董斯琳，姚桐桐，謝琳淼，孫廣玉，敖紅

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

重金屬鎘(Cd)的生物毒性很強(qiáng)，是植物生長發(fā)育的非必需元素[1]。近年來，工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中將鎘不同程度地排放到土壤環(huán)境中，使鎘污染成為危害最大、分布最廣的農(nóng)業(yè)污染之一[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國已有2 000萬hm2的土地面積被鎘污染，并且污染面積正逐步擴(kuò)大[3]。過量鎘會(huì)對(duì)動(dòng)植物產(chǎn)生極大危害，植物體內(nèi)的鎘過量時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒害癥狀，主要表現(xiàn)為抑制根部增長，破壞某些生理生化反應(yīng)，進(jìn)而遏制根部從土壤吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)[4]。植物的生長發(fā)育過程同樣會(huì)受到鎘的抑制，其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致植物的生長遲緩，植株萎蔫，甚至導(dǎo)致死亡[5]。更重要的是，鎘可以通過食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體造成巨大損傷[6]。對(duì)重金屬土壤的修復(fù)有多種方式，其中植物修復(fù)受到人們的關(guān)注。而草坪草因其生命力旺盛、覆蓋力和適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、抗逆性強(qiáng)、易收割等優(yōu)點(diǎn)在植物修復(fù)重金屬污染土壤中具有較好的應(yīng)用價(jià)值[7]。

木霉菌是一類被廣泛應(yīng)用的植物生防菌，能抵御多種植物病原菌[8]。哈茨木霉菌可以防治及緩解黃瓜的根腐病和線蟲病[9]、馬鈴薯黑痣病[10]、煙草青枯病[11]等植物病害。木霉菌還具有促進(jìn)植物的生長發(fā)育，改善植物生理代謝等作用[12-15]。近年來發(fā)現(xiàn)，利用木霉菌與植物的互作關(guān)系可以增強(qiáng)植物對(duì)微生物脅迫的抗性[16]。李舒依等[17]研究發(fā)現(xiàn)，使用哈茨木霉菌可以提高鹽脅迫下黃瓜種子的發(fā)芽率和胚芽長；付健等[18]研究發(fā)現(xiàn)，施用哈茨木霉菌可以提高鹽堿土壤中玉米葉片光合色素含量，增強(qiáng)光合作用、抗氧化酶活性，從而緩解玉米鹽堿抑制。關(guān)于哈茨木霉菌對(duì)植物重金屬抗性作用相關(guān)研究較少，待進(jìn)一步探索。

草地早熟禾(Poapratensis)是一種多年生草坪草，其生命力十分頑強(qiáng)，能適應(yīng)各種不同的生長環(huán)境，無論潮濕還是干旱；氣溫偏高或是寒冷地區(qū)，只要水分供應(yīng)充足就能生長[19]。因此，草地早熟禾常作為草坪草廣泛運(yùn)用在園林綠化中。本試驗(yàn)使用草地早熟禾作為材料，研究哈茨木霉菌對(duì)不同濃度鎘處理下草地早熟禾種子萌發(fā)、生長狀況及生理效應(yīng)的影響，探討哈茨木霉菌提高植物抗鎘能力的生理機(jī)制，并為植物修復(fù)鎘污染土地的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

草地早熟禾(Poapratensis)，購于哈爾濱市和平綠化有限公司。哈茨木霉菌(T.harzianum)Th62菌株由東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院張榮沭博士提供。Cd脅迫處理使用氯化鎘試劑。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn)

哈茨木霉?jié)舛群Y選。選取顆粒飽滿、大小均勻的草地早熟禾種子先用95%乙醇浸泡2 min，再用20%次氯酸鈉溶液消毒20 min，蒸餾水沖洗3～4遍后浸種2 h。取5個(gè)小燒杯放入足夠種子，將濃度分別為0(CK)、102、104、106和108mL-1的哈茨木霉菌懸浮液2 mL依次加入燒杯，浸種3 h。隨后將種子轉(zhuǎn)移到具有雙層濾紙發(fā)芽床的直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿50粒種子，加蒸餾水3 mL，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。光照14 h、25 ℃，黑暗10 h、15 ℃。28 d為一個(gè)發(fā)芽期，每天記錄種子萌發(fā)數(shù)量。本試驗(yàn)發(fā)芽結(jié)束時(shí)間以5 d內(nèi)沒有新種子發(fā)芽為準(zhǔn)。結(jié)果顯示，106mL-1處理后種子萌發(fā)率最高(表1)，因此，選該濃度作為后續(xù)種子萌發(fā)試驗(yàn)的哈茨木霉處理濃度。

