戊糖片球菌YF-8對溫和氣單胞菌毒力因子及生物膜的影響

呂欣然，崔曉玲，杜 宏，夏文敬，白鳳翎*，勵建榮，2，王明麗

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧錦州 121013 2 大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116034 3 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺 265600）

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是一種細(xì)胞間獨特的通信方式，即微生物能夠通過群體依賴的方式分泌化學(xué)自誘導(dǎo)劑來進(jìn)行通信并調(diào)控其行為和活性。細(xì)菌在低濃度時開始分泌信號分子，當(dāng)其積累到一定濃度后便與受體蛋白相結(jié)合，啟動相關(guān)下游基因的表達(dá)。這個過程由N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類（N-Acylated homoserine lactones，AHLs）合成酶（LuxI 型家族蛋白）和AHLs 受體（LuxR 型家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白）調(diào)控[1]。群體感應(yīng)系統(tǒng)主要參與調(diào)控生物膜的形成，生物發(fā)光，色素和抗生素的產(chǎn)生以及毒力因子的形成等。

溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）的QS 調(diào)控系統(tǒng)為LuxI/R 型，產(chǎn)生的信號分子為AHLs 類，主要包括N-辛?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-Octanoyl-L-homoserine lactone，C8-HSL）和N-癸?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯 （N-Decanoyl-L-homoserine lactone，C10-HSL）等，其生物膜的形成以及胞外蛋白酶、胞外多糖、嗜鐵素等致腐因子的產(chǎn)生均與QS系統(tǒng)密切相關(guān)。尋找一種能夠有效淬滅溫和氣單胞菌QS 的活性物質(zhì)，成為解決其致腐能力的新途徑。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有AHLs 淬滅能力的細(xì)菌和真菌。Pattnaik 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，真菌大豆莖潰瘍菌（Diaporthe phaseolorum）SSP12 的次生代謝產(chǎn)物在750 μg/mL 的質(zhì)量濃度下能夠顯著抑制銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）PAO1 由LasI/R系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白酶LasA、彈性蛋白酶LasB、幾丁質(zhì)酶、胞外多糖和鼠李糖脂及生物膜的形成。Torres 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，極地寡單胞菌（Alteromonas stellipolaris）PQQ-42 與弧菌體外共培養(yǎng)時，可有效減少弧菌AHLs 的積累，降低其蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生，并抑制其群集和泳動的能力。

乳酸菌因安全、綠色、高效的特點而被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。研究表明，乳酸菌來源的苯乳酸、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物可通過抑制AHLs 合成，競爭性抑制AHLs 與受體蛋白結(jié)合，使AHLs 失活等作用方式干擾細(xì)菌QS 系統(tǒng)[4]。課題組前期篩選獲得1 株對溫和氣單胞菌AHLs 具有淬滅作用的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）YF-8，其乙酸乙酯粗提物在2.0，4.0 mg/mL 和6.0 mg/mL 3 個亞最小抑菌濃度（Subminimal inhibitory concentration，sub-MIC）下不影響溫和氣單胞菌的正常生長。

