武利梅，吳麗華,，趙晶晶，李 潔，毛振濤，余 玲，李建科

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院1，西安 710119) (西安市糧油質(zhì)量檢驗中心2，西安 710003) (陜西秦喬農(nóng)林生物科技有限公司3，商洛 726000)

漆樹[Toxicodendronvernicfluum(Stokes) F.A. Barkley] 漆樹科(Anacardiaceae)漆樹屬(Toxico-dendron)雙子葉植物，中國漆樹資源占世界總量的90%以上，是亞洲獨有樹種，也是中國特有經(jīng)濟林樹種[1，2]。漆樹除了生產(chǎn)生漆，漆樹籽產(chǎn)量也很大，中國漆籽年產(chǎn)量約150萬t以上，漆樹籽富含油脂，漆籽可以提取加工成漆樹籽油，具有特有的香氣，在民間已有幾十年的食用歷史[3,4,7]。漆樹籽油中豐富的亞油酸和不飽和脂肪酸，是一種營養(yǎng)及健康功能較高的食用植物油[5,6]。

關(guān)于漆樹籽油的研究主要集中在脂肪酸的分析，關(guān)于漆樹籽油油脂伴隨物等微量功能營養(yǎng)成分的研究鮮見報道。陜西秦巴山區(qū)是我國最主要的漆樹林帶之一，本研究以陜西秦巴山區(qū)漆樹籽為原料，研究了漆樹籽油中脂肪酸組成以及油脂伴隨物等微量功能營養(yǎng)成分，為全面認(rèn)識漆樹籽油的營養(yǎng)功能價值，進一步開發(fā)利用漆樹籽油提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

漆樹籽油、角鯊烯(≥99.5%)、角鯊?fù)?≥99.2%)；維生素E標(biāo)準(zhǔn)品: δ-生育三烯酚(≥97%)，β-生育三烯酚(≥97%)，γ-生育三烯酚(≥97%)，α-生育三烯酚(≥97%)，δ-生育酚(≥98%)，β-生育酚 (≥95%)，γ-生育酚(≥98%)，α-生育酚(≥98%)；植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品: 菜油甾醇(≥97%)，豆甾醇(≥95%)，β-谷甾醇(≥98%)，羽扇豆醇(≥97%)，羊毛甾醇(≥97%)，β-香樹精(≥97%)；沒食子酸(≥98% )；丙酮、甲醇、正己烷均為色譜純；氫氧化鉀、無水乙醇均為分析純；二醇基固相萃取柱(500 mg，3 mL)；中性氧化鋁(500 mg，3 mL)。

1.2 儀器設(shè)備

GC-14C氣相色譜儀，配氫離子火焰(FID)檢測器，Evolution 300紫外分光光度計；Agilent 7890B-7000C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent 1200液相色譜儀，氣相色譜柱DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.32 μm)，HP-5(30 m×320 μm×0.25 μm )，Infinity Lab Poroshell 120 PFP(4.6×250 mm 4-Micron)。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪酸組成的測定

參照GB 5009.168—2016[8]方法對脫色前后的漆樹籽油進行甲酯化處理，并利用氣相色譜儀分析其脂肪酸組成。

氣相色譜條件：色譜柱：DB-225MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.2 μm )；升溫程序：170 ℃保持1 min，以15 ℃/min升到200 ℃保持1 min，再以1 ℃/min的升到220 ℃保持15 min；進樣口溫度230 ℃ ，檢測器溫度250 ℃，分流比20∶1。

1.3.2 植物甾醇和角鯊烯的測定1.3.2.1 植物甾醇和角鯊烯的提取

稱取油樣0.2 g，用5 mL正己烷溶解，振蕩10 min后，加30 mL 0.5 mol/mL氫氧化鉀-乙醇溶液，沸水浴回流皂化30 min，皂化結(jié)束后加入5 mL乙醇取出，流水迅速冷卻至室溫。將皂化液加于活化好的中性氧化鋁柱中，先用5 mL乙醇洗提，再用20 mL正己烷溶液洗提，流速1.2 mL/min，收集洗脫液。將洗脫液旋干，用2 mL正己烷定容，過0.22 μm有機濾膜于樣品瓶中，置于-20 ℃下保存待測。每份樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

1.3.2.2 GC-MS分析條件

色譜柱：DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm )；升溫程序：180 ℃保持1 min，以15℃/min升至280 ℃保持40 min；柱流速：1 mL/min；進樣口：280 ℃，分流比50∶1，進樣體積1.0 μL。

質(zhì)譜部分：接口溫度300 ℃，離子源溫度230 ℃，電離方式：EI源，電離電壓70 eV，采用全掃描模式進行定量。

1.3.3 維生素E含量的測定1.3.3.1 維生素E的提取

稱取油樣0.5 g，5 mL正己烷溶解，加入10 mL 90%甲醇水，9 200 r/min均質(zhì)90 s，10 000 r/min 4 ℃下離心5 min，收集水醇層于25 mL容量瓶中，重復(fù)2次，最后定容到25 mL過0.22 μm濾膜，待測，為防止光對維生素E的影響，整個操作處于避光環(huán)境。