表1 不同濃度哈茨木霉菌處理對(duì)草地早熟禾的種子萌發(fā)率的影響

用106mL-1哈茨木霉菌懸浮液(T處理)和蒸餾水(C)分別浸種，處理方法同上。處理后的種子移入具雙層濾紙發(fā)芽床的培養(yǎng)皿，皿中分別加入濃度為0(CK)、100、200、300和400 μmol·L-1的CdCl2溶液，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。每日記錄發(fā)芽及生長情況，10 d計(jì)算發(fā)芽勢、28 d計(jì)算發(fā)芽率，并測量胚芽和胚根長度，計(jì)算出發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)。

發(fā)芽勢=(10 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率=(24 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=Σ(在不同時(shí)間的發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽日數(shù))；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×胚芽長度。

1.2.2 幼苗生長、鎘積累及生理特性試驗(yàn)

幼苗盆栽試驗(yàn)：將配置好的濃度為108mL-1(根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定)的哈茨木霉提取液混入無菌土中，每500 g無菌土加入200 mL哈茨木霉菌提取液，將草地早熟禾種子播種于土中(T處理)，同時(shí)設(shè)置土壤中加200 mL蒸餾水為對(duì)照組(C)。28 d后補(bǔ)加一次哈茨木霉菌提取液，再培養(yǎng)28 d后進(jìn)行Cd2+處理。Cd2+濃度為0(CK)、10、40、80和100 mg·L-1，每處理3個(gè)重復(fù)，每盆100 mL Cd溶液。處理7和14 d后分別取樣，測定草地早熟禾幼苗的株高、生物量、各項(xiàng)生理指標(biāo)和鎘含量。脯氨酸含量參照高俊鳳的測定方法；可溶性蛋白含量的測定參照G250法；丙二醛含量的測定參照硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶(SOD)的測定采用氮藍(lán)四唑法；過氧化物酶(POD)的測定采用愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫(CAT)的測定采用過氧化氫法；鎘含量的測定采用原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2019整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)、繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

由表2可知，隨著Cd2+濃度增大，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢降低，且發(fā)芽勢受到抑制程度大于發(fā)芽率。哈茨木霉菌浸種(T)組相對(duì)于未浸種(C)組，發(fā)芽率和發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在各濃度Cd2+處理下均升高。

由圖1可知，隨著Cd2+濃度的增加，草地早熟禾種子的胚芽長、胚根長均顯著降低，且T組相對(duì)于C組，種子的胚芽長在各Cd2+處理下均升高，胚根長度除400 μmol·L-1濃度差異不明顯外，其他組同樣升高。

2.2 哈茨木霉對(duì)鎘處理下草地早熟禾植株生長的影響

由表3可知，隨著Cd2+濃度的升高，幼苗的株高呈降低趨勢，且T組相對(duì)于C組，株高在不同濃度Cd2+處理下均升高。Cd2+處理7 d，各Cd2+濃度處理下T組株高比C組分別增長了5.29、7.87、9.22、8.14和8.41 cm；Cd2+處理14 d，T組比C組分別增長了5.84、8.28、8.79、8.75和7.32 cm。

表2 哈茨木霉對(duì)Cd2+脅迫下草地早熟禾種子萌發(fā)的影響

柱上無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2～4同。圖1 哈茨木霉對(duì)鎘脅迫草地早熟禾胚芽、胚根長度的影響

