王春曉，陳玉婷，楊金仙,2，陳秋竹，韋旭衛(wèi)

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽，550025)2(共青科技職業(yè)學(xué)院，江西 九江，332020)

中國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)因地理位置和氣候條件差異，目前已經(jīng)形成了東北產(chǎn)區(qū)、山東產(chǎn)區(qū)、京津冀產(chǎn)區(qū)、新疆產(chǎn)區(qū)、河西走廊產(chǎn)區(qū)等十一大葡萄酒產(chǎn)區(qū)[1]，不同產(chǎn)區(qū)的風(fēng)土條件與所釀造葡萄酒的區(qū)域特色息息相關(guān)[2]。作為風(fēng)土條件之一的微生物風(fēng)土近年來受到越來越多研究者的重視[3-4]，中國(guó)不同產(chǎn)區(qū)均開展了野生酵母資源的調(diào)查分析，并研究篩選優(yōu)秀酵母菌株用于提升葡萄酒的風(fēng)味特色[3,5-8]。目前已經(jīng)商業(yè)化應(yīng)用的中國(guó)本土野生釀酒酵母為CEC01和CECA，由劉延琳課題組篩選自寧夏和新疆葡萄酒產(chǎn)區(qū)。在產(chǎn)區(qū)野生酵母資源調(diào)查的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)不同野生酵母資源對(duì)釀造中國(guó)不同產(chǎn)區(qū)特色葡萄酒具有重要意義。野生酵母資源商業(yè)化始于野生酵母資源的分離鑒定，需要全面分析其發(fā)酵特性(如糖代謝、乙醇代謝、絮凝性、嗜殺性和耐受性等)和釀造特色(如影響葡萄酒口感、香氣、不良風(fēng)味和安全性等的物質(zhì)代謝)，而優(yōu)選的野生酵母完成商業(yè)化的最終分析因素為商業(yè)菌劑的加工研究[9-10]，本文主要綜述了野生酵母商業(yè)化研究需要分析的4個(gè)主要研究?jī)?nèi)容(圖1)，為中國(guó)優(yōu)選野生酵母菌的商業(yè)化應(yīng)用提供理論參考。

1 野生酵母的分離鑒定研究

葡萄酒野生酵母大多分離自成熟葡萄果實(shí)或葡萄醪自然發(fā)酵過程中(圖1)，通過依賴于培養(yǎng)的分子鑒定技術(shù)可將分離出的野生酵母菌鑒定至菌種水平[3](如用WL培養(yǎng)基分離和初步鑒定酵母菌，并進(jìn)一步采用26S rRNA基因序列分析和5.8S-ITS-RFLP分析開展菌種水平分子鑒定)，通過不依賴于培養(yǎng)的高通量測(cè)序技術(shù)或?qū)崟r(shí)定量PCR技術(shù)可快速獲知不同酵母菌種(屬)的相對(duì)豐度或菌群濃度[11]。部分研究采用特定篩選培養(yǎng)基分離獲取目的野生酵母菌，如采用高乙醇培養(yǎng)基獲取耐乙醇的釀酒酵母等。目前大部分野生酵母的顯微形態(tài)和生理特征(主要指碳源同化和發(fā)酵能力、部分氮源同化和發(fā)酵能力、適宜培養(yǎng)溫度等)已得到系統(tǒng)研究，分類鑒定序列特征(主要指26S rRNA的D1/D2基因序列和5.8S rRNA的ITS基因序列)較為清晰，倍性特征僅局限于酵母屬酵母，非酵母屬酵母的有性生殖數(shù)據(jù)相對(duì)較少[12-13]。依賴于培養(yǎng)的野生酵母分離鑒定研究是優(yōu)良酵母菌商業(yè)化研究的首要步驟，為進(jìn)一步篩選具有優(yōu)良發(fā)酵特性和釀酒特色的野生酵母菌提供了豐富的酵母菌資源。

