衣殼組裝調(diào)節(jié)劑聯(lián)合核苷(酸)類似物治療慢性乙型肝炎臨床試驗(yàn)中亟待解決的科學(xué)問題

魯鳳民， 黃鴻鑫， 毛天皓， 陳香梅， 莊 輝

1 北京大學(xué)人民醫(yī)院 肝病研究所， 北京 100044;2 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系暨北京大學(xué)感染病研究中心， 北京 100191

HBV感染是病毒性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌的主要病因。2021年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]顯示，全球慢性HBV感染者約2.96億人。我國自1992年開始實(shí)施新生兒乙型肝炎疫苗免疫規(guī)劃管理，2002年實(shí)行乙型肝炎疫苗免費(fèi)，2005年正式實(shí)施乙型肝炎疫苗免疫規(guī)劃，HBV新發(fā)感染大幅減少，其中5歲以下兒童HBV感染率已降至0.2%，全人群的慢性HBV感染率也下降至6.1%[2]。但我國既往慢性HBV感染者眾多，現(xiàn)仍有7000萬例，其中亟需治療的慢性乙型肝炎(CHB)患者2000～3000萬例[3]。2016年5月，世界衛(wèi)生大會通過了“2030年消除病毒性肝炎公共衛(wèi)生危害”的全球戰(zhàn)略，要求將新發(fā)感染減少90%、死亡減少65%[4]。當(dāng)下我國每年HBV相關(guān)死亡約40萬例，但CHB診斷率僅為22%，治療率為17%[5]，距離世界衛(wèi)生組織提出的診斷率90%、治療率80%尚有很大距離。

現(xiàn)有的兩類一線抗HBV藥物包括核苷(酸)類似物(NUC)和聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)，均可有效抑制病毒復(fù)制，減緩疾病進(jìn)展和減少終末期肝病的發(fā)生。其中，PEG-IFNα主要通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗病毒作用，經(jīng)過有限療程后，其HBsAg清除率約為10%，在優(yōu)勢人群中可有更高的臨床治愈率[6-8]，但由于存在一定的副作用，限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。NUC主要通過不可逆地阻斷HBV聚合酶(polymerase，P)介導(dǎo)的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄過程，顯著抑制HBV DNA復(fù)制以發(fā)揮抗病毒作用[9]，加之口服方便、副作用較少，NUC在臨床上得到廣泛應(yīng)用。然而，停藥后反彈是NUC最大缺點(diǎn)[10]，患者一旦開始NUC治療，往往需要長期甚至終生服藥，一定程度上影響了患者的治療意愿。因此，目前亟需研發(fā)抗HBV新藥，以顯著提高CHB的治愈率。

近年來，靶向HBV生命周期不同層面的直接抗病毒藥物(DAA)如進(jìn)入抑制劑、衣殼組裝調(diào)節(jié)劑(capsid assembly modulators，CpAM)、HBsAg釋放抑制劑、干擾共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)轉(zhuǎn)錄及表達(dá)過程的RNA干擾，包括小干擾RNA和反義寡核苷酸等均已進(jìn)入不同臨床試驗(yàn)階段。其中，CpAM是截至目前進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段較多的一類在研藥物，但在以“安全停藥”為主要治療觀察終點(diǎn)的CpAM聯(lián)合NUC臨床試驗(yàn)中，幾乎所患者停藥后均發(fā)生反彈[11]，因此有必要深入探討CpAM聯(lián)合NUC的用藥策略，以選擇適宜的臨床試驗(yàn)終點(diǎn)。

1 cccDNA與CHB的臨床治愈

近年來，靶向HCV復(fù)制的DAA藥物成功治愈丙型肝炎，再次將“CHB治愈”推到聚光燈下。但與HCV基因組RNA在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過快速自我復(fù)制維持慢性感染不同，以穩(wěn)定的微小染色體形式存在于感染肝細(xì)胞內(nèi)且有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA是HBV復(fù)制的源頭，也是維持HBV感染的關(guān)鍵。加之慢性HBV感染過程中普遍發(fā)生的HBV DNA整合[12]，以及HBV的免疫逃逸[13]，CHB的臨床治愈面臨著更大的挑戰(zhàn)。

