倪以宇，趙大慶，倪偉鋒，曾婧，白竹林，王思明

(長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春，130117)

葛根(PuerariaelobataeRadix)是豆科植物野葛的干燥塊根，枳椇子為鼠李科枳椇屬植物枳椇(HoveniaacerbaLindl.)的肉質(zhì)果柄和干燥成熟的種子?；谖墨I(xiàn)記載[1-5]，大都認(rèn)為黃酮類化合物是解酒保肝的主要活性成分，而葛根、枳椇子中均含有豐富的黃酮類化合物，如葛根素、大豆苷元、二氫楊梅素和槲皮素等活性成分[1-2]，其中從葛根、枳椇子中提取的黃酮化合物可以通過抑制體內(nèi)對乙醇的吸收加速代謝以降低體內(nèi)血醇濃度并增加體內(nèi)抗氧化能力，從而達(dá)到解酒保肝的作用[2-3]。葛根、枳椇子等為藥食同源的傳統(tǒng)解酒毒藥物[4]，也是在臨床應(yīng)用、保健品、普通食品等方面最常采用的藥物組合之一[5-6]。早在四千余年前，中國就利用微生物發(fā)酵進(jìn)行釀酒、制醬醋，在此基礎(chǔ)上加入中藥材，形成了最早形式的中藥發(fā)酵工藝[7]。結(jié)合目前研究進(jìn)展，通過微生物發(fā)酵確實(shí)能對部分藥材起到減毒增效[8-9]的作用。

本文以葛根-枳椇子為原料，采用課題組前期所優(yōu)選最適的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)這2種可用于普通食品的菌種，探究植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合發(fā)酵對提升葛根和枳椇子解酒功效的影響，確定發(fā)酵工藝。開發(fā)出因發(fā)酵而達(dá)到“增效”的高活性、高解酒能力的解酒護(hù)肝的功效型產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葛根，安國市安興中藥飲片有限公司(經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王哲副教授鑒定為來源于豆科植物野葛的干燥塊根)；枳椇子，河北仁心藥業(yè)有限公司(經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王哲副教授鑒定為來源于鼠李科枳椇屬植物枳椇的成熟種子)；MRS肉湯培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；56°紅星二鍋頭，北京紅星股份有限公司；葛根五味子片，廣東現(xiàn)代漢方科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純)；植物乳桿菌(Lac-tobacillusplantarum)：CGMCC1.568、副干酪乳桿菌(Lac-tobacillusparacasei)：CGMCC1.2468，中國普通微生物菌種保藏管理中心；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒，上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級ICR小鼠，雄性，4周齡，個體質(zhì)量(20±2) g，購自長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK(吉)-2020-0002)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2) ℃，相對濕度為40%～60%，光照、黑暗各12 h。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-700蒸汽滅菌器，日本TomyDigitalBiology公司；KQ-600E超聲清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQPW-70全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葛根-枳椇子發(fā)酵工藝流程

基于課題組前期試驗(yàn)篩選，采用固體發(fā)酵的方式[7],工藝流程如下：

葛根-枳椇子→粉碎過80目篩網(wǎng)→混合放入100 mL錐形瓶中→分別加入40 mL(料液比1∶4)MRS培養(yǎng)基→(121 ℃，20 min)滅菌→冷卻至室溫

1.3.2 發(fā)酵菌液制備

取液氮中甘油凍藏的植物乳桿菌和副干酪乳桿菌，解凍后接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行活化[1%(體積分?jǐn)?shù))總接種量、37 ℃、200 r/min]，活化2遍，活化完成。根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)所需要的不同發(fā)酵條件接種到葛根-枳椇子中發(fā)酵(37 ℃、200 r/min)[10]。

1.3.3 提取方式篩選

使用水提、醇提這兩種常規(guī)提取方法，基于《太平惠民和劑局方》記載，葛根-枳椇子常用質(zhì)量比為1∶1。水提:葛根-枳椇子加水煎煮1 h，3 500 r/min離心10 min后過絹布去藥渣，加95%(體積分?jǐn)?shù))食用乙醇至提取液中，配制成含40%(體積分?jǐn)?shù))乙醇的溶液，醇沉12 h后過絹布去渣滓[11-13]，揮醇濃縮為0.15 g/mL(生藥濃度)的濃縮液；醇提:葛根-枳椇子加入6倍于生藥量的60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，水浴80 ℃，回流提取1 h，后過絹布去渣滓，80 ℃揮醇，濃縮為0.21 g/mL(生藥濃度)的濃縮液。通過解酒防醉實(shí)驗(yàn)來比較不同提取方式對解酒防醉效果的影響[14]。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

