化痰祛濕活血方對非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型肝細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

劉素彤， 張麗慧， 顧亞嬌， 劉鳴昊， 郭 敏， 趙晨露， 趙文霞

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000

隨著肥胖的流行和代謝綜合征(MetS)患病率的迅速增長,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為健康體檢肝臟生化指標(biāo)異常的首要原因[1]。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是臨床干預(yù)的關(guān)鍵節(jié)點，若此階段未加干預(yù)，有進(jìn)展成肝纖維化、肝硬化的風(fēng)險。目前,尚無治療NASH的特效藥物?；奠顫窕钛绞侨珖嗅t(yī)趙文霞教授的經(jīng)驗方，其治療NASH臨床療效確切[2]，前期動物實驗[3-5]表明，化痰祛濕活血方可降低NASH大鼠肝酶、調(diào)節(jié)脂代謝、提高肝臟抗氧化能力，抑制炎癥反應(yīng)，防止肝細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡。但尚缺乏以線粒體超微結(jié)構(gòu)為切入點，探討其作用機制的研究。因此本研究將以高脂飼料誘導(dǎo)NASH大鼠模型，以臨床常用藥易善復(fù)為陽性對照藥。透射電鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，探索化痰祛濕活血方在亞細(xì)胞水平上的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠48只，SPF級，體質(zhì)量(150±10) g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物合格證號：11400700116588；許可證號：SXYK(豫) 2015-0005。

1.2 實驗藥物 化痰祛濕活血方顆粒劑: 澤瀉，批號: 15120135; 丹參，批號: 15060138; 海藻，批號: 15070027; 郁金，批號: 15060128; 決明子，批號: 15090036; 山楂，批號: 15060020；柴胡，批號: 15070208；水飛薊，批號: 15070223; 由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供。多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復(fù)): 賽諾菲( 北京) 制藥有限公司，批號: 5JD070。

1.3 主要試劑與儀器 高脂飼料: 普通飼料(84%)、豬油(10%) 、蛋黃粉(5%) 、膽固醇(1%) 。飼料由河南省實驗動物中心加工而成。透射電鏡(FEI，美國)，倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯，日本)

1.4 分組、造模及給藥 48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，第2周分組并開始造模及給藥。大鼠隨機分為空白組，模型組，易善復(fù)組，化痰祛濕活血方組(簡稱中藥組)，每組12只。空白組給予普通飼料，另外3組給予高脂飼料。依據(jù)人與動物劑量折算法：化痰祛濕活血方等效劑量為1.26 g/100 g體質(zhì)量，多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復(fù))等效劑量為0.014 18 g/100 g體質(zhì)量。模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液，易善復(fù)組灌胃多烯磷脂酰膽堿混懸液，中藥組給予灌胃化痰祛濕活血方顆粒混懸液，1次/d，連續(xù)10周。

1.5 透射電子顯微鏡觀察各組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及定量分析 實驗步驟：灌胃10周結(jié)束后，用電子秤稱取鼠重，大鼠予10%水合氯醛麻醉，迅速取出各組肝組織，修成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，置于4℃，2.5%的戊二醛固定，4℃、1%鋨酸后固定。以乙醇及丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成1 μm厚的半薄片，用鉆石刀切制成70 nm厚的超薄切片，鈾鉛染色后透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體形態(tài)數(shù)量及其他細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)。定量分析：采用國際上通用的細(xì)胞立體計量學(xué)點分析法，對實驗各組選擇2只動物，每只動物取3塊肝組織，每塊組織觀察5個細(xì)胞進(jìn)行定量測定，測定肝細(xì)胞內(nèi)脂滴和線粒體的指標(biāo)為體密度。

2 結(jié)果

2.1 化痰祛濕活血方對肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 空白組表現(xiàn) 電鏡下可見大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核較大居中，核膜完整，核仁清晰，胞內(nèi)有大量豐富的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高倍鏡下可見結(jié)構(gòu)清晰完整的線粒體及大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖1)。

2.1.2 模型組表現(xiàn) 低倍鏡下可見模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴積累，占細(xì)胞面積1/2～2/3，部分肝細(xì)胞核被脂滴擠壓變形或擠向細(xì)胞邊緣。線粒體較正常組體積增大，脂滴與線粒體互相擠壓；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少。高倍鏡下可見線粒體周圍圍繞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯少于正常組，結(jié)構(gòu)不清晰；線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，雙層膜模糊或消失，與胞質(zhì)分界不清晰；線粒體嵴排列紊亂或數(shù)量減少(圖2)。

注：a，空白組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常(×5000)，箭頭為脂滴；b，放大倍數(shù)后可見清晰完整線粒體及大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(×50 000)，箭頭為線粒體。

注：a,模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)大量脂滴積累(×2500)，箭頭為脂滴;b, 放大倍數(shù)后可見線粒體結(jié)構(gòu)破壞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少(×50 000)， 箭頭為線粒體。圖2 電鏡下模型組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Figure 2 Ultrastructure of rat liver cells in model groupunder electron microscope

2.1.3 中藥組表現(xiàn) 低倍鏡下可見細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積較模型組明顯減少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組增多，且結(jié)構(gòu)較清晰。高倍鏡下可見線粒體形態(tài)明顯較模型組好轉(zhuǎn)，雙層膜結(jié)構(gòu)較完整(圖3)。

注：a，中藥組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少(×2500)；b，放大倍數(shù)后可見線粒體膜較完整(×50 000)，箭頭為線粒體。