表3 哈茨木霉菌對(duì)Cd2+脅迫下草地早熟禾株高及生長量的影響

幼苗地上部分生物量的變化規(guī)律總體看，一定濃度的Cd2+對(duì)其有促進(jìn)作用，且在低濃度下，T組數(shù)值高于C組。地下部分生物量隨Cd2+濃度升高而降低。各Cd2+處理下T組比C組分別增長了6.7、10.8、19.4、19.9和38.3 mg；處理14 d時(shí)，各Cd2+處理下T組比C組分別增長了13.6、18.4、13.2、12.4和8.7 mg。

2.3 哈茨木霉菌對(duì)鎘處理下草地早熟禾生理特性的影響

由表4可知，隨著Cd2+濃度的升高，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均呈降低趨勢。Cd2+處理7 d，各Cd2+濃度處理下T組葉綠素a比C組分別增加了0.04、0.07、0.11、0.19和0.20 mg·g-1；葉綠素b含量增加了0.11、0.31、0.34、0.32和0.33 mg·g-1；葉綠素總含量分別增加了0.15、0.39、0.44、0.50和0.53 mg·g-1。Cd2+處理14 d，各濃度Cd2+處理下，T組相較于C組葉綠素a含量增加，但葉綠素b和總?cè)~綠素含量減少。

脯氨酸和可溶性蛋白是植物在逆境下產(chǎn)生的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。由圖2可知，隨著Cd2+濃度的升高，脯氨酸含量增加，且T組脯氨酸含量高于C組。Cd2+處理7 d，各Cd2+濃度處理下T組脯氨酸含量比C組分別增加了79.91、104.37、119.95、115.71和119.87 μg·g-1；Cd2+處理 14 d，T組較C組分別增加了47.15、39.00、41.39、89.02和92.54 μg·g-1。

表4 哈茨木霉菌對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾葉綠素含量的影響

圖2 哈茨木霉對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾脯氨酸、可溶性蛋白含量的影響

隨著Cd2+濃度的升高，可溶性蛋白含量減少。在無Cd2+處理時(shí)，T組低于C組，在各組Cd2+處理時(shí)，T組高于C組。Cd2+處理7 d，各Cd2+濃度處理下T組可溶性蛋白含量比C組分別增加了0.62、1.56、1.54和0.69 mg·g-1；Cd2+處理14 d，T組較C組分別增加了0.13、0.12、0.08和0.11 mg·g-1。

丙二醛(MDA)為膜脂過氧化產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。圖3結(jié)果顯示，Cd2+濃度越大，葉片MDA含量越大，且T組均低于C組。Cd2+處理7 d，各Cd2+濃度處理下T組MDA含量比C組分別減少了0.45、0.11、0.43、0.65和0.83 mg·g-1；Cd2+處理14 d，T組較C組分別減少了0.81、0.90、0.64、1.58和1.43 mg·g-1。

在逆境下，植物體內(nèi)可產(chǎn)生大量的活性氧，而保護(hù)酶系統(tǒng)可以起到清除活性氧的作用。由圖4可知，隨著Cd2+濃度的增加，SOD和CAT活性先升高后降低，POD活性呈逐漸升高。在Cd2+處理7 d后，除Cd2+濃度為80 mg·L-1外，其他各Cd2+濃度下T組SOD活性較C組升高；Cd2+處理14 d后，比較T與C處理組SOD活性在低Cd2+濃度下升高，高Cd2+濃度下差異不明顯。Cd2+處理7 d和14 d后，在各Cd2+濃度下，T組POD活性較C組POD活性均降低。Cd2+處理7 d后，40 mg·L-1Cd2+處理下CAT活性最大，且Cd2+濃度為80和100 mg·L-1時(shí)，T組較C組分別減少1.67、3.93 U·g-1；Cd2+處理14 d，T組較C組CAT活性增加。

2.4 哈茨木霉菌對(duì)鎘處理下草地早熟禾鎘轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

由表5可知，草地早熟禾地上部所吸收的Cd含量隨著Cd2+處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長而增加，且T組含量均高于C組。Cd2+處理7 d，各Cd2+濃度處理下T組Cd含量比C組分別增加了1.24、0.78、2.71、2.10和4.26 mg·kg-1；Cd2+處理14 d，除40 mg·L-1Cd2+處理T組與C組無明顯差異外，其他組處理下T組比C組分別增加了0.32、1.62、1.37和2.46 mg·kg-1。