盡管HBV基因組僅有3.2 kb長，但卻有2種病毒基因組形式：即松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)和cccDNA。HBV進(jìn)入肝細(xì)胞后，rcDNA進(jìn)入細(xì)胞核并被修復(fù)形成cccDNA[14-17]。cccDNA在細(xì)胞核內(nèi)以微小染色體形式存在，可轉(zhuǎn)錄出病毒的全部mRNA，故有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA的持續(xù)存在，被認(rèn)為是HBV慢性感染得以維持和患者難以治愈的最主要因素[18]。除此之外，HBV DNA的復(fù)制有其獨(dú)特的逆轉(zhuǎn)錄過程，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)新合成的核心蛋白將前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)/P蛋白復(fù)合物包裹形成核衣殼，隨后P蛋白以pgRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成負(fù)鏈DNA，再以pgRNA的5′端殘余為引物合成出長度不一的互補(bǔ)正鏈，形成子代病毒rcDNA。期間，P蛋白要確保有3次正確的跳轉(zhuǎn)才能完成上述復(fù)雜過程[19]。肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA池除了來源于新感染過程中進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)的rcDNA，還可由感染肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)新形成的、帶有rcDNA的核衣殼直接入核并釋放rcDNA形成[14,20]。而病毒蛋白HBx對于形成有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA至關(guān)重要[21-22]。

我國學(xué)者[23]曾通過對CHB患者HBV耐藥病毒株動態(tài)變化的分析，推測患者肝組織內(nèi)cccDNA的半衰期可能只有數(shù)月。cccDNA的較短半衰期帶來了通過NUC抑制HBV DNA復(fù)制阻止新病毒的產(chǎn)生，從而耗竭cccDNA實(shí)現(xiàn)乙型肝炎治愈的希望[24]。然而，在臨床實(shí)踐中，即使接受長時(shí)間NUC治療，也僅有極少數(shù)患者血清HBsAg消失(伴有或不伴有抗-HBs陽轉(zhuǎn))，實(shí)現(xiàn)臨床治愈(功能性治愈)。與之一致，2020年美國肝病學(xué)會年會報(bào)道一項(xiàng)來自10個(gè)國家(地區(qū))、25家醫(yī)院的國際多中心真實(shí)世界隊(duì)列研究[25]，共納入初治CHB患者7697例，其中，5430例接受恩替卡韋(ETV)，2267例接受替諾福韋酯(TDF)治療，結(jié)果顯示，ETV和TDF隊(duì)列的8年累積血清HBsAg清除率分別為1.69%和1.34%。此外，由于NUC的作用機(jī)制是競爭性抑制P蛋白的逆轉(zhuǎn)錄活性，其往往難以完全阻斷cccDNA池的內(nèi)補(bǔ)充[26]，導(dǎo)致停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)和疾病反彈發(fā)生率較高，患者不得不長期甚至終生服藥，給患者和社會帶來健康和經(jīng)濟(jì)雙重負(fù)擔(dān)。因此，對于長期接受NUC治療的患者，安全停藥是一項(xiàng)無法回避的需求。

2 CpAM聯(lián)合NUC治療CHB臨床試驗(yàn)中需考慮的科學(xué)問題

在研的CpAM類藥物可分為2種作用類別：Ⅰ型CpAM干擾病毒核衣殼的正常組裝，使之形成多種形態(tài)的非衣殼結(jié)構(gòu)[27]；Ⅱ型CpAM則促進(jìn)結(jié)構(gòu)“正?！钡珶opgRNA/P蛋白復(fù)合物的空衣殼形成[28]。CpAM的上述作用均可抑制pgRNA的包裝[29-30]。此外，CpAM還有增強(qiáng)成熟核衣殼的非正常解聚和干擾rcDNA正確釋放入核以回補(bǔ)cccDNA的作用[31-33]。并且，由于HBV抗CpAM的潛在耐藥位點(diǎn)與NUC耐藥突變不重疊，預(yù)計(jì)對NUC耐藥變異株也有作用[34]。因此，已有的CpAM的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)多與NUC聯(lián)合。有研究[35]顯示，相較于ETV單藥治療，CpAM與ETV聯(lián)合治療患者的HBV DNA和HBV RNA往往有更大幅度的下降。