本文從細(xì)胞水平探究戊糖片球菌YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌蛋白酶、胞外多糖、嗜鐵素、溶血性、運動能力等致腐因子的影響。采用結(jié)晶紫染色法和掃描電鏡技術(shù)分析YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜形成的抑制作用及對已有生物膜的清除作用。從分子水平研究YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌QS 調(diào)控基因的影響，以期為控制由溫和氣單胞菌導(dǎo)致的水產(chǎn)品腐敗及病害提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及其來源 乳酸菌菌株：戊糖片球菌YF-8，分離自遼寧朝陽泡菜；目標(biāo)菌株：溫和氣單胞菌，分離自腐敗大菱鲆體表。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 MRS 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、平板計數(shù)（PCA）培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基、血瓊脂基本培養(yǎng)基、無菌脫纖維羊血，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌總RNA 快速抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 引物，上海生工生物工程有限公司；2.5%戊二醛，北京索萊寶科技有限公司；鉻天青，天津市科密歐化學(xué)試劑科技有限公司；溴化十六烷基三甲銨，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇，山東普利斯化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LHG-3 超級潔凈工作臺，青島翌宏儀器有限公司；MHP-500HE 生化培養(yǎng)箱，常州梅香儀器；TGL20M 高速冷凍離心機(jī)，常州金壇良友儀器有限公司；Czone5F 全自動菌落計數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；ReadMax 1900Plus 酶標(biāo)儀，上海閃普生物科技有限公司；752N 紫外-可見分光光度計，鑫貝西科學(xué)儀器有限公司；DED-2M 顯微鏡，康華瑞明科技有限公司；S-4800 掃描電鏡，日本日立公司；QuantGene 9600 實時熒光定量PCR 分析儀，杭州博日科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 YF-8 乙酸乙酯粗提物的制備 參照孫夢桐等[5]的方法制備乳酸菌無細(xì)胞上清液，將100 mL 上清液倒入分液漏斗中，加入20 mL 乙酸乙酯充分混勻，靜置萃取5 min，待分層后收集乳化層，重復(fù)此步驟5 次。將萃取液于50 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙酸乙酯氣味，收集殘留液，真空冷凍干燥成粉末，置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌蛋白酶的影響 采用瓊脂平板擴(kuò)散法檢測蛋白酶活性。取10 μL YF-8 粗提物分別添加到1 mL 溫和氣單胞菌培養(yǎng)物中，使粗提物終質(zhì)量濃度為2.0，4.0 mg/mL和6.0 mg/mL，于30 ℃共培養(yǎng)24 h 后，將共培養(yǎng)物于4 ℃，8 000 r/min 下離心5 min，收集上清液。同時以MRS 肉湯組為對照組。

在擺有牛津杯的素瓊脂平板中倒入酪蛋白培養(yǎng)基，冷卻后將牛津杯取出，在孔內(nèi)加入180 μL共培養(yǎng)物上清液，30 ℃下培養(yǎng)24 h，使用菌落計數(shù)儀測量水解圈的直徑。YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌蛋白酶的抑制率按式（1）計算：

式中，dc——對照組水解圈直徑，mm；dQSI——-YF-8 處理組水解圈直徑，mm。

1.3.3 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌胞外多糖的影響 采用苯酚硫酸法測定胞外多糖的含量。按1.3.2 節(jié)方法制備YF-8 粗提物和溫和氣單胞菌的共培養(yǎng)物，將其以10 000 r/min 離心15 min，獲得的沉淀重懸于0.5 mL 0.85%生理鹽水中，然后在相同條件下繼續(xù)離心30 min，獲得的上清液與冷乙醇（100%）以體積比1∶3 的比例混合，4 ℃條件下過夜沉淀。將沉淀的胞外多糖加入到濃硫酸和冷酚的混合液中，并在波長490 nm 處測量溶液的吸光度值。胞外多糖的抑制率按式（2）計算：

式中，ODc——對照組OD490nm值；ODQSI——YF-8 處理組OD490nm值。

1.3.4 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌嗜鐵素的影響 采用瓊脂平板擴(kuò)散法測定嗜鐵素含量。按1.3.2 節(jié)方法制備YF-8 粗提物和溫和氣單胞菌的共培養(yǎng)物上清液，依據(jù)李婷婷等[6]的方法配制CASAD 嗜鐵素檢測培養(yǎng)基，將其倒入擺有牛津杯的素瓊脂平板中，冷卻后將牛津杯取出，在孔內(nèi)加入180 μL 共培養(yǎng)物，30 ℃下培養(yǎng)24 h，使用菌落計數(shù)儀測量黃色暈圈的直徑。嗜鐵素的抑制率按式（1）計算。

1.3.5 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌溶血性的影響 采用瓊脂平板擴(kuò)散法檢測溶血性。按1.3.2 節(jié)方法制備YF-8 粗提物和溫和氣單胞菌的共培養(yǎng)物上清液，將含5%無菌除顫羊血的LB 培養(yǎng)基倒入擺有牛津杯的素瓊脂平板中，在孔內(nèi)加入180 μL 共培養(yǎng)物上，30 ℃下培養(yǎng)24 h，使用菌落計數(shù)儀測量溶血圈的直徑。溶血性的抑制率按式（1）計算。

