度為204 bp, 編碼的前體肽長(zhǎng)度為67個(gè)氨基酸殘基, 包括信號(hào)肽(24個(gè)氨基酸殘基)和成熟肽(43個(gè)氨基酸殘基), 無(wú)可預(yù)測(cè)的pre-pro區(qū)(Fig.1B)。其成熟肽序列中含有8個(gè)半胱氨酸, 推測(cè)形成4對(duì)二硫鍵, 其半胱氨酸排列模式為C-X6-C-X3-C-X4-C-X5-C-X9-C-X1-C-X3-C。該排列模式與節(jié)肢動(dòng)物抗菌中具有抗真菌活性的防御素類似[32,33]。ALD-1理論分子量為4 471.14D, 理論等電點(diǎn)為8.69, 屬于堿性多肽，其成熟肽中含量最豐富的氨基酸為甘氨酸和半胱氨酸, 其含量均為14%; ALD-2理論分子量為4 688.41D, 理論等電點(diǎn)為7.51, 屬弱堿性多肽，成熟肽中含量最豐富的氨基酸為半胱氨酸(占比18.6%), 其次為甘氨酸(占比14%)。

Fig.1 cDNA sequence and derived amino acid sequence of ALD-1(A)and ALD-2(B) The predicted signal peptide is boxed.The putative mature region is in bold.Asterisk indicates the stop codon.Sequence alignment of cDNA with deduced amino acids of ALD-1(GeneBank: MW922034)and ALD-2(GeneBank: MW922035)were performed by DNAMAN8 software

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ALD-1序列中, Alpha螺旋區(qū)(alpha helix)含量占比為39.58%, 完全伸展區(qū)(extended strand)占比16.67%, 無(wú)規(guī)卷曲(random coil)占比37.50%(Fig.2)。ALD-2序列中, Alpha螺旋區(qū)含量較低, 占比僅為13.43%, 完全伸展區(qū)占比36.23%, 無(wú)規(guī)卷曲占比55.22%(Fig.2)。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明, ALD-1序列中含有1個(gè)Knot1結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域編號(hào): SM000505), 其位置位于前體肽的55～96號(hào)殘基(Fig.2)。該結(jié)構(gòu)域典型特征在于其中的胱氨酸結(jié)(cystine-knot), 即由二硫鍵介導(dǎo)的結(jié)節(jié)狀構(gòu)象, 普遍存在于植物及節(jié)肢動(dòng)物抗菌肽, 以及部分蝎毒素多肽序列中[34], 是一種較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域。ALD-2的序列中含有1個(gè)Defensin_2結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域編號(hào): PF01097), 其位置為25～63號(hào)殘基(Fig.2)。該結(jié)構(gòu)域典型特征在于其序列中保守的6個(gè)半胱氨酸及由此形成的3對(duì)二硫鍵, 該結(jié)構(gòu)域普遍存在于節(jié)肢動(dòng)物抗菌肽中[35-37]。進(jìn)一步的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明, ALD-1和ALD-2均采取了經(jīng)典的二硫鍵穩(wěn)定α/β結(jié)構(gòu)[38]。其三級(jí)結(jié)構(gòu)特征包括均包含一段位于序列C-端的α-螺旋和序列N-端的2～4段反平行β-折疊(Fig.2), 且三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果具有類似特征。

Fig.2 The structural features of ALD-1 and ALD-2 From the top to bottom, secondary structure, domain, and spatial structure prediction are presented.The secondary structure was predicted by Prabi(http://pbil.ibcp.fr/)online(h represents helix, c represents coil, and e represents sheets, respectively).The domain was predicted by SMART.The spatial structure was predicted by SWISS MODEL server.The template for spatial structure prediction are Coprisin A of Copristripartitus(PDB:2LN4)for ALD-1, and Micasin A of Microsporumcanis(PDB: 2LR5)for ALD-2, respectively.“N” and “C” represent the N-terminal and the C-terminal of peptide, respectively