1.3.3.2 HPLC分析條件

色譜柱：InfinityLab Poroshell 120 PFP(4.6×250 mm 4-Micron)；流動相：90∶10甲醇水等度洗脫；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。

檢測器：熒光檢測器(激發(fā)波長294 nm，發(fā)射波長328 nm)。

1.3.4 總酚的測定1.3.4.1 總酚的提取

稱取油樣0.5 g(±0.001 g)，用5 mL正己烷溶解，分別用6 mL甲醇和6 mL正己烷活化二醇基固相萃取柱，上樣，5 mL正己烷淋洗柱子2次，再用10 mL無水甲醇洗脫，收集洗脫液，旋蒸，甲醇定容2 mL，待測。

1.3.4.2 總酚含量的測定

用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品配制質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、30 μg/mL的工作液，測定總酚含量。

吸取1.3.4.1中定容液、沒食子酸工作液、水各 1 mL于10 mL棕色離心管中，加入1 mL 10%福林酚，暗處靜置反應(yīng)3 min后，加入3 mL碳酸鈉溶液(7.6%)，避光反應(yīng)1 h后過0.22 μm有機濾膜，在765 nm波長下測定其吸光度，根據(jù)外標(biāo)法計算油樣中總酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆樹籽油脂肪酸組成分析結(jié)果

表1和表2分別是漆樹籽油脫色前后脂肪酸的組成和相對含量，可以看出，漆樹籽油主要含有12種脂肪酸，其組成和玉米油相似。漆樹籽油中飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸的比例為1∶1.5、4.5，飽和脂肪酸主要是棕櫚酸9.8%，不飽和脂肪酸主要是亞油酸，占脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的一半以上，為62.8%，油酸占比21%。目前已知亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是紅花籽油，為77%[9]。亞油酸作為人體必需的脂肪酸之一，在人體內(nèi)可進一步衍化成花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等具有良好健康功能的多不飽和脂肪酸[10]。此外，具有預(yù)防二型糖尿病和良好的消炎作用的棕櫚油酸[11]，在漆樹籽油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占到0.7%左右。

表1 未脫色漆樹籽油脂肪酸組成及相對含量

表2 脫色漆樹籽油脂肪酸組成及相對含量

2.2 漆樹籽油油脂伴隨物分析

2.2.1 12種油脂伴隨物線性范圍、檢出限和定量限

在已建立的檢測條件下，角鯊烯采用內(nèi)標(biāo)法定量，其余物質(zhì)采用外標(biāo)法進行定量，橫坐標(biāo)為各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度x(μg/mL)，目標(biāo)物質(zhì)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸，同時對目標(biāo)化合物的檢出限、定量限進行考察，結(jié)果見表3。

表3 植物甾醇、角鯊烯和維生素E的線性范圍、檢出限、定量限(n=5)

續(xù)表3

由表3可知，在線性范圍內(nèi)，目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，回歸系數(shù)均大于0.996。檢出限和定量限分別以3倍和10倍的信噪比計算，植物甾醇、角鯊烯的檢出限是0.1～0.25 μg/mL，定量限是0.17～0.83 μg/mL，維生素E的檢出限是0.02～0.05 μg/mL，定量限是0.07～0.17 μg/mL。說明氣相色譜質(zhì)譜檢測植物甾醇和角鯊烯，液相色譜檢測維生素E靈敏度較低，可以對漆樹籽油中植物甾醇、角鯊烯及維生素 E進行定量分析。

2.2.2 漆樹籽油中角鯊烯、植物甾醇和維生素E的測定結(jié)果

圖1和圖2分別是角鯊烯和植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和漆樹籽油的氣相色譜質(zhì)譜總離子流圖。檢測結(jié)果顯示漆樹籽油中不含有角鯊烯，含有8種植物甾醇，分別是菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、δ5-燕麥甾醇、β-香樹精、羽扇豆醇、β-扶桑甾醇、檸檬二烯醇。

注：1為菜油甾醇；2為豆甾醇；3-β為谷甾醇；4為羊毛甾醇；5為β-香樹精；6為羽扇豆醇。圖1 植物甾醇混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GC-MS總離子流圖

注：1為菜油甾醇；2為豆甾醇；3為β-谷甾醇；4為羊毛甾醇；5為β-香樹精；6為羽扇豆醇；7為β-扶桑甾醇；8為檸檬二烯醇。圖2 漆樹籽油的GC-MS總離子流色譜圖