1.3.6 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌運動能力的影響 采用Gutierrez-Pacheco 等[7]的方法測定運動能力。取1 mL YF-8 粗提物分別添加到群集培養(yǎng)基（0.5% NaCl、0.6%瓊脂、0.5%葡萄糖和1%蛋白胨）和泳動培養(yǎng)基（0.5% NaCl、0.3%瓊脂和1%胰蛋白胨）中，使粗提物終質(zhì)量濃度為2.0，4.0 mg/mL 和6.0 mg/mL，混勻后倒板，待其凝固后將5 μL 溫和氣單胞菌的過夜培養(yǎng)物點樣于平板的中央。于30 ℃培養(yǎng)24 h 后，使用菌落計數(shù)儀測量溫和氣單胞菌遷移的直徑，以MRS 肉湯組為對照組。遷移抑制率按式（1）計算。

1.3.7 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的抑制和清除定量分析

1.3.7.1 生物膜抑制 采用結(jié)晶紫染色法測定。將YF-8 粗提物添加到含溫和氣單胞菌的LB 肉湯中，使粗提物終質(zhì)量濃度分別為2.0，4.0 mg/mL和6.0 mg/mL，于30 ℃培養(yǎng)24 h 后，移除孔中的懸浮液，用PBS（pH 7.2）沖洗孔3～5 次，每個孔添加100 μL 結(jié)晶紫（0.4%）染色20 min，最后用無菌水緩慢沖洗至孔內(nèi)無明顯紫色。將96 孔板置于干燥箱中干燥10～15 min，在每個孔內(nèi)加入200 μL 95%乙醇溶液，使用酶標(biāo)儀測量波長595 nm 處的OD 值。

1.3.7.2 生物膜清除 在含有200 μL LB 肉湯的96 孔板中加入2 μL 溫和氣單胞菌過夜培養(yǎng)物，于30 ℃培養(yǎng)24 h 后，吸出孔中的懸浮液用于浮游細(xì)胞的存活測定，用PBS（pH 7.2）沖洗孔3～5 次。向孔內(nèi)添加200 μL 含有YF-8 粗提物的新鮮LB肉湯，使粗提物終質(zhì)量濃度分別為2.0，4.0 mg/mL和6.0 mg/mL，于30 ℃培養(yǎng)72 h 后，使用結(jié)晶紫染色法定量分析。

1.3.7.3 對浮游細(xì)胞的影響 采用平板計數(shù)法檢測浮游細(xì)胞的存活率。取100 μL 生物膜清除中的懸浮液，8 000 r/min 離心5 min，將沉淀用0.85%的生理鹽水溶液重懸后10 倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度進(jìn)行涂布，于30 ℃培養(yǎng)48 h 后，測定浮游細(xì)胞存活數(shù)目。

1.3.8 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響 在24 孔板中放入預(yù)先制好的無菌載玻片（1 cm×1 cm），按1.3.7.1 節(jié)或1.3.7.2 節(jié)方法用YF-8 粗提物抑制或清除溫和氣單胞菌生物膜。YF-8 粗提物處理完成后移除孔中懸浮液，用PBS（pH 7.2）沖洗載玻片3～5 次。

1.3.8.1 光學(xué)顯微鏡 添加500 μL 結(jié)晶紫（0.4%）染色20 min，用無菌水緩慢沖洗至載玻片上無明顯紫色。置于干燥箱中干燥固定10～15 min 后，通過油鏡觀察載玻片上生物膜結(jié)構(gòu)。

1.3.8.2 掃描電鏡 用2.5%的戊二醛溶液固定生物膜12 h。用無菌水洗去殘留的戊二醛，再用不同梯度（40%，70%，90%，100%）乙醇依次脫水處理各15 min，真空干燥后噴金，掃描電鏡觀察。

1.3.9 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌QS 調(diào)控基因的影響 將YF-8 粗提物添加至溫和氣單胞菌的過夜培養(yǎng)物中，使粗提物終質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL，于30 ℃培養(yǎng)24 h 后，8 000 r/min 離心5 min，棄上清，收集菌體，用0.02 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2） 洗滌菌體3 次，收集菌體，采用RNA 抽提試劑盒提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