對(duì)ALD-1和ALD-2的序列同源搜索比對(duì)結(jié)果表明, ALD-1與來(lái)自椎椿以及臭蟲屬的防御素具有較高序列相似性(Fig.3)；而ALD-2則與來(lái)自蜱屬的防御素具有較高序列相似性(Fig.3)。進(jìn)一步的進(jìn)化樹分析表明, ALD-1主要與臭蟲屬以及椎椿屬防御素聚為一支, 但進(jìn)化地位相對(duì)獨(dú)立(Fig.4); 而ALD-2則主要與革蜱屬以及扇頭蜱屬的防御素聚為一支, 而與同為雙殼貝類的牡蠣防御素分支較遠(yuǎn)(Fig.4)。上述結(jié)果表明, 厚殼貽貝ALD-1和ALD-2與低等節(jié)肢動(dòng)物的防御素在進(jìn)化上可能具有近緣關(guān)系。

Fig.3 Multiple alignment of ALD-1(A)and ALD-2(B)with other homologous sequences Conserved amino acid are represented by black, gray indicates amino acids with strong similarities.QXT26513.1:Mytiluscoruscus ALD-1; AHY02937.1: Panstrongylus megistus defensin B; ATU82749.1:Pristhesancusplagipennis secreted Defensin-like peptide; AHY02944.1:Rhodniusprolixus defensin A P;ACH57150.1:Triatomabrasiliensis defensin 3;AXY04219.1:Meccuspallidipennis defensin 4.1;(QXT26514.1:Mytiluscoruscus ALD-2;XP_040070933.2:Ixodesscapularis defensin-like;Q20A06.1:Crassostreagigas Hemocyte defensin Cg-Defh1; AEO45009.1:Crassostreagigas mantle defensin; XP_037570444.1:Dermacentorsilvarum defensin-like; XP_037517488.1:Rhipicephalussanguineus defensin-like; ACQ76283.1:Crassostreagigas defensin

Fig.4 Phylogenetic tree of ALD-1(A)and ALD-2(B)with homologous sequences Phylogenetic analysis was done by the neighbor-joining algorithm within the MEGAX based on ClustalW alignment.Numbers at tree nodes indicate the bootstrap confidence values from 1000 replicates.“★”labeled target sequence

2.2 厚殼貽貝節(jié)肢動(dòng)物防御素具有不同的組織及發(fā)育階段表達(dá)差異性

利用熒光定量PCR技術(shù), 首先對(duì)ALD 在厚殼貽貝各組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析, 結(jié)果見Fig.5A。由圖可見, ALD-1在厚殼貽貝7種組織中均有表達(dá), 其相對(duì)表達(dá)量最大的組織出現(xiàn)在外套膜, 其次是消化腺(Fig.5A)。ALD-2同樣呈現(xiàn)組成型表達(dá)特征, 其相對(duì)表達(dá)量最大的組織是消化腺, 其次為外套膜(Fig.5A)。2種抗菌肽在后閉殼肌以及血細(xì)胞中表達(dá)量均較低。

Fig.5 Tissue specific expression, sex specific expression, and developmental stage specific expression of ALD-1 and ALD-2 in M.coruscus (A)Tissue-specific expression of ALD-1 and ALD-2;(B)The relative expression of ALD-1 and ALD-2 in gonad of male and female mussel, respectively;(C)The expression of ALD-1 and ALD-2 at different developmental stages of larval and adult mussel.The statistical analysis of differences was performed by SPSS(v25.0)with one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test.Differences were considered significant as P<0.05(n = 3).AD: Adductor muscle; DI: Digestive gland; FO: Foot; GI: Gill; GO: Gonad; HE: Hemocytes; MA: Mantle.F, female; M, male

