劉萌萌，張 ，張紫薇，袁建彬，郭景茹

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

北方寒冷天氣是多種疾病的誘因，機(jī)體的免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等都易受到寒冷環(huán)境的影響［1，2］。有研究表明，冷暴露能夠?qū)е聶C(jī)體腸道菌群破壞、免疫細(xì)胞數(shù)量下降、生長速度減慢、生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化率降低，使動(dòng)物感染疾病的幾率大大增加，甚至造成新生幼崽死亡，母畜流產(chǎn)等，進(jìn)而降低動(dòng)物產(chǎn)品的產(chǎn)出，制約我國北方畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展［3-5］。

腸道為機(jī)體主要消化吸收的部位，極易受到外部環(huán)境的變化致腸道疾病發(fā)生。有研究表明，慢性冷暴露增加大鼠的肥大細(xì)胞數(shù)量，引起大鼠小腸上皮細(xì)胞增殖速率受損，從而促進(jìn)炎癥性腸炎的發(fā)生［6］?；啬c具有消化、排空等功能，是動(dòng)物吸取營養(yǎng)物質(zhì)的主要部位。據(jù)報(bào)道，長期處于高溫或低溫的環(huán)境會破壞機(jī)體回腸微生物的多樣性［7］，影響機(jī)體生長發(fā)育、消化吸收、營養(yǎng)免疫等功能。腸道上皮屏障能夠隔離腸腔與血流，可分為機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學(xué)屏障四種類型［8］。其中機(jī)械屏障則是腸道復(fù)雜功能網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)，它是由緊密連接和腸黏膜上皮細(xì)胞組成。腸上皮細(xì)胞間的連接是一種復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，被稱為緊密連接，這種緊密連接能夠保持上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，形成一種致密的黏膜屏障來維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［9］。緊密連接包括閉合蛋白（Claudins）、咬合蛋白（Occludin）、帶狀閉合蛋白（zonula occludens，ZOs）等，其中Claudin-1和Occludin是構(gòu)成緊密連接的重要組成部分，ZO-1是緊密連接中跨膜蛋白的主要成分。緊密連接相關(guān)蛋白互相連接形成致密的復(fù)合物，以保證細(xì)胞與細(xì)胞之間的緊密結(jié)合［10］。以往研究發(fā)現(xiàn)，外界溫度驟降能夠減弱緊密連接功能，增加小鼠腸道通透性［11］，并指出完整的緊密結(jié)構(gòu)對于機(jī)體健康的重要性。此外機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活后，免疫細(xì)胞活化，炎癥細(xì)胞因子釋放增加，激活相關(guān)通路，也會導(dǎo)致上皮細(xì)胞的緊密連接受到破壞，增加通透性，病原體和細(xì)菌趁機(jī)侵入腸道，增加腸道患病的幾率［12］。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腸道受到抗原刺激時(shí)會使免疫防御機(jī)制遭到破壞，腸道微生物失調(diào)而引起炎癥性相關(guān)疾病的發(fā)生［13］。

據(jù)此，本研究旨在探討冷暴露對小鼠回腸屏障功能損傷的作用及NF-κB對其調(diào)控機(jī)制，為機(jī)體腸道健康及應(yīng)激性腸病的靶向治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料及方法

1.1 建立小鼠冷暴露模型

將20只5周齡雄性C57BL/6小鼠（購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）隨機(jī)分為兩組，即對照組和冷暴露組，每組10只。試驗(yàn)前于室溫氣候室內(nèi)預(yù)飼一周，保證自由飲食。預(yù)飼結(jié)束后將對照組小鼠置于恒溫氣候室內(nèi)，飼養(yǎng)保持溫度（24±2）℃，濕度40%。冷暴露組小鼠每天轉(zhuǎn)移至溫度為（4±2）℃濕度為40%的恒溫氣候室中3 h，連續(xù)冷暴露三周。冷暴露周期結(jié)束后注射戊巴比妥麻醉處死，沿腹部中線剪開，距離盲腸前6 cm剪斷，采集回腸組織，用生理鹽水反復(fù)漂洗至干凈，濾紙吸干多余液體后，部分凍存于-80℃冰箱內(nèi)以備用后續(xù)實(shí)驗(yàn)，另取部分回腸組織置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2 試劑

BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒，貨號：P0012S購于碧云天生物技術(shù)公司；抗體：p-p65（AF2006，1∶1 000）購于：Affinity Biosciences有限公司，Claudin-1（13050-1-AP，Proteintech，1∶5 000）、Occlundin（27260-1-AP，Proteintech，1∶3 000）、ZO-1（21773-1-AP，Proteintech，1∶7 000）、IL-1β（26048-1-AP，Proteintech，1∶800）、IL-6（66146-1-lg，Proteintech，1∶1 000）、p65（66535-1-Ig，1∶1 000）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（SA00001-1，1∶8 000）和HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（SA00001-2，1∶8 000）、CoraLite 488-Conjugated ZO-1 Polyclonal Antibody（CL488-21773，IF：1∶50～1∶500）均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 小鼠回腸組織石蠟切片

取2～3 mm厚的小鼠回腸組織，脫水后放入4%的多聚甲醛后進(jìn)行固定，隨后按照常規(guī)的切片制作步驟進(jìn)行相應(yīng)處理。然后將切片貼于已經(jīng)處理后的載玻片上，烤片經(jīng)一晝夜后保存，次日應(yīng)用HE染色和Masson染料染色后，光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化。

1.4 免疫熒光染色

制作回腸組織切片，使用PBS沖洗切片4次，每次3 min，沖洗結(jié)束后滴加10%正常山羊血清37℃下封閉45 min。封閉結(jié)束后，沖洗干凈分別加入按照說明書稀釋的胞質(zhì)緊密粘連蛋白1抗體（zonula occludens-1，ZO-1），放入濕盒中37℃下孵育1 h，置于4℃下過夜。孵育結(jié)束后，使用PBS沖洗3次，每次5 min，然后避光加入相應(yīng)的熒光二抗（1∶200），37℃下孵育45 min，孵育結(jié)束后，吸棄二抗，不再清洗，使用抗熒光淬滅劑（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在避光條件下封片，置于熒光顯微鏡下觀察，保存圖像。

1.5 免疫蛋白印跡

蛋白樣品的制備及濃度的測定：取5周齡C57BL/6對照組和冷暴露組的雄性小鼠的回腸組織，制備所需要的蛋白樣品，高溫變性后凍存于-20℃。將提前制備好SDS-PAGE膠置于電泳液中，按照一定順序在梳孔加入蛋白樣品后進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，室溫封閉PVDF膜1 h，使用TBST漂洗，依次加入相應(yīng)抗體，置于4℃搖床過夜。一抗孵育結(jié)束后使用TBST進(jìn)行漂洗，然后使用二抗室溫孵育1 h，再次漂洗干凈。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑將帶有目的蛋白的PVDF膜進(jìn)行顯影。應(yīng)用lmage Lab軟件，檢測緊密連接蛋白、NF-κB蛋白、炎癥細(xì)胞因子蛋白并分析各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為蛋白表達(dá)相對水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 冷暴露對小鼠回腸組織的影響

HE染色發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠回腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列整齊。與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸絨毛長度變短，部分絨毛缺失，隱窩深度增加，環(huán)形肌層變薄，出現(xiàn)大量炎癥浸潤現(xiàn)象（圖1）。Masson染色結(jié)果顯示：與對照組相比，冷暴露組膠原纖維沉積增加，出現(xiàn)輕微纖維化（圖2）。免疫熒光檢測可見，對照組ZO-1主要集中分布于絨毛緊密連接處，分布較為均勻、緊密；與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸組織ZO-1熒光強(qiáng)度明顯減弱，分布松散，失去緊密結(jié)構(gòu)（圖3）。

Fig.1 Effects of cold exposure on mice ileum（HE×400）

Fig.2 Effects of cold exposure on collagen fibre in mice ileum（Masson×400）

Fig.3 Effects of cold exposure on tight junction of mice ileum determined by immunofluorescence method（Scale bar=25 μm）

2.2 冷暴露對小鼠回腸組織緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸組織Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.01，P＜0.05，圖4，表1）。

Fig.4 The protein expressionsof claudin-1，occludin and ZO-1 detected by Western blot（n=10）

Tab.1 The protein expressions levels of claudin-1，occludin，ZO-1 and p-p65 in different groups（±s，n=10）

Tab.1 The protein expressions levels of claudin-1，occludin，ZO-1 and p-p65 in different groups（±s，n=10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Croup Claudin-1 Occludin ZO-1 p-p65 Control 2.35±0.28 0.58±0.21 0.69±0.17 2.95±1.18 Cold exposure 1.63±0.15**0.31±0.12*0.49±0.09*5.77±1.91*

2.3 冷暴露對小鼠回腸組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸中NF-κB通路的相關(guān)蛋白p-p65蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，圖5，表1）。

Fig.5 The protein expressions of p65 and p-p65 detected by Western blot（n=10）

2.4 冷暴露對小鼠回腸組織炎癥細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸組織炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6（interleukin-6，IL-6）蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，圖6，表2）。