2 野生酵母的發(fā)酵特性研究

野生酵母的糖代謝能力和產(chǎn)酒精能力是其良好發(fā)酵力的保證，也是發(fā)酵特性研究中必要的篩選因素，而對(duì)嗜殺性和絮凝性等性能的研究有利于葡萄酒發(fā)酵過程中對(duì)不良微生物的控制以及葡萄酒的澄清，是滿足葡萄酒質(zhì)量的基本保證[14]。葡萄酒酒精發(fā)酵初期環(huán)境為高糖環(huán)境且大多進(jìn)行了一定濃度的SO2處理，隨著發(fā)酵的進(jìn)行乙醇濃度逐漸提升，因此酒精發(fā)酵并非酵母菌最適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，具有優(yōu)良發(fā)酵特性的酵母菌還需具備一定的發(fā)酵環(huán)境耐受性，從而更好地在發(fā)酵過程中發(fā)揮作用[15]。

2.1 糖代謝和產(chǎn)酒精能力研究

酵母菌的發(fā)酵力主要表征為糖代謝能力和產(chǎn)酒精能力，釀酒酵母主要將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，因此其糖代謝能力和產(chǎn)酒精能力相對(duì)一致，但對(duì)于非酵母屬酵母而言，發(fā)酵完全主要表征為可將還原糖代謝至4 g/L以下，較高代謝副產(chǎn)物的生成導(dǎo)致其產(chǎn)酒精能力弱于釀酒酵母。

乙醇是葡萄酒中的重要成分，品嘗時(shí)會(huì)帶來灼熱感，乙醇過高會(huì)掩蓋葡萄酒的果香味，增強(qiáng)葡萄酒的干燥和粗糙感，乙醇過低則會(huì)使葡萄酒的口味不足，因此乙醇含量直接影響葡萄酒酒體結(jié)構(gòu)的平衡。酵母菌產(chǎn)酒精能力可通過TTC培養(yǎng)基進(jìn)行初步評(píng)價(jià)[14]，大多數(shù)研究采用直接發(fā)酵并測(cè)量葡萄酒發(fā)酵液中乙醇含量的方式篩選具有優(yōu)良產(chǎn)酒能力的酵母菌(密度瓶法、氣相色譜法、酒精計(jì)法，GB 5009.225—2016)[16]。生物量生成、物質(zhì)消耗和乙醇生成過程中熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析可為糖代謝和產(chǎn)酒精能力的評(píng)價(jià)提供定量化監(jiān)測(cè)指標(biāo)[17]。

全球氣候變暖使部分產(chǎn)區(qū)成熟葡萄中糖含量升高，最終會(huì)導(dǎo)致葡萄酒中乙醇含量的提升，健康的生活理念以及某些國(guó)家以乙醇含量來定稅使得葡萄酒降醇逐漸成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。降醇策略一方面圍繞釀酒酵母展開，通過篩選低產(chǎn)乙醇釀酒酵母(可降低1%vol及以上)或采用降低乙醇的發(fā)酵工藝如發(fā)酵初期通過短期通風(fēng)促進(jìn)釀酒酵母有氧呼吸作用等[18]。另一方面圍繞非酵母屬酵母展開，非酵母屬酵母通過產(chǎn)生大量次級(jí)代謝產(chǎn)物和呼吸作用來降低葡萄酒中的乙醇含量[19]，將非釀酒酵母與釀酒酵母共同接種發(fā)酵(同時(shí)接種或順序接種)降低葡萄酒中乙醇的含量已成為一種戰(zhàn)略性降醇手段[2]。