起始條件是pH值6.5、接種比例(體積比)(植∶副)=1∶1、總接種量5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、發(fā)酵時間72 h，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同起始條件pH值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)，接種比例(體積比)(植∶副)(1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1)、總接種量(2%、3%、4%、5%、6%、8%)(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，發(fā)酵時間(24、36、48、60、72、84 h)對黃酮含量和醉酒醒酒時間的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以pH值(A)、總接種量(B)、發(fā)酵時間(C)、接種比例(植∶副)(D)為試驗(yàn)因素，以黃酮含量(R)和醉醒酒時間(S)為評價指標(biāo)，運(yùn)用L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)配合多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法，優(yōu)選出最佳的發(fā)酵工藝，方差分析因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.6 解酒防醉實(shí)驗(yàn)

取SPF級ICR雄性小鼠若干只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按照單因素試驗(yàn)條件隨機(jī)分為模型組、不發(fā)酵提取液組、空白發(fā)酵組(不加藥材只加菌)、發(fā)酵提取液組(不同起始條件的發(fā)酵提取液)，禁食不禁水12 h后，給藥組分別灌胃相應(yīng)藥物(0.075 mL/10g)，模型組灌胃等劑量純水。30 min后，每組各灌胃56°白酒(0.125 mL/10g)，分別觀察并記錄每組小鼠醉酒潛伏期(灌酒-翻正反射消失的時間)和醒酒時間(翻正反射消失-翻正反射恢復(fù)的時間)[14-15]。

1.3.7 生物指標(biāo)檢測

1.3.7.1 預(yù)處理

取適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后SPF級ICR雄性小鼠70只，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對照組(葛根五味子片)、葛根-枳椇子不發(fā)酵組、葛根-枳椇子發(fā)酵組(低、中、高劑量)，空白組和模型組純水(0.15 mL/10g)灌胃，其他給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃陽性組(5 mg/10g)、不發(fā)酵組(15 mg/10g)、葛根-枳椇子發(fā)酵提取液低劑量組(7.6 mg/10g)、葛根-枳椇子發(fā)酵提取液中劑量組(15 mg/10g)、葛根-枳椇子發(fā)酵提取液高劑量組(23 mg/10g)，30 min后，除空白組灌胃純水外，其他組均灌胃56°酒(0.08 mL/10g)，連續(xù)8 d[16-18]。灌酒30 min后取血，脊椎脫臼法處死小鼠，解剖取肝臟，在預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，用生理鹽水洗凈后，清除水分，錫紙包裹，凍入液氮[19]。

1.3.7.2 小鼠血清指標(biāo)檢測

末次給藥后，摘眼球取血，4 ℃靜置30 min，4 ℃離心(3 000 r/min、10 min)，取上清液得血清，參照試劑盒說明書測定7組小鼠血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α等指標(biāo)。

1.3.7.3 肝臟勻漿指標(biāo)檢測

稱取0.1 g肝臟組織，加入9倍體積的生理鹽水，在預(yù)冷的研缽中充分研磨制成勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液得10%組織勻漿，參照試劑盒說明書測定7組小鼠肝臟中SOD水平。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SE)表示；采用GraphPad Prism 8.0.1進(jìn)行誤差分析和差異顯著性分析以及繪圖；用IBM SPSS Statistics 21.0設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法比較

由圖1可知，使用醇提取的藥液延長醉酒潛伏時間的效果優(yōu)于水提取的藥液，并且使用醇提取的藥液縮短翻正反射恢復(fù)時間的效果也優(yōu)于水提取的藥液。推測原因可能是大部分黃酮類化合物相對于水而言，用有機(jī)溶劑更容易提取出來。因此，試驗(yàn)最佳的提取方法是醇提。

a-解酒潛伏時間；b-翻正反射恢復(fù)時間圖1 不同提取方法對解酒防醉時間的影響Fig.1 Effect of different extraction methods on anti drunkenness time