目前，對于是從病毒學(xué)還是從臨床角度去定義“CHB治愈”尚缺乏一致意見，并可能對新藥的臨床評價(jià)帶來一定的困擾?？偟膩碚f，僅僅是病毒學(xué)意義上的HBV cccDNA持久沉默或清除的CHB患者仍有較高的原發(fā)性肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。而以血清HBsAg陰轉(zhuǎn)(伴或不伴抗-HBs陽轉(zhuǎn))為標(biāo)志的臨床治愈[36]，則不僅是所有病毒學(xué)標(biāo)志物的完全陰轉(zhuǎn)，包括肝癌在內(nèi)的相關(guān)肝病死亡風(fēng)險(xiǎn)也大為下降[37]。血清中HBV RNA病毒樣顆粒的發(fā)現(xiàn)為指導(dǎo)NUC治療的安全停藥提供了一定幫助，原因在于血清中的HBV RNA多為未完成逆轉(zhuǎn)錄的核衣殼內(nèi)包裹的pgRNA[38]，NUC治療阻斷了逆轉(zhuǎn)錄過程，使核衣殼內(nèi)的pgRNA不再為P蛋白的RNase H活性所降解，并以HBV RNA病毒樣顆粒形式釋放至血循環(huán)[38]。因此，血清中HBV RNA檢測陽性往往反映了患者肝組織中cccDNA仍在活躍轉(zhuǎn)錄，故血清中HBV RNA陽性時(shí)的停藥往往提示更大的反彈甚至疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[38-39]。但在CpAM治療時(shí)，HBV RNA減少僅僅是藥物作用于靶點(diǎn)的重要證據(jù)，并非代表cccDNA被清除或被靜默[11]。在HBsAg或乙型肝炎核心相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)無明顯下降的情況下，以“安全停藥”為重要觀察終點(diǎn)的兩項(xiàng)CpAM臨床試驗(yàn)[40-41]中，幾乎所有患者均在停藥后發(fā)生了反彈，未能觀察到持續(xù)的治療效果，由于治療過程中出現(xiàn)ALT水平升高，研究暫停。

CpAM的藥理作用主要是干擾核心蛋白的正確組裝，使pgRNA/P蛋白復(fù)合物無法被有效包裹，從而使逆轉(zhuǎn)錄過程受阻；或引發(fā)已經(jīng)形成的成熟核衣殼易被拆解而穩(wěn)定性下降。而NUC則是在核衣殼內(nèi)競爭抑制P蛋白以pgRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成子代病毒負(fù)鏈DNA的過程。臨床上，二者聯(lián)用具有良好的協(xié)同作用，對rcDNA合成過程的抑制作用更加徹底；但由于二者均為通過干擾抑制子代病毒rcDNA的形成過程發(fā)揮抗病毒作用，當(dāng)與作用力超強(qiáng)的CpAM聯(lián)用時(shí)，NUC可能將主要作用于逃逸了CpAM干擾作用的核衣殼內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄過程，僅僅發(fā)揮“堵漏”作用?；蛟S不能期待在臨床試驗(yàn)的短療程條件下，CpAM+NUC兩強(qiáng)聯(lián)合實(shí)現(xiàn)“1+1≥2”的疊加效能。

此外，可以預(yù)見的是，核衣殼內(nèi)的pgRNA并非以無序狀態(tài)自由懸浮其中，更可能是以適當(dāng)?shù)姆绞健皯覓臁痹谔畛渲鴇NTP和一些未知宿主蛋白的衣殼腔內(nèi)。生物信息學(xué)分析[42]提示，在pgRNA上或許存在與構(gòu)成衣殼的核心蛋白結(jié)合的基序。也有研究[43]證實(shí)，pgRNA的5′ε莖環(huán)結(jié)構(gòu)與核心蛋白相互作用，促進(jìn)衣殼的組裝。在CpAM作用下失去了正常結(jié)構(gòu)和殼內(nèi)空間的核衣殼內(nèi)，pgRNA/P蛋白復(fù)合物是否能夠有效啟動由P蛋白第63位酪氨酸引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄起始引物前3個(gè)脫氧核糖核酸的合成？隨后是否可以正常進(jìn)行首次跳轉(zhuǎn)以確保逆轉(zhuǎn)錄的精準(zhǔn)啟動？如此多的不確定性提醒有必要探究聯(lián)合用藥下，NUC是否還能夠發(fā)揮對逆轉(zhuǎn)錄過程的有效競爭抑制作用。若果真如此，兩者聯(lián)合的疊加抗病毒作用是否更容易碰到藥物效應(yīng)的天花板？期許兩強(qiáng)聯(lián)合加速cccDNA池耗竭的作用會不會難以成真？事實(shí)上，從既往報(bào)道的CpAM聯(lián)合NUC臨床試驗(yàn)研究結(jié)果來看，患者血清HBsAg或HBcrAg在短期治療后的確無明顯下降，也許提示聯(lián)合CpAM并未顯著加速NUC治療下的cccDNA耗竭或靜默，以至于幾乎所有患者在有限療程的聯(lián)合治療后均發(fā)生了停藥后的病毒學(xué)反彈[44]。目前比較確認(rèn)的是，在未來以安全停藥為觀察終點(diǎn)的臨床試驗(yàn)中，可能需要更長時(shí)間的CpAM和NUC聯(lián)合治療以耗竭或靜默cccDNA池，提高安全停藥的可能性。此外，基于人肝嵌合鼠的動物實(shí)驗(yàn)[45]發(fā)現(xiàn)，CpAM與PEG-IFNα聯(lián)用能夠進(jìn)一步增強(qiáng)PEG-IFNα誘導(dǎo)的肝內(nèi)干擾素刺激基因表達(dá)，提示在未來對特定人群以臨床治愈為目的的臨床試驗(yàn)中，有必要考慮CpAM在與一線NUC聯(lián)用的基礎(chǔ)上，加用長效干擾素，或與在研的免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)用，以提高臨床治愈率，減少肝細(xì)胞癌的發(fā)生(圖1)。