進(jìn)一步的性別差異表達(dá)結(jié)果表明, 2種抗菌肽在雌性和雄性貽貝的性腺組織中表達(dá)模式不同, 其中ALD-1在雄性貽貝性腺組織中表達(dá)量要顯著高于雌性貽貝性腺(P<0.05,n=3)；而ALD-2則在雄性和雌性貽貝性腺中的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05,n=3)(Fig.5B)。ALD-1和ALD-2在貽貝幼蟲不同發(fā)育階段以及不同年齡階段的成年個(gè)體中, 具有不同的表達(dá)特征(Fig.5C)。2種ALD均表現(xiàn)為在幼蟲階段無(wú)表達(dá), 且在低齡(3月齡)貽貝中也未能檢測(cè)到表達(dá)；但是自6月齡開始, ALD-1和ALD-2均出現(xiàn)高表達(dá)(Fig.5C), 表明2種ALD在厚殼貽貝中主要負(fù)責(zé)成年貽貝的免疫防御。

2.3 厚殼貽貝節(jié)肢動(dòng)物防御素在不同組織對(duì)不同微生物刺激具有不同的免疫反應(yīng)模式

為進(jìn)一步分析ALD在厚殼貽貝免疫過程中的作用, 考慮到2種ALD均在外套膜組織有高表達(dá); 同時(shí), 盡管2種ALD在血細(xì)胞中表達(dá)量較低, 但是考慮到貽貝血細(xì)胞是其主要的免疫防御組織, 因此, 我們選擇外套膜和血細(xì)胞, 研究了2種ALD在不同微生物刺激下其表達(dá)量變化的時(shí)間曲線。所選用的微生物包括革蘭氏陽(yáng)性菌Staphylococcusaureus, 革蘭氏陰性菌Vibrioalginolyticus, 以及真菌Candidaalbicans, 研究結(jié)果見Fig.6。由Fig.6A可見, 在外套膜組織中, ALD-1對(duì)在真菌刺激下, 其相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.01), 其表達(dá)量峰值分別出現(xiàn)在0.5(2-△Ct值接近4)和24 h(2-△Ct值超過3)；革蘭氏陰性菌刺激也造成ALD-1在外套膜組織中的表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.01), 其表達(dá)量峰值出現(xiàn)在24 h(2-△Ct值約為7)；但是革蘭氏陽(yáng)性菌刺激對(duì)ALD-1的表達(dá)量影響較弱, 其表達(dá)量峰值出現(xiàn)在2 h(2-△Ct值約為1)(Fig.6A)。而在血細(xì)胞中, ALD-1表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的較強(qiáng)敏感性, 其表達(dá)量變化峰值出現(xiàn)在2和4 h, 2-△Ct值達(dá)到1.3；真菌和革蘭氏陰性菌刺激下, ALD-1也表現(xiàn)出明顯的表達(dá)量上調(diào), 其峰值出現(xiàn)在2 h, 但是2-△Ct值較低, 均未超過1(Fig.6B)。

ALD-2表現(xiàn)出與ALD-1不同的免疫反應(yīng)(Fig.6C, D)。在外套膜中, ALD-2表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的敏感性, 在革蘭氏陽(yáng)性菌刺激下, 其表達(dá)量在4 h達(dá)到峰值, 其2-△Ct值達(dá)到9；此外, 真菌刺激導(dǎo)致ALD-2的表達(dá)量在2 h達(dá)到峰值, 其2-△Ct值超過6；但是革蘭氏陰性菌刺激對(duì)ALD-2的影響相對(duì)較弱(Fig.6C)。而在血細(xì)胞中, ALD-2受真菌刺激影響較強(qiáng), 其表達(dá)量在2 h顯著上調(diào)(P<0.01), 且其高表達(dá)一直持續(xù)到48 h, 其2-△Ct值維持在1以上；而革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌對(duì)血細(xì)胞的ALD-2的表達(dá)影響相對(duì)較弱, 其2-△Ct值多在0.6以下。其中，革蘭氏陽(yáng)性菌刺激后, ALD-2在血細(xì)胞的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在4 h, 且持續(xù)到48 h；革蘭氏陰性菌刺激下, ALD-2在血細(xì)胞中的表達(dá)量在24 h出現(xiàn)峰值(Fig.6D)。