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 起始pH和總接種量對黃酮含量的影響

由圖2可知，隨起始pH值和總接種量升高黃酮含量先升高后降低，在pH為6.5時黃酮含量最高。原因可能是，強(qiáng)酸弱酸都會抑制乳酸菌的生長代謝；而總接種量達(dá)到3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))之后黃酮含量與總接種量呈反比例關(guān)系，推測原因可能是菌密度過大，乳酸菌的繁殖代謝等活動受到生長空間等因素的影響而衰減。

a-pH值；b-總接種量圖2 pH值和總接種量對黃酮含量的影響Fig.2 Effects of pH value and total inoculation amount on favonoids content

2.2.2 發(fā)酵時間和接種比例對黃酮含量的影響

由圖3可知，黃酮含量在48 h時最高，在過了峰值48 h之后與發(fā)酵時間呈負(fù)相關(guān)，原因可能是在48 h 前乳酸菌處于生長期，過了48 h生長過盛，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供不應(yīng)求，使黃酮含量降低；當(dāng)兩種菌株接種比例過高或者過低時，黃酮含量都比較低，接種比例(體積比)(植∶副)=1∶2時，黃酮含量最高。

a-發(fā)酵時間;b-接種比例圖3 發(fā)酵時間和接種比例對黃酮含量的影響Fig.3 Effects of fermentation time and inoculation ratio on flavonoids content

2.2.3 起始pH對醉酒醒酒時間的影響

由表2可知，延長醉酒潛伏時間的效果隨起始pH的升高呈先升高再降低的趨勢，在pH為6.5時達(dá)到峰值；縮短翻正反射恢復(fù)時間的效果隨起始pH值的升高呈先降低再升高的趨勢，在pH為4.5時達(dá)到峰值。

表2 pH值對醉酒醒酒時間的影響Table 2 Effect of pH value on sobering time

2.2.4 乳酸菌總接種量對醉酒醒酒時間的影響

由表3可知，延長醉酒潛伏時間的效果在總接種量在3%之前逐漸上升，在6%達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢；縮短翻正反射恢復(fù)時間的效果隨總接種量的升高呈降低的趨勢，在總接種量為2%時達(dá)到峰值。

表3 總接種量對醉酒醒酒時間的影響Table 3 Effect of total inoculum volume on drunken waking time

2.2.5 發(fā)酵時間對醉酒醒酒時間的影響

由表4可知，延長醉酒潛伏時間的效果在48 h達(dá)到峰值；縮短翻正反射恢復(fù)時間的效果與發(fā)酵時間呈反比例關(guān)系，在發(fā)酵時間為36 h時達(dá)到峰值。

表4 發(fā)酵時間對醉酒醒酒時間的影響Table 4 Effect of fermentation time on drunkenness and sobering time

2.2.6 接種比例對醉酒醒酒時間的影響

接種比例對延長醉酒潛伏時間的影響如表5所示，結(jié)果表明，植物乳桿菌與副干酪乳桿菌比例在2∶1時效果最好，乳桿菌(植∶副)接種比例=1∶1時，縮短翻正反射恢復(fù)時間的效果最好。

表5 接種比例對醉酒醒酒時間的影響Table 5 Effect of inoculation proportion on drunkenness and sobering time

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以起始pH值(A)、總接種量(B)、發(fā)酵時間(C)、接種比例(植∶副)(D)為評價因素，根據(jù)因素影響發(fā)酵工藝效果的重要程度分配權(quán)重系數(shù)。即黃酮含量(W1)的權(quán)重系數(shù)為0.7，醉酒潛伏期(W2)的權(quán)重系數(shù)為0.15，醒酒時間(W3)的權(quán)重系數(shù)率為0.15進(jìn)行加權(quán)求和，綜合加權(quán)評價結(jié)果見表6和表7[20]。

表6 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of fermentation conditions

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 7 Analysis of variance of orthogonal test results

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析，發(fā)酵工藝影響黃酮含量的主次因素為C(發(fā)酵時間)>A(pH值)>B(總接種量)>D(接種比例)，以黃酮含量為主要指標(biāo)發(fā)酵條件的最佳組合是A3B1C1D3。即最佳發(fā)酵工藝為pH 7，總接種量2%，接種比例(植:副)2∶1，發(fā)酵時間36 h。方差分析結(jié)果顯示，A、B和C因素起始pH值、總接種量和發(fā)酵時間顯著(P<0.05)影響黃酮含量，D因素接種比例對黃酮含量影響不顯著(P>0.05)。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