2.2 與發(fā)酵特性相關(guān)的絮凝性和嗜殺性等研究

1963年MAKOWER和BEVAN首次在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了嗜殺因子，嗜殺因子是酵母菌分泌的蛋白質(zhì)類抗菌化合物，可在發(fā)酵過程中部分代替SO2控制不良雜菌的生長(zhǎng)。不同酵母菌分泌酵母毒素不同，因此對(duì)野生酵母的抑制具有菌株特異性[20]，釀酒酵母嗜殺性多指其在美藍(lán)培養(yǎng)基上表現(xiàn)出的對(duì)其他釀酒酵母產(chǎn)生的抑菌圈，近年來釀酒酵母還展現(xiàn)了其所產(chǎn)毒素對(duì)非酵母屬酵母的生存抑制作用，但在美藍(lán)培養(yǎng)基上釀酒酵母對(duì)非酵母屬酵母大多不產(chǎn)生抑菌圈[20]。非酵母屬酵母也可分泌毒素如假絲酵母中分離的CpKT1和CpKT2可抑制酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)的生長(zhǎng)，但不影響釀酒酵母和乳酸菌的生長(zhǎng)代謝[21]。酵母菌之間的相互抑制作用研究，有利于降低發(fā)酵過程中抑制雜菌所用SO2的添加量，從而促進(jìn)健康、綠色葡萄酒的生產(chǎn)。

酵母菌在發(fā)酵中存在絮凝現(xiàn)象，主要是由酵母細(xì)胞表面存在的絮凝素與鄰近酵母細(xì)胞壁上的甘露糖蛋白相互作用使細(xì)胞聚集造成的。具有絮凝性的酵母會(huì)在葡萄酒發(fā)酵過程中黏附成團(tuán)沉降，絮凝性過高過早出現(xiàn)，會(huì)導(dǎo)致酵母菌因分散性差造成的發(fā)酵性能降低、糖消耗不完全和發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)等[22]；絮凝性過低會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵后期酵母細(xì)胞凝聚緩慢，不利于葡萄酒的過濾和澄清。酵母菌絮凝程度評(píng)價(jià)常根據(jù)Flo值的不同進(jìn)行劃分，當(dāng)Flo在70%～100%時(shí)為低絮凝性，30%～70%屬中絮凝性，而0～30%屬高絮凝性，因此，具有合適絮凝性的優(yōu)選酵母菌有利于葡萄酒酒精發(fā)酵的進(jìn)行。

2.3 發(fā)酵環(huán)境耐受性研究

酵母菌在葡萄酒發(fā)酵過程中常需面對(duì)高糖、高乙醇、高SO2的環(huán)境挑戰(zhàn)[23]，如過高的糖濃度會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)，且高滲環(huán)境會(huì)使細(xì)胞脫水[22]，高酒精濃度會(huì)影響酵母菌的活性、發(fā)酵力和增殖速度等。酵母菌在脅迫環(huán)境下的生存能力和發(fā)酵力具有菌株差異，為保證葡萄酒發(fā)酵的順利進(jìn)行，常需篩選具有優(yōu)良耐受性的酵母菌作為潛在商業(yè)酵母進(jìn)行后續(xù)研究[15]。

葡萄醪中過高的糖濃度會(huì)通過阻遏作用抑制酵母菌生長(zhǎng)，此外糖濃度較高時(shí)發(fā)酵液黏度較大，不利于CO2釋放。目前研究報(bào)道中釀酒酵母具有較強(qiáng)的高糖耐受性，最高可耐受400～650 g/L的糖質(zhì)量濃度。酵母的高糖耐受性研究主要通過檢查含有不同葡萄糖濃度的YPD固體培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況、含有不同葡萄糖濃度的YPD液體培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)引起的OD值變化、或杜氏小管的產(chǎn)氣量等方式開展[16]。目前暫未發(fā)現(xiàn)關(guān)于非酵母屬酵母的高糖耐受性研究報(bào)道，但自然發(fā)酵初期的葡萄醪中往往存在大量的非酵母屬酵母，間接證實(shí)了其高糖耐受性。

乙醇通過影響酵母細(xì)胞膜的流動(dòng)性和對(duì)膜蛋白的毒性作用抑制酵母菌的發(fā)酵和生存[24]，而在葡萄醪發(fā)酵過程中，乙醇濃度隨發(fā)酵進(jìn)行逐漸升高，因此優(yōu)良酵母菌需具備一定濃度的乙醇耐受性。酵母菌的乙醇耐受性研究主要通過檢查酵母菌在含有不同濃度乙醇的YPD液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況開展，通常認(rèn)為在≥16%vol環(huán)境下能生存的菌株為乙醇耐受性良好的酵母菌。釀酒酵母的乙醇耐受性優(yōu)于大部分非酵母屬酵母，研究發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵早期存在的大部分非酵母屬酵母具有較差的乙醇耐受性(<10%vol)。酵母菌的乙醇耐受性可通過環(huán)境適應(yīng)性而增強(qiáng)，因此在篩選中若模擬酒精發(fā)酵過程逐漸增加乙醇濃度，非酵母屬酵母可耐更高濃度的乙醇[25]。