Fig.6 The relative expression level of ALD-1 and ALD-2 in hemocytes and mantle of Mytiluscoruscus, respectively, after infection with Staphylococcus aureus, Vibrio Parahemolyticus and Candida albicans (A)The relative expression level of ALD-1 in the mantle of post-infection;(B)The relative expression level of ALD-1 in the hemocytes of post-infection;(C)The relative expression level of ALD-2 in the mantle of post-infection;(D)The relative expression level of ALD-2 in the hemocytes of post-infection; The statistical analysis of differences was performed by SPSS(v25.0)with one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test.* and** represents the significance of the difference P<0.05 and P<0.01(n=3), respectively

2.4 采用固相化學(xué)合成手段成功獲得ALD-1和ALD-2

采用固相多肽合成策略, 完成對(duì)厚殼貽貝ALD-1和ALD-2的預(yù)測(cè)成熟肽區(qū)的化學(xué)合成。合成產(chǎn)物的純化與鑒定結(jié)果分別見Fig.7,8。由圖可見, ALD-1合成后經(jīng)高效液相色譜純化, 其純度達(dá)到90%以上; 質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明, 合成的ALD-1分子量為4 471.5, 與理論分子量(4 471.14)一致(Fig.7); 合成的ALD-2經(jīng)高效液相色譜純化, 其純度達(dá)到90%以上, 其質(zhì)譜鑒定分子量為4 688.4, 與理論分子量(4 688.4)一致(Fig.8)。上述結(jié)果表明, 厚殼貽貝ALD-1和ALD-2的預(yù)測(cè)成熟肽區(qū)合成成功, 可用于后續(xù)研究。

Fig.7 Purification of solid chemical synthesized ALD-1 by HPLC(A)and the mass spectrum of the fraction collected from HPLC elution(B) The synthesized peptide was purified by c8 reverse phase column(4.6×250 mm, 5 μm), and the mass of purified peptide was determined by a mass spectrometry.*indicates the eluted target peptide

Fig.8 Purification of solid chemical synthesized ALD-2 by HPLC(A)and the mass spectrum of the fraction collected from HPLC elution(B) The synthesized peptide was purified by c8 reverse phase column(4.6×250 mm, 5 μm), and the mass of purified peptide was determined by a mass spectrometry.*indicates the eluted target peptide

2.5 化學(xué)合成的ALD-1和ALD-2具有明顯抑菌活性

對(duì)合成后的厚殼貽貝ALD-1和ALD-2分子進(jìn)行氧化復(fù)性；復(fù)性后的ALD分子經(jīng)高效液相色譜脫鹽及純化, 并開展抑菌活性實(shí)驗(yàn), 結(jié)果見Fig.9。由圖可見, 合成的ALD-1和ALD-2在0.1 mmol/L濃度下, 對(duì)所測(cè)試的微生物均表現(xiàn)出抑菌活性。其中, ALD-1對(duì)S.aureus的抑制率較高, 達(dá)到70%以上。但對(duì)S.lutea,E.coli和B.megaterium抑制率較低, 僅為20%～40 %; ALD-2則對(duì)V.parahaemolyticus的抑制率較高(80%以上), 但對(duì)E.coli,S.lutea和B.megaterium的抑制率較低(小于50%)。

Fig.9 The antimicrobial activities of chemical synthesized and refolded ALD-1 and ALD-2 The antimicrobial activity was calculated based on the OD630 value of microbes in control and experiment group.The statistical analysis of differences was performed by SPSS(v25.0)with one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test.* and** represents the significance of the difference P<0.05 and P<0.01(n=3), respectively