利用定量實時聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測QS 調(diào)控基因LuxI/LuxR 表達(dá)量的變化，引物序列如表1所示。反應(yīng)體系（20 μL）：包含10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，4 μL 超純水，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，5 μL cDNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，30 min；95 ℃，10 s；55 ℃，20 s；72℃，20 s；75 ℃停留5 s 收集熒光信號，反應(yīng)共進(jìn)行40 個循環(huán)[8]。以溫和氣單胞菌16S rRNA 為內(nèi)參基因，基因表達(dá)差異依據(jù)2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Sequences of primers used for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每項試驗重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 8.0 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌蛋白酶的影響

溫和氣單胞菌可以產(chǎn)生豐富的胞外蛋白酶，這些蛋白酶水解能力很強(qiáng)，能夠使水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)分解，從而促進(jìn)其自身的生長繁殖，并導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗[9]。3 個sub-MICs 的YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌蛋白酶的影響如圖1a 所示。從圖中可以看出，隨著YF-8 粗提物質(zhì)量濃度的升高，其對溫和氣單胞菌蛋白酶的抑制作用也隨之增強(qiáng)，且具有質(zhì)量濃度依賴性。當(dāng)YF-8 粗提物質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL 時，抑制作用最強(qiáng)，抑制率為32.72%。表明YF-8 粗提物在3 個sub-MICs 下對溫和氣單胞菌蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用。

圖1 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌蛋白酶（a）、胞外多糖（b）、嗜鐵素（c）和溶血性（d）的影響Fig.1 Effects of YF-8 crude extract on protease （a），extracellular polysaccharide （b），siderophore （c） and hemolysis （d） of A.sobria

2.2 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌胞外多糖的影響

胞外多糖在黏附宿主的過程中起著重要的作用，有利于腐敗菌或致病菌生物膜的形成及發(fā)育[10]。抑制細(xì)菌胞外多糖的分泌可以一定程度上降低細(xì)菌對宿主的傷害。從圖1b 中可以看出，溫和氣單胞菌的胞外多糖分泌會受到Y(jié)F-8 粗提物的干擾，且質(zhì)量濃度越高，干擾作用越強(qiáng)。當(dāng)粗提物質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL 時，其胞外多糖的分泌量比對照組降低了58.09%，干擾作用最強(qiáng)，表明YF-8 粗提物可以抑制溫和氣單胞菌胞外多糖的分泌。Ding 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用苯甲醇處理熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）時，其分泌的胞外聚合物在種類和數(shù)量上都顯著減少，且具有質(zhì)量濃度依賴性，與本研究結(jié)果一致。

2.3 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌嗜鐵素的影響

嗜鐵素是指細(xì)菌、真菌等微生物在鐵含量較低的環(huán)境中合成的相對分子質(zhì)量較?。?～2 ku）的次級代謝產(chǎn)物[12]，能特異性地螯合Fe3+。溫和氣單胞菌可以在生存環(huán)境中分泌大量嗜鐵素，使其它微生物無法獲得足夠的鐵營養(yǎng)，生長繁殖受抑制，從而保持其自身的菌群密度，導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。從圖1c 中可以看出，3 個sub-MICs 的YF-8粗提物對溫和氣單胞菌嗜鐵素的抑制率分別為19.04%，28.12%和44.35%，表明溫和氣單胞菌嗜鐵素的產(chǎn)生受到Y(jié)F-8 粗提物的抑制，且具有劑量依賴性。

2.4 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌溶血性的影響

溶血性被認(rèn)為是溫和氣單胞菌能夠引發(fā)水產(chǎn)品病害的潛在原因之一，因此其常被作為研究溫和氣單胞菌潛在致病性的重要指標(biāo)[13]。從圖1d 中可以看出，溫和氣單胞菌的溶血活性隨著YF-8粗提物質(zhì)量濃度的升高而降低，當(dāng)粗提物質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL 時溶血活性最低。表明YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌溶血活性的抑制作用具有質(zhì)量濃度依賴性。Kannan 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，750 μg/mL 迷迭香酸顯著抑制嗜水氣單胞菌 （Aeromonas hydrophila）溶血素的產(chǎn)生，抑制率可以達(dá)到89%，這與本研究結(jié)果一致。