在葡萄酒發(fā)酵過程中添加適量的SO2可起到抑菌、抗氧化、保護(hù)葡萄酒顏色等作用，其用量根據(jù)葡萄原料質(zhì)量和所釀造葡萄酒類型而不同，葡萄質(zhì)量較好時(shí)，添加量常為20～110 mg/L，葡萄質(zhì)量較差時(shí)，添加量為70～150 mg/L。作為抑菌劑，一定濃度的SO2可殺死細(xì)菌和酵母菌等微生物，其中細(xì)菌對(duì)SO2最為敏感，其次是檸檬形克勒克酵母，抗性最強(qiáng)的為釀酒酵母[26]。目前報(bào)道的優(yōu)良釀酒酵母對(duì)SO2耐受性高達(dá)300 mg/L[4]。

3 野生酵母的葡萄酒釀造特色研究

酵母菌通過對(duì)葡萄汁中主要營(yíng)養(yǎng)成分(如糖和氮化合物)的代謝產(chǎn)生葡萄酒中豐富的風(fēng)味物質(zhì)(如高級(jí)醇、酯、有機(jī)酸、甘油、酮、硫揮發(fā)物等)，影響葡萄酒的品質(zhì)風(fēng)格[7,9]。近年來非酵母屬酵母對(duì)葡萄酒釀造特色塑造的積極作用逐漸被人們發(fā)掘和關(guān)注，通過控制釀酒酵母與非酵母屬酵母的接種比例和接種順序，驗(yàn)證了非酵母屬酵母的葡萄酒釀造特色，如高產(chǎn)甘油、降低蘋果酸等口感特性提升，增加香氣復(fù)雜性，降低負(fù)面風(fēng)味物質(zhì)和有毒物質(zhì)的生成等[2,27]。

3.1 口感特性研究

甘油是酵母菌酒精發(fā)酵的主要副產(chǎn)物之一，在葡萄酒中的含量為1～15 g/L，甜味閾值為5.2 g/L，研究表明甘油可改善葡萄酒的風(fēng)味強(qiáng)度，增加黏度，抑制高乙醇含量帶來的苦味、辣感和粗糙感，適當(dāng)提高葡萄酒的甘油含量可使葡萄酒口感圓潤(rùn)，并增加口感復(fù)雜性[26]。甘油主要產(chǎn)生于酒精發(fā)酵前期，甘油的產(chǎn)生可平衡酵母細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電勢(shì)，緩解高糖環(huán)境產(chǎn)生的滲透脅迫作用。目前酵母菌的產(chǎn)甘油能力研究主要通過檢測(cè)發(fā)酵液中甘油含量的方式進(jìn)行，甘油含量可通過試劑盒[28]、高錳酸鉀褪色光度法、氣相色譜法、變色酸法[29]、酶法、高效液相色譜法等方法檢測(cè)。高產(chǎn)甘油的酵母菌發(fā)酵液中甘油含量應(yīng)≥6 g/L[30]，大部分酵母菌甘油產(chǎn)量隨發(fā)酵溫度升高而增加，因此進(jìn)行甘油產(chǎn)量評(píng)價(jià)時(shí)需考慮不同發(fā)酵溫度帶來的影響[28]。