最佳條件下，進(jìn)行平行試驗(yàn)3次，黃酮含量依次為3.627、3.698、3.760 mg/g，平均值為3.70 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)1.8%(RSD<5%)，較發(fā)酵前提升了33%，故此發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)合理。

2.5 血清指標(biāo)檢測

如圖4所示，根據(jù)給藥8 d后小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶水平的檢測，與空白組相比，連續(xù)灌胃酒精8 d后的模型組的小鼠血清中ALT、AST活性極顯著升高,IL-6、TNF-α含量顯著和極顯著升高(P<0.05和P<0.01)，表明酒精性肝損傷造模成功；與模型組相比，灌胃陽性藥和葛根-枳椇子高劑量發(fā)酵提取液的小鼠血清AST活性極顯著降低(P<0.01)；灌胃陽性藥、葛根-枳椇子低、中、高劑量發(fā)酵提取液的小鼠血清ALT活性極顯著降低(P<0.01)；灌胃不發(fā)酵提取液和葛根-枳椇子低、中、高劑量發(fā)酵提取液的小鼠血清IL-6含量極顯著降低(P<0.01)；灌胃陽性藥、不發(fā)酵提取液、葛根-枳椇子低、中、高劑量發(fā)酵提取液的小鼠血清TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)，表明葛根-枳椇子發(fā)酵提取液能減輕酒精對肝臟的損傷，其中葛根-枳椇子發(fā)酵提取液效果均優(yōu)于不發(fā)酵組，且高劑量組效果最優(yōu)。

a-AST；b-ALT；c-IL-6；d-TNF-α圖4 小鼠血清AST、ALT活性檢測及IL-6、TNF-α含量檢測結(jié)果Fig.4 Detection of serum AST and ALT activities and IL-6 and TNF-α in mice Content test results注：#P<0.05表示與空白組比較，具有顯著性差異，##P<0.01表明與空白組比較，具有極顯著性差異；*P<0.05表示與模型組比較，具有顯著性差異，**P<0.01表明與模型組比較，具有極顯著性差異(下同)

2.6 肝臟SOD活力檢測

如圖5所示，根據(jù)給藥8 d后小鼠肝臟的抗氧化酶水平的檢測，與空白組相比，連續(xù)酒精灌胃8 d后的模型組的小鼠肝臟SOD活性極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，灌胃陽性藥和葛根-枳椇子低、中、高劑量發(fā)酵提取液的小鼠肝臟SOD活性顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中葛根-枳椇子發(fā)酵提取液效果均優(yōu)于不發(fā)酵組，且高劑量組效果最優(yōu)。

圖5 小鼠肝臟SOD活力檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of SOD activity in mouse liver

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用兩種可用于普通食品的乳酸菌(植物乳桿菌、副干酪乳桿菌)混合發(fā)酵葛根-枳椇子，考察其發(fā)酵前后黃酮含量變化的同時還運(yùn)用多指標(biāo)加權(quán)評分法對小鼠耐酒醒酒時間的變化進(jìn)行分析，使其可行性更高。由優(yōu)化發(fā)酵工藝條件的正交試驗(yàn)結(jié)果得，葛根-枳椇子的最佳發(fā)酵工藝條件為pH 7，總接種量2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，接種比例(體積比)(植∶副)2∶1，發(fā)酵時間36 h。與發(fā)酵前比較，黃酮含量提升了33%；與模型組比較，發(fā)酵前后的醉酒潛伏時間分別延長了64.7%和51.7%，發(fā)酵前后的翻正反射恢復(fù)時間提前了29.2%和37.1%，減輕了肝損傷引起的小鼠血清中AST、ALT、IL-6和TNF-α水平升高，同時提升了小鼠肝臟的SOD活力。結(jié)果表明，與發(fā)酵前相比，兩種菌混合發(fā)酵后的藥物確實(shí)顯著提高了解酒護(hù)肝的功效(P<0.05)?？梢?，葛根-枳椇子的混合發(fā)酵可以提升藥物中黃酮類化合物的含量，加強(qiáng)解酒能力，極大程度的改善由酒精導(dǎo)致的肝損傷。基于文獻(xiàn)大都認(rèn)可黃酮是解酒保肝的主要活性成分，因此我們主要對黃酮類化合物的成分變化來進(jìn)行研究，其成分分析也是我們下一階段將進(jìn)行的研究。