3 討論

貽貝因其豐富的抗菌肽家族及表現(xiàn)出來(lái)的極強(qiáng)的抗菌肽分子多樣性, 不僅賦予了貽貝具有較強(qiáng)的疾病耐受性, 也使得貽貝成為新型生物抗生素研發(fā)的重要來(lái)源物種。隨著組學(xué)技術(shù)的進(jìn)展以及厚殼貽貝基因組序列和多種組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的公布,厚殼貽貝已成為新型抗菌肽篩選的重要物種。ALD是一類貽貝中新發(fā)現(xiàn)的與節(jié)肢動(dòng)物防御素相似的抗菌肽分子。此前已從地中海貽貝的轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)了ALD的序列[7], 但是對(duì)貽貝ALD的分子特性及其在貽貝免疫過程中的作用和機(jī)制尚不清楚。為此, 本文對(duì)厚殼貽貝中篩選到的2種ALD開展了表達(dá)譜、多肽合成及功能驗(yàn)證分析。

從厚殼貽貝ALD-1和ALD-2的序列及結(jié)構(gòu)來(lái)看, 2種ALD均表現(xiàn)出與節(jié)肢動(dòng)物防御素相似的特征, 包括半胱氨酸的分布、結(jié)構(gòu)域特征以及三級(jí)結(jié)構(gòu)特征等, 表明軟體動(dòng)物與節(jié)肢動(dòng)物在抗菌肽分子起源上可能具有某種保守性。早期人們已發(fā)現(xiàn), 軟體動(dòng)物防御素和節(jié)肢動(dòng)物防御素在氨基酸序列, 二硫鍵配對(duì)模式, 抗菌機(jī)制以及抗菌譜等方面具有較大相似性, 但兩者在前體序列架構(gòu)上具有明顯差異[39]。例如, 已報(bào)道的貽貝防御素MGD(Mytilusgalloprovincalisdefensin)分子前體序列中, 其成熟肽區(qū)下游存在一段成熟肽后區(qū)域, 及所謂Pro-region[40]；而節(jié)肢動(dòng)物防御素的后區(qū)域通常出現(xiàn)在信號(hào)肽與成熟肽之間[41]。厚殼貽貝ALD-1在序列中存在可預(yù)測(cè)的一段后區(qū)域, 且位于序列的信號(hào)肽和成熟肽之間, 這一點(diǎn)與節(jié)肢動(dòng)物防御素類似；而ALD-2則無(wú)可預(yù)測(cè)的后區(qū)域(Fig.1), 表明ALD-2與節(jié)肢動(dòng)物防御素在序列結(jié)構(gòu)上存在差異。此外, 軟體動(dòng)物防御素和節(jié)肢動(dòng)物防御素在基因內(nèi)含子的數(shù)量和分布方面也存在差異[39]。表明軟體動(dòng)物與節(jié)肢動(dòng)物在其物種進(jìn)化過程中, 其防御素分子也在協(xié)同進(jìn)化。

厚殼貽貝2種ALD分子的表達(dá)譜的結(jié)果顯示, 2種ALD均在外套膜和消化腺具有較高表達(dá)量, 但在血細(xì)胞中表達(dá)量較低(Fig.5)。從以往的研究表明, 多數(shù)已報(bào)道的貽貝抗菌肽, 其主要表達(dá)部位在于血細(xì)胞[7], 因而貽貝血細(xì)胞被認(rèn)為是貽貝免疫防御的主要組織[42]。但有研究表明, 部分貽貝抗菌肽的主要表達(dá)部位并非血細(xì)胞, 而是其他組織。例如, 貽貝抗菌肽big defensin和mytimacin的表達(dá)量主要出現(xiàn)在鰓、消化腺和外套膜[43]; 貽貝抗菌肽myticalin的最大表達(dá)部位出現(xiàn)在外套膜[44]; 而貽貝抗菌肽mytichitin的最大表達(dá)部位是性腺[21]。上述結(jié)果表明, 貽貝不同組織可能有其特異的抗菌肽表達(dá)譜, 以滿足不同組織在應(yīng)對(duì)外來(lái)入侵微生物過程中的特殊需求。厚殼貽貝ALD分子在外套膜和消化腺組織的高表達(dá), 意味著這2種防御素可能參與了貽貝外套膜及消化腺的免疫防御。但是2種ALD在血細(xì)胞中的較低表達(dá)量并不意味著其在貽貝血細(xì)胞中不發(fā)揮免疫作用。事實(shí)上, 部分貽貝抗菌肽即使在血細(xì)胞中表達(dá)量不高, 但是在微生物刺激下, 其表達(dá)量也會(huì)出現(xiàn)明顯上調(diào)并參與到免疫防御過程[43, 44]。