葡萄酒中主要的有機(jī)酸為酒石酸和蘋果酸，來源于葡萄原料。葡萄酒酸度過低(<4.59 g/L，以酒石酸計(jì))，會(huì)使葡萄酒不清爽、不厚實(shí)、不穩(wěn)定，且口感復(fù)雜性低等[31]。葡萄原料含酸量過低可選擇產(chǎn)酸能力較好的酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵，馬文瑞等[32]篩選出高產(chǎn)酸酵母菌Y6，酒精發(fā)酵過程中平均產(chǎn)酸量為1.69 g/L(以酒石酸計(jì))，主要產(chǎn)生的酸為酒石酸和蘋果酸，可緩解新疆等產(chǎn)區(qū)葡萄原料高糖低酸的情況。葡萄酒酸度過高(主要是蘋果酸含量過高)，會(huì)帶來酸澀、粗糙的不良口感，且蘋果酸易被微生物利用，不利于葡萄酒穩(wěn)定。裂殖酵母等降酸酵母可通過蘋果酸酒精發(fā)酵分解75%～100%左右的蘋果酸[33]。通過選擇合適的酵母菌來釀葡萄酒，可適當(dāng)增加或者降低葡萄酒的酸度。

3.2 香氣復(fù)雜性研究

近年來相關(guān)研究表明釀酒酵母與非酵母屬酵母的混合發(fā)酵可增加葡萄酒的香氣復(fù)雜性，尤其是果味的增加，而與葡萄酒果味相關(guān)的香氣化合物包含酯類、高級(jí)醇、揮發(fā)性硫醇等[34]。乙酸酯類化合物主要通過乙酰CoA與醇類物質(zhì)在醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶的催化下形成，高級(jí)醇通過酵母菌的氨基酸代謝(Ehrlich途徑)或糖代謝合成途徑形成。乙酯類化合物主要通過酵母菌脂質(zhì)代謝形成的中鏈脂肪酰CoA與乙醇在多種?；D(zhuǎn)移酶的作用下由酶促酯化反應(yīng)生成。酵母菌的產(chǎn)酯能力可初步通過酯酶培養(yǎng)基評(píng)價(jià)，但近年來相關(guān)研究大多直接研究發(fā)酵液中不同酯類物質(zhì)的含量。由于發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸乙酯、高級(jí)醇等香氣化合物可在葡萄酒陳釀過程中進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，因此不建議簡(jiǎn)單通過發(fā)酵液中香氣物質(zhì)含量篩選產(chǎn)香酵母。酵母菌分泌的酶(如糖苷酶和半胱氨酸裂合酶)還可促進(jìn)葡萄漿果表皮中芳香前體物質(zhì)的提取，使中性芳香化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚苑枷慊衔?，從而影響葡萄酒的香氣結(jié)構(gòu)[35]。糖苷酶可破壞萜類物質(zhì)和葡萄糖間的共價(jià)鍵，從而將揮發(fā)性萜烯類化合物釋放出來，增加葡萄酒香氣；同樣，半胱氨酸裂合酶將硫醇與半胱氨酸結(jié)合的形式中釋放出來，賦予了葡萄酒西柚、柑橘等香氣[9]。酵母菌產(chǎn)酶情況可通過定性和定量培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選[35]，近年來相關(guān)研究關(guān)注高產(chǎn)酶非酵母屬酵母通過與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)葡萄酒香氣復(fù)雜性的影響[10,36]。

酵母自溶出現(xiàn)在發(fā)酵末期，是一個(gè)緩慢的過程，首先胞內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生重組，溶菌酶被激活，細(xì)胞的體積減小、黏度下降，然后胞內(nèi)組分被水解并釋放到胞外[23,37]。在水解酶的作用下，酵母菌的細(xì)胞質(zhì)會(huì)釋放出脂肪酸、多肽、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)，細(xì)胞壁會(huì)釋放出甘露糖蛋白[9,38]。一些陳釀型白葡萄酒會(huì)通過酒泥陳釀方式獲取酵母菌自溶釋放的物質(zhì)成分，從而增加風(fēng)味復(fù)雜度[39]。酵母自溶釋放的物質(zhì)如多肽會(huì)影響起泡葡萄酒第二次發(fā)酵過程中的發(fā)泡特性，而甘露糖蛋白可抑制單寧的凝集、促進(jìn)芳香化合物的保留、增加葡萄酒多糖成分、促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)、抑制醋酸菌的生長(zhǎng)、增加抗氧化性等。