2.5 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌運動能力的影響

細(xì)菌的群集和泳動是鞭毛介導(dǎo)的兩種遷移形式，與致病菌的致病性及生物膜形成有著密切的關(guān)系[15]。抑制溫和氣單胞菌群集和泳動的能力對防治其引起的水產(chǎn)品腐敗和病害有著非常重要的作用。YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌運動能力的影響如圖2所示。由圖2可知，經(jīng)YF-8 粗提物處理后，溫和氣單胞菌遷移的距離明顯縮短。2.0，4.0 mg/mL 和6.0 mg/mL 的YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌群集和泳動的抑制率范圍為21.05%～65.79%和51.61%～93.55%。當(dāng)粗提物質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL 時，溫和氣單胞菌的群集和泳動能力幾乎完全被抑制，表明YF-8 粗提物可以很好地抑制溫和氣單胞菌的運動能力，且這種抑制作用呈質(zhì)量濃度依賴性，這可能是由于溫和氣單胞菌鞭毛的黏附能力受到了抑制，進(jìn)而影響了其運動能力。Ding等[9]研究發(fā)現(xiàn)，sub-MIC 的姜黃素脂質(zhì)體對溫和氣單胞菌的胞外蛋白酶活性、嗜鐵素分泌能力以及群集泳動能力等均有一定的抑制作用，與本試驗結(jié)果類似。

圖2 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌群集和泳動的影響Fig.2 Effects of YF-8 crude extract on swarming and swimming in A.sobria

2.6 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜抑制和清除的定量分析

生物膜是細(xì)胞通過附著在物體表面的胞外聚合物結(jié)合在一起而形成的穩(wěn)定的多細(xì)胞簇。其可以保護(hù)細(xì)菌免受抗菌劑的作用，比浮游細(xì)胞具有更強(qiáng)的抵抗外界變化的能力。AHLs 介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)對溫和氣單胞菌生物膜的形成、附著及固定起著關(guān)鍵性作用[16]。

2.6.1 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜形成的抑制 從圖3a 中可以看出，3 個sub-MICs 下YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜形成的抑制率在31.28%～66.64%范圍內(nèi)，隨著YF-8 粗提物質(zhì)量濃度的增加，溫和氣單胞菌生物膜的形成量逐漸降低，抑制作用呈質(zhì)量濃度依賴性。

圖3 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜抑制（a）和清除（b）的定量測定Fig.3 Quantitative determination of YF-8 crude extract on the inhibition （a） and clearance （b） of A.sobria biofilm

2.6.2 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的清除作用 從圖3b 中可以看出，3 個sub-MICs 下YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌預(yù)先形成的生物膜均具有一定的清除效果，清除率分別為6.70%，21.72%和29.88%。用6 mg/mL 的YF-8 粗提物處理時，清除效果最好。

2.6.3 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌浮游細(xì)胞的影響 YF-8 粗提物在清除溫和氣單胞菌生物膜時，對其浮游細(xì)胞的影響如圖4所示。由圖4可知，與對照組相比，3 個sub-MICs 的YF-8 粗提物均不影響溫和氣單胞菌浮游細(xì)胞的正常生長，表明YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌沒有抑制和殺死的作用。

圖4 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌浮游細(xì)胞的影響Fig.4 Effects of YF-8 crude extract on planktonic cells of A.sobria

2.7 光學(xué)顯微鏡分析YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的抑制和清除作用

2.7.1 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的抑制 從圖5a～d 中可以看出，對照組中溫和氣單胞菌菌體相互連接、聚集，形成典型的生物膜結(jié)構(gòu)，而YF-8 粗提物處理組則隨著粗提物質(zhì)量濃度的升高，生物膜逐漸稀疏，形成量逐漸減少，菌體逐漸分散，即抑制作用具有劑量效應(yīng)。當(dāng)YF-8 粗提物質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL 時，抑制作用最強(qiáng)，表明YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的形成有較好的抑制作用。

2.7.2 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的清除 從圖5e～h 可以看出，對照組中大量溫和氣單胞菌菌體聚集成片狀，形成致密的生物膜結(jié)構(gòu)，而YF-8 粗提物處理組中，雖然細(xì)菌仍大量累積，但是隨著粗提物質(zhì)量濃度的升高，生物膜的量逐漸減少，厚度逐漸變薄，結(jié)構(gòu)逐漸變得松散。用6.0 mg/mL 粗提物處理時，清除效果最好，表明YF-8粗提物對溫和氣單胞菌生物膜有較好的清除效果。同時，不同質(zhì)量濃度的YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響與定量測定的結(jié)果一致。