2.1.4 易善復(fù)組表現(xiàn) 低倍鏡下可見大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，數(shù)量較模型組減少，占細(xì)胞面積1/3 以下；線粒體數(shù)量較模型組明顯增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體結(jié)構(gòu)清晰。 高倍鏡下可見大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，雙層膜清晰，線粒體嵴排列整齊，少數(shù)線粒體雙層膜破壞，或雙層膜結(jié)構(gòu)完整，但線粒體嵴被破壞(圖4)。

2.2 化痰祛濕活血方對大鼠肝細(xì)胞線粒體影響的定量分析 與空白組相比，模型組脂滴面積明顯增多，線粒體減少，體密度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01) ；藥物干預(yù)后，易善復(fù)組脂滴面積減少、線粒體數(shù)目增多，與模型組體密度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)；中藥組較易善復(fù)組脂滴面積減少更多、線粒體數(shù)目明顯增加，體密度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

注：a,對照組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴減少(×2500)，箭頭為脂滴;b，放大倍數(shù)后可見線粒體結(jié)構(gòu)較完整(×50 000)，箭頭為線粒體。

表1 各組大鼠脂滴和線粒體體密度比較Table 1 Lipid droplet and mitochondrial body densitywere compared in each group

3 討論

線粒體是肝臟脂肪酸β氧化最主要的細(xì)胞器。非酒精性脂肪性肝病初期肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，誘發(fā)脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)大量游離脂肪酸轉(zhuǎn)變成脂酰輔酶A，然后進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化[6]。脂質(zhì)貯積增多，肝臟對游離脂肪酸攝取的增加使線粒體β氧化速度代償性增加，進(jìn)而增加活性氧(ROS)的產(chǎn)出，當(dāng)超過抗氧化物質(zhì)的清除能力導(dǎo)致ROS蓄積時，此時ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多聚不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)反應(yīng)形成有毒的脂質(zhì)，從而使線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，并破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，引發(fā)肝細(xì)胞程序性死亡，通過亞致死性和致死性應(yīng)激效應(yīng)引起肝細(xì)胞的損傷。因此，維持肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量、功能的正常，在NASH治療中不可忽視。

NASH病因與飲食不節(jié)、形體肥胖、多臥少動密切相關(guān)，脾氣虧虛，運化失職致肝失條達(dá)、痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)是本病的主要病機[7]?；颊哌^食肥甘厚味、勞逸失度、情志失調(diào)，導(dǎo)致肝失疏泄、脾失健運，脾胃運化失職，水濕內(nèi)停，濕煉為痰，痰阻氣機，氣滯血瘀，“濕、痰、瘀”交阻肝絡(luò)而發(fā)病。探索“痰濕瘀”的病理生理物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步闡明針對痰、濕、瘀的“化痰祛濕活血”干預(yù)NASH形成的微觀聯(lián)系具有重要意義。

筆者依據(jù)NASH“痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)、肝失條達(dá)”的主要病機創(chuàng)立了化痰祛濕活血方(澤瀉、丹參、郁金、海藻、決明子、山楂、水飛薊、柴胡)。前期研究[8]已證實化痰祛濕活血方可顯著降低NASH患者血清ALT、胰島素抵抗，提高肝/脾CT值，降低甘油三酯、BMI，改善臨床癥狀方面均明顯優(yōu)于對照組。同時筆者的基礎(chǔ)研究[3,5]也發(fā)現(xiàn)，化痰祛濕活血方能夠降低NASH模型大鼠相關(guān)炎癥因子、氧化應(yīng)激因子，從而改善肝組織炎癥損傷及肝纖維化程度，具有良好的抗NASH作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，電鏡下模型組的肝細(xì)胞線粒體形態(tài)較正常組大，定量分析發(fā)現(xiàn)線粒體體密度減少，說明氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞器水腫。 經(jīng)化痰祛濕活血方干預(yù)后，線粒體數(shù)量增加，形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，腫脹減輕或消失，雙層膜結(jié)構(gòu)較完整，膜密度增加。說明化痰祛濕活血方有減輕線粒體腫脹、改善線粒體膜通透性、恢復(fù)線粒體形態(tài)的作用。 經(jīng)過化痰祛濕活血方干預(yù)后，NASH大鼠肝臟內(nèi)脂滴明顯減少，提示該方可能通過減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積來降低胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減輕線粒體功能的損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)化痰祛濕活血方組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組明顯增多，分布廣泛，提示本方有改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、增加其數(shù)量和改善其結(jié)構(gòu)的功能和作用。 易善復(fù)可以增加膜穩(wěn)定性，修復(fù)膜功能抗脂質(zhì)過氧化的作用，臨床常用于治療非酒精性脂肪性肝病。 本研究發(fā)現(xiàn)，易善復(fù)組大鼠脂滴數(shù)量較模型組減少，線粒體數(shù)量較模型組明顯增多，大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，雙層膜清晰，線粒體嵴排列整齊，少數(shù)線粒體膜結(jié)構(gòu)破壞。提示在使用化痰祛濕活血方同時可以結(jié)合現(xiàn)代藥理研究增加有修復(fù)生物膜作用的藥物，以提高療效。

綜上所述，本研究從亞細(xì)胞水平觀察了化痰祛濕活血方對肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為中醫(yī)藥防治NASH的機制研究提供了實驗依據(jù)。后續(xù)還會開展針對線粒體損害導(dǎo)致的細(xì)胞程序性死亡方面探究化痰祛濕活血方的作用靶點，為該方的臨床使用提供更多實驗證據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2016年7月經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學(xué)審批，批號: DWLL15010018，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則，通過河南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理審查。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙文霞負(fù)責(zé)課題設(shè)計；劉素彤負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；張麗慧參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉鳴昊負(fù)責(zé)擬定寫作思路；顧亞嬌、郭敏、趙晨露負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。