3.3 風(fēng)味缺陷研究

H2S是酒精發(fā)酵過程中常見的代謝副產(chǎn)物，在葡萄酒中的含量約為1 μg/L，具有臭雞蛋氣味、揮發(fā)性強(qiáng)、閾值低(11～80 μg/L)，因此含量過高會(huì)造成葡萄酒風(fēng)味缺陷[40]，H2S還可衍生為其他揮發(fā)性硫化合物如乙硫醇等使葡萄酒呈現(xiàn)腐爛卷心菜、燒焦的橡皮、蒜臭味等其他不良?xì)馕?。低產(chǎn)或不產(chǎn)H2S酵母菌可改善酒精發(fā)酵過程中硫代謝引起的不良風(fēng)味。酵母菌的產(chǎn)H2S能力可通過發(fā)酵或液體培養(yǎng)中的硫化氫檢測(cè)管、醋酸鉛還原法等進(jìn)行評(píng)價(jià)，BIGGY培養(yǎng)基也常用于表征酵母菌產(chǎn)H2S的能力[41]。目前研究報(bào)道的不產(chǎn)H2S野生釀酒酵母只有1株，為UCD932[40]，因此篩選不產(chǎn)或低產(chǎn)H2S釀酒酵母是葡萄酒釀造酵母商業(yè)化應(yīng)用的主要研究?jī)?nèi)容之一，目前尚無非酵母屬酵母H2S代謝的相關(guān)報(bào)道。

3.4 降低毒素等安全研究

酵母菌的精氨酸代謝起始于精氨酸酶將精氨酸水解為尿素和鳥氨酸的過程(圖2)。尿素可與乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯，氨基甲酸乙酯為致癌物質(zhì)，1985年加拿大政府的衛(wèi)生與福利組織規(guī)定佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超過30 μg/L[42]，2002年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織規(guī)定葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超過20 μg/L，食品中不得超過25 μg/L[43]，中國(guó)目前未明確限制葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量，但明確了氨基甲酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(GB 5009.223—2014)。由于尿素是酵母代謝產(chǎn)生氨基甲酸乙酯的主要前體物質(zhì)[42]，因此低產(chǎn)尿素酵母菌的篩選有益于降低葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量。部分非酵母屬酵母具有脲酶活性，可將精氨酸代謝產(chǎn)生的尿素分解為二氧化碳和氨氣，避免尿素生成氨基甲酸乙酯。研究表明，部分釀酒酵母能夠生產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶，可將氨基甲酸乙酯水解為乙醇和氨從而降低其含量[44]。由于尿素與乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯的過程可在陳釀過程中緩慢進(jìn)行，因此發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯水解酶的作用相較于脲酶降低尿素的作用來說，后者更有利于降低葡萄酒中的氨基甲酸乙酯(圖2)。

葡萄表面受敗壞性真菌侵染會(huì)產(chǎn)生赭曲霉毒素等真菌毒素，這些真菌毒素可能伴隨釀造過程進(jìn)入葡萄酒中，赭曲霉毒素為致癌物質(zhì)，歐盟委員會(huì)提議其在葡萄酒中的含量不應(yīng)超過2 mg/L。相關(guān)研究表明部分酵母菌對(duì)赭曲霉毒素具有一定的去除作用，可通過篩選具有良好去除赭曲霉毒素效果的酵母菌作為發(fā)酵劑，減少葡萄酒中赭曲霉毒素的含量[42,46]。