圖5 光學(xué)顯微鏡分析YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的抑制和清除作用Fig.5 Analysis of the inhibitory and removal effect of YF-8 crude extract on A.sobria biofilm by optical microscope

2.8 掃描電鏡分析YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的抑制和清除作用

2.8.1 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的抑制 從圖6a～d 中可以看出，對照組中溫和氣單胞菌微菌落連接形成致密而完整的生物膜結(jié)構(gòu)，而用YF-8 粗提物處理過的細(xì)菌生物膜表現(xiàn)出少量的微菌落以及一些孔隙和通道，表明YF-8 粗提物可能通過這些孔隙和通道引起營養(yǎng)物質(zhì)的泄漏和生物膜基質(zhì)的減少，從而抑制溫和氣單胞菌生物膜的形成。

圖6 掃描電鏡分析YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的抑制和清除作用Fig.6 Analysis of the inhibitory and removal effect of YF-8 crude extract on A.sobria biofilm by scanning electron microscope

2.8.2 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜的清除 從圖6e～h 中可以看出，對照組中溫和氣單胞菌的生物膜結(jié)構(gòu)厚而平坦，而經(jīng)不同質(zhì)量濃度的YF-8 粗提物處理后，溫和氣單胞菌的生物膜明顯被破壞，生物膜量顯著降低且厚度明顯減小，結(jié)構(gòu)越來越稀疏。此結(jié)果與光學(xué)顯微鏡觀察到的結(jié)果具有一致性，表明YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌生物膜有較好的清除效果。Younis 等[17]研究表明，15 mg/mL 海洋鏈霉菌（Marine streptomyces）的次生代謝物處理奇異變形桿菌 （Proteus mirabilis）UCB4 后，對其生物膜的抑制率為63%，且處理后的奇異變形桿菌在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下生物膜結(jié)構(gòu)稀疏松散，與本研究結(jié)果一致。

2.9 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌QS 調(diào)控基因的影響

LuxI 和LuxR 是與溫和氣單胞菌QS 相關(guān)的基因，LuxI 型蛋白主要負(fù)責(zé)合成信號分子AHLs，LuxR 型蛋白主要與AHLs 結(jié)合，從而觸發(fā)毒力因子和生物膜等相關(guān)基因的表達(dá)[18]。從圖7中可以看出，用6 mg/mL YF-8 粗提物處理溫和氣單胞菌后，LuxI 和LuxR 的表達(dá)明顯下調(diào)，相對表達(dá)量分別降低了69.48%和80.76%。表明溫和氣單胞菌QS 調(diào)控基因LuxI 和LuxR 的轉(zhuǎn)錄水平均受到Y(jié)F-8 粗提物的干擾。QS 調(diào)控基因的下調(diào)與上述毒力因子的研究結(jié)果一致。Li 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）經(jīng)1.0 mg/mL 的香蘭素處理后，QS 調(diào)控基因halI/halR 的相對表達(dá)量顯著下調(diào)，下調(diào)率分別為77.40%和34.30%，并且其AHLs 的分泌量明顯降低，與本研究結(jié)果一致。

圖7 YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌QS 調(diào)控基因的影響Fig.7 Effects of YF-8 crude extract on the expression of QS-related genes in A.sobria

3 結(jié)論

本文主要研究了戊糖片球菌YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌幾種毒力因子及生物膜的影響。結(jié)果表明，3 個sub-MICs （2.0，4.0 mg/mL 和6.0 mg/mL）下YF-8 粗提物對溫和氣單胞菌的蛋白酶、胞外多糖、嗜鐵素、溶血性、運動能力等幾種毒力因子和生物膜形成具有明顯的抑制作用，且抑制作用具有顯著的劑量依賴性。此外，溫和氣單胞菌QS 調(diào)控基因LuxI 和LuxR 的轉(zhuǎn)錄水平明顯受到Y(jié)F-8 粗提物的干擾。因此，戊糖片球菌YF-8 可作為淬滅溫和氣單胞菌QS 的出發(fā)菌株，為控制由溫和氣單胞菌導(dǎo)致的水產(chǎn)品腐敗及病害提供一種新的思路。