圖3 哈茨木霉菌對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾MDA含量的影響

圖4 哈茨木霉菌對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾抗氧化系統(tǒng)活性的影響

C組草地早熟禾地下部所吸收的Cd含量隨著Cd2+處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長而增加；T組地下部所吸收的Cd含量隨著Cd2+處理濃度的增加先增加后減少；隨處理時(shí)間的延長而增加。100 mg·L-1Cd2+處理時(shí)，T組地下部Cd含量低于C組。鎘脅迫會(huì)降低早熟禾Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)，施加哈茨木霉菌會(huì)增加早熟禾Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)。處理7 d時(shí)，0、10、40、80和100 mg·L-1Cd2+處理時(shí)T組比C組增加了0.25、0.04、0.09、0.02和0.09；處理14 d時(shí)，各組Cd2+處理時(shí)T組比C組增加了0.19、0.05、0.01、0.01和0.05。

表5 哈茨木霉對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾Cd含量的影響

3 小結(jié)與討論

哈茨木霉作為一種重要的生防菌，對(duì)多種植物具有促生效果[20]。眾多研究結(jié)果顯示，經(jīng)低濃度哈茨木霉處理后種子的發(fā)芽率有不同程度的提高，濃度升高時(shí)促進(jìn)作用變?nèi)鮗21-22]。木霉菌可以產(chǎn)生一些生物調(diào)節(jié)類物質(zhì)，如赤霉素、生長激素等，赤霉素可以增加種子萌發(fā)過程中可溶性糖和可溶性蛋白的含量，從而促進(jìn)生長[23]。有研究還發(fā)現(xiàn)，使用康寧霉素浸種可減少種子內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)外滲，保留種子內(nèi)部營養(yǎng)充足，供種子萌發(fā)過程使用[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為106mL-1的哈茨木霉菌對(duì)促進(jìn)草地早熟禾種子的萌發(fā)和生長最為有效，濃度超過106mL-1對(duì)發(fā)芽率的促進(jìn)作用減弱，這與前人研究結(jié)果一致。在鎘脅迫下，隨著Cd2+濃度的升高，草地早熟禾種子的發(fā)芽率呈顯著降低的趨勢，且T組較C組的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均增加，說明哈茨木霉菌浸種可以在一定程度上減輕Cd抑制的種子萌發(fā)過程。試驗(yàn)還表明，草地早熟禾種子的胚芽、胚根受鎘脅迫的抑制，隨著Cd2+濃度的升高抑制作用增強(qiáng)，且對(duì)胚根的抑制作用大于胚芽。而哈茨木霉菌可以起到緩解鎘脅迫對(duì)草地早熟禾的毒害作用。

鎘對(duì)植物形態(tài)和生理代謝具有嚴(yán)重的毒害作用[25]。諸多研究表明，鎘對(duì)植物的影響呈“低促高抑”的現(xiàn)象，低濃度可以促進(jìn)植物的生長，但當(dāng)鎘含量過高時(shí)，會(huì)抑制植物生長，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)出現(xiàn)植株矮小萎黃、根系死亡、生物量減少等癥狀[26-27]。本研究結(jié)果顯示，隨著鎘脅迫強(qiáng)度及脅迫時(shí)間增加，草地早熟禾植株株高呈下降趨勢，相較于C組，T組可以緩解鎘脅迫的抑制作用，使株高增加。鎘脅迫對(duì)草地早熟禾植株地上生物量、地下生物量的影響有差異，T組在低濃度Cd2+處理時(shí)地上生物量高于C組。地下部分生物量隨著Cd2+濃度增加而降低，且T組較C組增高。從上述結(jié)果可以看出，哈茨木霉菌對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾的生長有一定的促進(jìn)作用。