值得注意的是, ALD-1在雄性貽貝性腺中的表達(dá)量明顯高于雌性貽貝性腺(Fig.5), 表明ALD-1可能具有性別表達(dá)特異性特征。這也是首次發(fā)現(xiàn)貽貝抗菌肽具有性別差異表達(dá)。以往的研究表明, 部分節(jié)肢動(dòng)物抗菌肽分子會(huì)表現(xiàn)出明顯的性別差異, 特別是在雄性個(gè)體中表達(dá)量較大[45-47]。ALD-1在雄性性腺中的較高表達(dá)量推測(cè)與其在貽貝生殖過程中, 對(duì)雄性配子發(fā)育以及排精過程中對(duì)于性腺的免疫保護(hù)有關(guān)。此外, ALD-1和ALD-2在貽貝幼蟲的不同發(fā)育階段均未檢測(cè)到其表達(dá)。但在成年貝中, 特別是6月齡及以后的貽貝個(gè)體中出現(xiàn)高表達(dá)。這表明，2種ALD在厚殼貽貝中主要是負(fù)責(zé)成年個(gè)體的免疫保護(hù)。以往的研究表明, 多數(shù)貽貝抗菌肽均表現(xiàn)為幼蟲階段的低表達(dá)以及稚貝期后的高表達(dá)[48,49], 這表明，多數(shù)貽貝抗菌肽的表達(dá)具有明顯的發(fā)育階段特異性。其在貽貝幼蟲階段的低表達(dá)也被認(rèn)為是貽貝幼蟲容易感染疾病而死亡的重要因素[48]。