由表4可知，漆樹籽油中含有豐富的β-谷甾醇，漆樹籽油脫色前含量可達(dá)到343 8.67 mg/kg，可以與芝麻油相媲美[12]，脫色后其含量仍可達(dá)到250 6.46 mg/kg。其中β-扶桑甾醇、檸檬二烯醇通過質(zhì)譜檢索得出，主要存在于中藥材中[13,14]。在常見的植物油鮮見對β-扶桑甾醇有報道，β-扶桑甾醇是β-谷甾醇的同分異構(gòu)體，其抗生育活性更加明顯[15]，且對胃癌細(xì)胞株的增殖在一定程度上有抑制作用[16]。Lucía 等[17]檢測出橄欖油中含有檸檬二烯醇，但其原料產(chǎn)地源于國外，目前以國內(nèi)橄欖為原料的橄欖油很少檢測出檸檬二烯醇。研究表明檸檬二烯醇可能通過阻斷SARS-CoV-2病毒蛋白合成，阻止病毒進入宿主細(xì)胞，抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮作用[18]。在漆樹籽油中發(fā)現(xiàn)這兩種特殊植物甾醇，具有重要的意義。

表4 漆樹籽油脫色前后植物甾醇和維生素E含量(n=6)

維生素E(包括α-T，β-T，γ-T，δ-T 4種生育酚和α-T3，β-T3，γ-T3，δ-T3 4種生育三烯酚)是人體主要的脂溶性抗氧化劑[19]。攝入一定量的維生素E可降低心血細(xì)管疾病，延緩細(xì)胞衰老，但它們不能由人體合成，必須從飲食中獲得，主要來源之一便是植物油[20]。

圖3是維生素E標(biāo)準(zhǔn)品和漆樹籽油HPLC色譜圖，未脫色漆樹籽油檢測出1種生育三烯酚和3種生育酚，分別為δ-生育三烯酚，δ-生育酚，β-生育酚，γ-生育酚。未脫色漆樹籽油的維生素E含量為(645.06±16.12) mg/kg，其中δ-生育酚含量最高，含量為(435.12±10.94) mg/kg，脫色后含量降為(190.61±16.60) mg/kg。其次是γ-生育酚，未脫色前含有(202.89±4.72) mg/kg，脫色后為(47.25±4.29) mg/kg。

注：1為δ-生育三烯酚；2為β-生育三烯酚；3為γ-生育三烯酚；4為α-生育三烯酚；5為δ-生育酚；6為β-生育酚；7為γ-生育酚；8為α-生育酚。圖3 維生素E標(biāo)準(zhǔn)品和漆樹籽油HPLC色譜圖

大多數(shù)植物油主要的維生素E是活性最強的α-生育酚，如葵花籽油[21]、橄欖油、紅花籽油、芝麻油[22]、亞麻籽油[23]等植物油主要為γ-生育酚。由表4可知，漆樹籽油中主要的維生素E是δ-生育酚，占到了總維生素E的65%以上。δ-生育酚的強抗氧化性較好的保證了漆樹籽油的品質(zhì)，同時δ-生育酚抗炎癥[24]的作用和作為多數(shù)維生素E制劑中促進健康的限制因素[25]使漆樹籽油更具營養(yǎng)和藥用價值。所以，漆樹籽油可作為提取δ-生育酚的重要來源之一。

2.2.3 漆樹籽油中總酚含量測定結(jié)果

采用福林酚法進行總酚含量的測定，測得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.009 1x+0.008 4，R2=0.998，未脫色前漆樹籽油總酚含量為(176.11±17.42) mg/kg，經(jīng)過脫色工藝后含量降到(141.99±10.6) mg/kg。

2.3 精煉過程中脫色對漆樹籽油成分的影響

脫色作為植物油精煉過程中的一道工序，主要的影響因素是脫色劑的類型及含量等[26]。由表1、表2可知漆樹籽油經(jīng)過脫色精煉工藝處理后，其脂肪酸組成和相對含量并沒有發(fā)生明顯變化。

由圖4和圖5可以發(fā)現(xiàn)，漆樹籽油在脫色過程對植物甾醇、維生素E、總酚的種類沒有影響，但是含量均有一定程度降低，尤其是δ-生育酚、γ-生育酚、β-谷甾醇，損失率分別為56%、76%、27%，這可能是在脫色過程中脫色劑的吸附和催化，導(dǎo)致維生素E和甾醇酯發(fā)生水解，以及脫色前脫酸和脫膠工序中皂腳和膠質(zhì)的吸附。

圖4 漆樹籽油脫色前后植物甾醇含量的對比

圖5 漆樹籽油脫色前后維生素E和總酚含量的對比

3 結(jié)論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，漆樹籽油不僅是一種高亞油酸植物油外，還含有大量的油脂伴隨物等功能微量營養(yǎng)成分，如，β-谷甾醇在漆樹籽油中含量達(dá)(3 438.67±35.56) mg/kg，δ-生育酚在漆樹籽油中含量達(dá)(435.12±10.94) mg/kg，植物多酚在漆樹籽油含量為(76.11±17.42) mg/kg。同時，發(fā)現(xiàn)漆樹籽油含有特有的β-扶桑甾醇和檸檬二烯醇。這些物質(zhì)具有重要的生理活性和保健功能，表明漆樹籽油具有良好的潛在開發(fā)應(yīng)用前景。