光合作用是植物轉(zhuǎn)化光能為化學(xué)能的基礎(chǔ)生理活動(dòng)，葉綠素具有捕捉和傳遞光能的作用[28]，是光合作用的關(guān)鍵色素，其含量多少在一定程度上標(biāo)志著植物生長能力的強(qiáng)弱[29]。本研究結(jié)果顯示，處理7 d后，隨著Cd2+濃度升高草地早熟禾植株的葉綠素各指標(biāo)降低，T組含量高于C組；隨著處理時(shí)間增長到14 d時(shí)，T組的葉綠素b含量降低并低于C組，說明哈茨木霉菌可以緩解鎘脅迫短時(shí)間內(nèi)造成的草地早熟禾植株的光合色素的下降。

細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是一類具有維持細(xì)胞平衡作用的物質(zhì)，主要包括游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等[30]。逆境條件會(huì)使植物中脯氨酸含量顯著增加，當(dāng)逆境持續(xù)加重時(shí)，會(huì)致使植株內(nèi)脯氨酸含量減少，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)致使植株死亡，所以通過植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的變化情況觀察植物的抗逆性強(qiáng)弱[31]?？扇苄缘鞍椎姆e累可以防止植物細(xì)胞水分的流失，進(jìn)而增強(qiáng)植物抗逆性；可溶性蛋白還可以充當(dāng)各種生理代謝過程所需的酶類，植物體在逆境條件下，也會(huì)消耗大量的可溶性蛋白來激活抗氧化系統(tǒng)，使植物抵御傷害[32]。本試驗(yàn)顯示，草地早熟禾植株脯氨酸含量隨著Cd2+濃度的增加和脅迫時(shí)間的增長而增加，且T組高于C組；可溶性蛋白含量則隨Cd2+濃度增加和脅迫時(shí)間增長而減少，且T組同樣高于C組。說明哈茨木霉菌可以增強(qiáng)鎘脅迫下草地早熟禾的滲透調(diào)節(jié)能力。

植物對(duì)鎘的吸收能力是有限度的，當(dāng)外界鎘濃度超過植物本身能承受的濃度時(shí)，植物將減少對(duì)鎘的吸收[37]。卜和申等[38]發(fā)現(xiàn)，鎘污染土壤中分離的哈茨木霉菌可以通過細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)吸附Cd2+，產(chǎn)生IAA類物質(zhì)，促進(jìn)植物生長，并可提高植物吸收Cd2+的能力，使Cd2+向地上部分轉(zhuǎn)移，從而降低土壤中的鎘含量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，草地早熟禾地上部分Cd2+含量隨著Cd2+濃度的增加而增加，且處理時(shí)間越長積累的越多，T組積累量比C組增多。地下部分Cd2+含量隨著Cd2+濃度增加大致呈增加趨勢，且0～80 mg·L-1時(shí)，T組Cd含量較C組增高。轉(zhuǎn)移系數(shù)可以反映植物根部從土壤中吸收重金屬后從地下向上轉(zhuǎn)運(yùn)能力的強(qiáng)弱，轉(zhuǎn)移系數(shù)越大，轉(zhuǎn)運(yùn)能力越強(qiáng)[39]。施加哈茨木霉菌可以增加Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)，處理7 d時(shí)，Cd2+濃度為40 mg·L-1時(shí)轉(zhuǎn)移系數(shù)增長最多，處理14 d時(shí)，Cd2+濃度為10 mg·L-1時(shí)轉(zhuǎn)移系數(shù)增長最多。這說明哈茨木霉在較低Cd2+濃度范圍內(nèi)可以增強(qiáng)草地早熟禾對(duì)鎘的積累和轉(zhuǎn)運(yùn)，并且通過多種生理效應(yīng)保證植株正常生長，這對(duì)于增強(qiáng)鎘污染土壤的植物修復(fù)效果具有重要的意義。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，哈茨木霉浸種能夠減輕鎘脅迫對(duì)草地早熟禾種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制作用；哈茨木霉也可以通過提高Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力，減少Cd對(duì)植株根系的直接傷害，緩解鎘脅迫對(duì)草地早熟禾生長的抑制作用，并可以通過降低葉綠素破壞、減少M(fèi)DA積累，增強(qiáng)抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高草地早熟禾對(duì)Cd的抗性。