Fig.6 The protein expressions of IL-1βand IL-6 detected by Western blot（n=10）

Tab.2 The levels of IL-1βand IL-6 in different groups（±s，n=10）

Tab.2 The levels of IL-1βand IL-6 in different groups（±s，n=10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Croup IL-1β IL-6 Control 0.02±0.01 0.13±0.18 Cold exposure 0.05±0.00* 0.78±0.15**

3 討論

近年來越來越多的研究表明，動(dòng)物暴露在寒冷的環(huán)境時(shí)，可能會導(dǎo)致機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)發(fā)生障礙，中樞系統(tǒng)受損，嚴(yán)重可影響動(dòng)物的生命安全［14］。腸道是消化管中最長的一段，功能尤為重要?；啬c是消化和吸收的主要場所之一，緊密連接功能作為屏障的重要組成部分，當(dāng)其功能被破壞時(shí)就會對腸道的健康造成負(fù)面影響。一旦腸屏障功能受損，腸道通透性升高，就會增加腸內(nèi)細(xì)菌與毒素入血的概率，嚴(yán)重者或可導(dǎo)致腸源性膿毒血癥，繼發(fā)全身炎癥。在緊密連接蛋白受到抑制時(shí)易產(chǎn)生腹腔疾病，在早晚期的腸道腫瘤中也發(fā)現(xiàn)幾種緊密連接蛋白表達(dá)缺陷［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，冷暴露能夠造成小鼠回腸結(jié)構(gòu)損傷，與以往相關(guān)報(bào)道的結(jié)果相一致［16］，均表明腸道絨毛結(jié)構(gòu)完整性及機(jī)械物理屏障在腸道疾病的發(fā)生發(fā)展中起到不可或缺的作用。

緊密連接的相鄰細(xì)胞膜間形成的屏障層，是腸道機(jī)械屏障主要的組成部分之一。動(dòng)物腸道中有大量的菌群和致病因子，健康腸道的腸黏膜屏障可以有效阻止大量抗原物質(zhì)的侵害，從而保證腸道的正常功能及其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。為適應(yīng)復(fù)雜多變的腸道環(huán)境，緊密連接蛋白呈現(xiàn)高度動(dòng)態(tài)變化，其完整性也與多種腸道疾病密切相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白的表達(dá)變化直接與小腸上皮的屏障功能和完整性直接相關(guān)［17］。本實(shí)驗(yàn)在冷暴露的條件下，小鼠回腸的緊密連接蛋白顯著下降，致使腸道屏障受損。發(fā)生嚴(yán)重燙傷時(shí)，在創(chuàng)傷應(yīng)激條件下緊密連接被破壞，腸黏膜屏障功能被削弱，通透性升高，從而導(dǎo)致細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥［18］。

核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）能夠參與體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)［19］。細(xì)胞正常狀態(tài)下，NF-κB主要以二聚體形式存在，其中大部分二聚體與抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）相結(jié)合，而處于無活性狀態(tài)，一旦細(xì)胞受到炎癥因子刺激后，IκB將與NF-κB二聚體解離而使其p65亞基發(fā)生磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，致使NF-κB被激活，促使炎癥發(fā)生［20］。近年來國內(nèi)外的研究都指出NF-κB與腸道疾病之間的密切聯(lián)系［21］。有研究表明，患有潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)通透性升高與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、NF-κB p65升高呈正相關(guān)［22］；在腸道黏膜上皮處檢測到NF-κB的表達(dá)增多，促炎細(xì)胞因子也隨之增加，加劇炎癥反應(yīng)［23］。肖南［24］等人研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制NF-κB p65的活化，能夠緩解葡聚糖硫酸鈉鹽誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的病理損傷，減少炎癥細(xì)胞因子的釋放，抑制結(jié)腸細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道巨噬細(xì)胞過度活化可以激活NF-κB通路，促進(jìn)釋放炎癥細(xì)胞因子，引起組織炎癥反應(yīng)［25］。本研究結(jié)果表明，冷暴露后回腸組織內(nèi)p-p65的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，激活回腸內(nèi)NF-κB通路，表明冷暴露能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)腸道受刺激時(shí)，免疫巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥細(xì)胞因子，能夠引發(fā)克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的多種炎癥性疾?。?6］。其機(jī)制是由于促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間平衡被打破［27］。白細(xì)胞介素是介導(dǎo)免疫細(xì)胞活化和增殖的一類細(xì)胞因子，參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示：冷暴露后小鼠回腸炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)有所增加。表明促炎細(xì)胞因子聚積，導(dǎo)致炎癥性疾病的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)冷暴露能夠破壞回腸組織緊密連接與機(jī)械屏障的完整性，增加回腸組織的通透性和疾病易感性，激活NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。