圖1 影響CpAM聯(lián)合NUC對抑制HBV DNA復(fù)制發(fā)揮疊加作用的可能機(jī)制及啟示

3 小結(jié)與展望

在本期發(fā)表的文章中，陳娟、黃愛龍從HBV cccDNA 的角度討論了慢性乙型肝炎的治愈問題。除此之外，整合來源的HBsAg持續(xù)表達(dá)也是影響慢性乙型肝炎臨床治愈的主要因素。由于缺乏直接靶向cccDNA的抗病毒藥物，且整合的HBV DNA可持續(xù)表達(dá)HBsAg，通過調(diào)節(jié)宿主免疫清除感染及攜帶整合HBV DNA片段的肝細(xì)胞、或使之轉(zhuǎn)錄沉默，對于慢性乙型肝炎的臨床治愈尤為重要。這方面，高子翔等就一些關(guān)鍵細(xì)胞因子在CHB感染及治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)與討論；郭藝飛、張繼明對影響慢性乙型肝炎功能性治愈的因素特別是宿主免疫因素及其機(jī)制進(jìn)行了討論。在抗HBV新藥研發(fā)上，CpAM無疑是最受關(guān)注的一類，劉慧等系統(tǒng)闡述了CpAM 靶蛋白-核心蛋白的功能、CpAM 分類、作用靶點(diǎn)及抗HBV機(jī)理及CpAM 臨床試驗(yàn)現(xiàn)狀等，并預(yù)期聯(lián)合治療可能是CpAM未來臨床應(yīng)用的最佳選擇。筆者團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，現(xiàn)階段CpAM的聯(lián)合治療之路布滿荊棘，可能需要放緩步伐，優(yōu)先著手解決一些影響CpAM聯(lián)合NUC治療效果的相關(guān)問題。這或?qū)pAM的臨床應(yīng)用有更切實(shí)的預(yù)期與定位，使未來的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)更為合理，并最終使CpAM類藥物及早進(jìn)入臨床，使患者獲益。

近年來，包括固有免疫調(diào)節(jié)劑、治療性疫苗、免疫檢查點(diǎn)抑制劑，以及單克隆抗體在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)劑均有長足發(fā)展[46-49]?？紤]到激活體內(nèi)特異性抗HBV免疫反應(yīng)在清除感染肝細(xì)胞及其cccDNA池、清除有轉(zhuǎn)錄活性整合HBV DNA肝細(xì)胞中的重要作用，未來的聯(lián)合治療或許是在更強(qiáng)的抗HBV DAA抑制病毒復(fù)制、靜默及清除cccDNA池和減少免疫抑制性的HBsAg水平的基礎(chǔ)上，再聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)藥物，以誘導(dǎo)抗HBV特異性后天免疫，為CHB臨床治愈帶來更大希望。

關(guān)于多靶點(diǎn)聯(lián)合治療，目前看來似應(yīng)綜合考慮如下幾點(diǎn)：(1)安全性；(2)療效；(3)多靶點(diǎn)藥物的相互作用及其與患者因其他疾病而用藥物的相互作用；(4)成本效益比；(5)患者的經(jīng)濟(jì)承受能力，即可及性等。我國CHB臨床治愈(珠峰)工程項(xiàng)目最新研究[50]結(jié)果顯示，對于NUC治療下達(dá)到HBV DNA檢測不到、HBsAg≤100 IU/mL的患者，聯(lián)合PEG-IFNα治療后，臨床治愈率可高達(dá)55.3%。因此，未來如出現(xiàn)比現(xiàn)行NUC(ETV、TDF和TAF)更強(qiáng)效、低耐藥的DAA藥物，再聯(lián)合一種比PEG-IFNα更強(qiáng)效的免疫調(diào)節(jié)藥物，也許能夠獲得更高的臨床治愈率。總之，多種潛在的聯(lián)合治療策略仍有待深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：魯鳳民、莊輝擬定寫作思路并最終定稿；陳香梅指導(dǎo)文章撰寫并修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；黃鴻鑫和毛天皓負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索并參與起草文稿。