考慮到2種ALD分子在厚殼貽貝外套膜中的高表達(dá)量, 以及血細(xì)胞在貽貝免疫過程中的重要作用, 本文選擇了外套膜和血細(xì)胞2種組織研究ALD分子在微生物刺激條件下的表達(dá)量變化。同時(shí), 考慮到以往研究中, 貽貝對(duì)不同微生物具有不同的免疫特征, 本文分別選取了革蘭氏陽(yáng)性菌, 革蘭氏陰性菌以及真菌作為刺激條件。從研究結(jié)果來(lái)看, 2種厚殼貽貝ALD均表現(xiàn)為在不同組織經(jīng)過不同微生物誘導(dǎo)后, 具有不同的免疫反應(yīng)特征(Fig.6)。首先, 本文注意到不同微生物刺激下, 2種ALD在不同組織中均出現(xiàn)表達(dá)量的明顯上升, 表明2種ALD分子均參與了厚殼貽貝的免疫過程。但是，2種ALD在不同組織中對(duì)不同微生物表現(xiàn)出的敏感性以及反應(yīng)時(shí)間各不相同。其中, ALD-1在外套膜中表現(xiàn)為對(duì)真菌和對(duì)革蘭氏陰性菌的較強(qiáng)敏感性, 而在血細(xì)胞中表現(xiàn)為對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌刺激的較強(qiáng)敏感性(Fig.6)；且ALD-1在血細(xì)胞中反應(yīng)速度比在外套膜中相對(duì)更快, 其峰值出現(xiàn)的時(shí)間在血細(xì)胞中為2 h, 而在外套膜中表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間多為24 h(Fig.6)；而對(duì)ALD-2而言, 其在外套膜中表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的較強(qiáng)敏感性, 在血細(xì)胞中表現(xiàn)為對(duì)真菌的較強(qiáng)敏感性(Fig.6)。上述結(jié)果充分表明, 不同的抗菌肽在貽貝組織以及不同微生物刺激下其差異化的免疫反應(yīng)模式。該模式推測(cè)可能與抗菌肽具有不同的免疫識(shí)別和免疫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制有關(guān)。例如, 在節(jié)肢動(dòng)物防御素研究中, 人們發(fā)現(xiàn)，具抗真菌活性的防御素的表達(dá)受到Toll 信號(hào)通路的調(diào)控,而其他防御素的表達(dá)則受到免疫缺陷(immune deficiency, IMD)信號(hào)通路的調(diào)控[50]。貽貝中目前已被證實(shí)存在多種與免疫相關(guān)的信號(hào)通路[51,52], 但其與貽貝抗菌肽表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)目前尚不清楚。我們推測(cè), ALD-1和ALD-2在不同微生物刺激下, 其在不同組織中不同的表達(dá)模式可能與其表達(dá)調(diào)控的信號(hào)通路的不同有關(guān), 但該推測(cè)還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本文的研究結(jié)果表明, ALD-1和ALD-2在貽貝各組織的相對(duì)表達(dá)量均較低, 意味著2種抗菌肽在貽貝體內(nèi)的含量也極低。本文嘗試從貽貝血清中純化2種抗菌肽, 但均未成功。因此, 本文根據(jù)ALD的預(yù)測(cè)成熟肽序列, 采用固相多肽合成技術(shù)獲得2種ALD的多肽分子, 經(jīng)氧化復(fù)性后開展了其抑菌活性分析。結(jié)果表明, 2種厚殼貽貝ALD分子均表現(xiàn)出明顯的、廣譜的抑菌活性。且兩者的抑菌譜類似，但ALD-1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抑制率, 而ALD-2對(duì)革蘭氏陰性菌V.parahaemolyticus表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抑制率。這表明2種ALD分子可能在免疫識(shí)別及機(jī)制方面存在差異。與以往報(bào)道的天然貽貝抗菌肽的抑菌活性相比, 2種合成后的ALD分子的抑菌活性并不強(qiáng)。目前多數(shù)已報(bào)道的貽貝抗菌肽在抑菌活性的濃度范圍均在微摩爾級(jí)別[53], 而2種合成的ALD分子在本次研究中, 其對(duì)微生物的抑制率在毫摩爾水平下僅具有相對(duì)較弱的抑制活性, 推測(cè)與ALD合成及復(fù)性過程中其二硫鍵的折疊困難有關(guān)。目前, 對(duì)貽貝抗菌肽的固相化學(xué)合成策略, 其最大的困難在于貽貝抗菌肽通常含有多對(duì)二硫鍵, 因此合成后的抗菌肽分子的復(fù)性成功率較低, 因而導(dǎo)致其活性較天然的抗菌肽分子有所下降[54]。

綜上所述, 對(duì)厚殼貽貝中新發(fā)現(xiàn)的2種新型防御素, ALD-1和ALD-2, 開展了序列分析, 表達(dá)譜分析以及功能驗(yàn)證。該研究初步探明了2種ALD分子在貽貝免疫防御過程中的作用, 進(jìn)一步拓展了對(duì)貽貝抗菌肽分子多樣性的科學(xué)認(rèn)知。同時(shí), 也為后續(xù)深入研究貽貝抗菌肽的分子機(jī)制, 以及在此基礎(chǔ)上開發(fā)貽貝抗菌肽為來(lái)源的新型生物抗生素奠定了基礎(chǔ)。