4 酵母菌商業(yè)化生產(chǎn)的分析因素

野生酵母經(jīng)分離鑒定、發(fā)酵特性分析、釀造特色分析后，所篩選的優(yōu)良野生酵母還需分析其是否可通過商業(yè)菌劑的方式投入葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)[9]。目前主要應(yīng)用的商業(yè)菌劑為活性干酵母，自1964年起在美國(guó)開始應(yīng)用于葡萄酒工業(yè)，80年代初期在中國(guó)應(yīng)用于葡萄酒釀造行業(yè)中。加工成型的活性干酵母直徑約為0.5～2 mm，通過真空包裝方式可保持1年以上的酵母活性[47]。酵母菌在活性干酵母制備過程中，所用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)常為糖蜜，糖蜜中缺乏氮源和維生素，因此酵母菌需具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)底物適應(yīng)性[48]，酵母菌通過逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)至發(fā)酵罐培養(yǎng)，經(jīng)過離心收集、水洗、擠壓成型、干燥等過程制成活性干酵母，葡萄酒釀造時(shí)經(jīng)活化后應(yīng)用于葡萄汁的發(fā)酵?；钚愿山湍钢谱鬟^程需要酵母菌具有耐干燥(水分含量<5.5%)、耐饑餓、活性強(qiáng)、再吸水活化時(shí)發(fā)酵力強(qiáng)等特點(diǎn)[9,47]，酵母細(xì)胞內(nèi)碳水化合物(如海藻糖)和蛋白質(zhì)的含量與酵母菌耐干燥和再吸水活化時(shí)的發(fā)酵力相關(guān)，一般蛋白質(zhì)含量高則發(fā)酵力強(qiáng)，而碳水化合物含量高則耐干燥性能強(qiáng)[47]。研究表明，高溫鈍化培養(yǎng)方案適合活性干酵母的制作，具體指在13 h的培養(yǎng)周期中，從第9 h開始每小時(shí)增加2 ℃培養(yǎng)溫度，最終可獲取較高的酵母細(xì)胞生物量、干物質(zhì)含量和胞內(nèi)海藻糖含量[49]。部分非酵母屬酵母加工耐受性弱于釀酒酵母，因此雖然商業(yè)化非酵母屬酵母仍大多加工為活性干酵母，國(guó)際酵母市場(chǎng)也出現(xiàn)了膏狀酵母、活性冷凍酵母和膠囊封裝酵母等新型加工菌劑[50]，如意大利BioEnologia公司開發(fā)的四種非酵母屬酵母菌種(Starmerellabacillaris、Schizosaccharomycespombe、Pichiakluyveri、Kazachastaniaservazzii)的膏狀酵母、葡萄牙Proenol公司開發(fā)的S.pombe膠囊封裝酵母。目前中國(guó)葡萄酒釀造市場(chǎng)暫無本土特色非酵母屬酵母商業(yè)化產(chǎn)品和新型加工菌劑產(chǎn)品。

5 結(jié)語

由于全球氣候變暖對(duì)葡萄酒行業(yè)的挑戰(zhàn)和消費(fèi)者觀念的改變，當(dāng)今葡萄酒更趨向具有區(qū)域特色化、風(fēng)味復(fù)雜性、低醇、低硫和健康特色。酵母菌作為葡萄酒釀造風(fēng)格質(zhì)量的主導(dǎo)微生物，其代謝特點(diǎn)直接影響所產(chǎn)葡萄酒的風(fēng)味。因此，篩選中國(guó)不同產(chǎn)區(qū)特有的釀酒酵母和非酵母屬酵母，并進(jìn)一步進(jìn)行釀造特色和商業(yè)化菌劑加工因素分析，運(yùn)用商業(yè)化中國(guó)特色酵母菌將成為釀造具有中國(guó)不同區(qū)域特色葡萄酒的主流趨勢(shì)。除單一酵母菌種商業(yè)化制劑外，優(yōu)選釀酒酵母與非酵母屬酵母混合加工制劑的開發(fā)與應(yīng)用，將為中國(guó)不同區(qū)域特色葡萄酒的釀造提供重要的發(fā)酵輔料來源。目前具有中國(guó)不同產(chǎn)區(qū)特色的野生酵母菌資源正在不斷得到研究與挖掘，然而關(guān)于商業(yè)化菌劑加工的研究較少，膏狀酵母等新型加工菌劑的采用可為更多優(yōu)質(zhì)葡萄酒酵母的商業(yè)化應(yīng)用提供新的思路。