• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      同位素內(nèi)標(biāo)-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定小麥和玉米中19種真菌毒素

      2022-09-09 03:43:56何卓霖李子琨謝云峰
      中國糧油學(xué)報(bào) 2022年7期
      關(guān)鍵詞:內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液乙腈

      何卓霖,李子琨,穆 蕾,謝云峰,王 亮

      (新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院1,烏魯木齊 830046) (北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部2,北京 100124) (中糧營養(yǎng)健康研究院;營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3 ,北京 102209)

      真菌毒素是產(chǎn)毒真菌在一定條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,能夠引發(fā)人和動(dòng)物產(chǎn)生各種急性或慢性疾病[1-4]。世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)將單端孢霉烯族類毒素、伏馬類毒素、赭曲霉類毒素、黃曲霉類毒素等列為造成食源性疾病的根源之一[5,6]。糧食及其制品在生產(chǎn)、加工和運(yùn)輸?shù)倪^程中均有可能受到多種真菌毒素污染[8,9]。據(jù)調(diào)查,我國小麥和玉米易受脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏馬毒素(FB)等的污染;朱群英等[10]利用液質(zhì)聯(lián)用同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定204份小麥粉樣品中7種真菌毒素,其中DON檢出率達(dá)90%,超標(biāo)率為41%,ZEN檢出率為68.6%,超標(biāo)率為2.9%;譚莉等[11]利用基質(zhì)分散固相萃取凈化(QuEChERS)技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定240份玉米樣品中的9種真菌毒素,DON及其衍生物檢出率為30.4%~52.9%,F(xiàn)B檢出率達(dá)85.8%~96.7%;任貝貝等[12]對(duì)河北省的74份玉米、玉米制品以及240份小麥樣品中16種真菌毒素污染水平進(jìn)行調(diào)查分析,F(xiàn)B、ZEN和DON為主要污染物。我國高度重視真菌毒素污染問題,頒布了食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)[13],對(duì)小麥和玉米中黃曲霉毒素B1 、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的含量作了限定,但是尚未明確規(guī)定伏馬毒素、T-2毒素和HT-2毒素等毒素限量值。開發(fā)快速、精準(zhǔn)、高通量的真菌毒素檢測(cè)方法對(duì)于加強(qiáng)糧食毒素污染監(jiān)測(cè)能力,提升糧食質(zhì)量安全保障水平,具有重要意義。

      目前,常用的真菌毒素檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[14,15]、高效液相色譜法(HPLC)[16-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS )[20,21]等。其中ELISA具有方法簡單、樣品處理時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),多用于單一真菌毒素的快速檢測(cè),但重復(fù)性較差且易受到基質(zhì)的干擾出現(xiàn)假陽性[14]。HPLC法常結(jié)合熒光或紫外檢測(cè)器,多用于檢測(cè)單一或者同一類化學(xué)性質(zhì)相近的同類真菌毒素,但受限于定性能力不足,無法實(shí)現(xiàn)多組分真菌毒素同時(shí)快速測(cè)定[16-18]。LC-MS/MS法具有強(qiáng)大的定性、定量分析能力,適用于多種類真菌毒素同時(shí)檢測(cè);其特有的選擇性離子監(jiān)測(cè)技術(shù),極大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性,使得樣品可以采用更為簡單、快速的預(yù)處理[19-22],結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)定量方法能夠校正質(zhì)譜離子化過程存在的基質(zhì)效應(yīng),保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[23,24]。

      本研究針對(duì)常規(guī)真菌毒素繁冗復(fù)雜的前處理程序,簡化樣品提取凈化方法, 并利用同位素內(nèi)標(biāo)校正樣品基質(zhì)干擾,建立LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定小麥和玉米中常見19種真菌毒素方法,為糧食中真菌毒素精準(zhǔn)檢測(cè)、污染監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供有力的技術(shù)支持。

      1 材料與方法

      1.1 儀器與設(shè)備

      LC-30AD高效液相色譜儀,QTRAP 5500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀,Allegra 64R臺(tái)式高速離心機(jī),TTL-DCⅡ型氮吹儀,Mili Q超純水機(jī),Dragon Lab QL902渦旋振蕩器,SB-3200DTDN 超聲波清洗器。

      1.2 材料與試劑

      甲醇、乙腈,色譜純;甲酸,色譜純;甲酸(98%);超純水,Mili Q純水機(jī)制得;黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2);嘔吐毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON);T-2毒素(T-2);HT-2毒素(HT-2);伏馬毒素B1(FB1);伏馬毒素B2 (FB2);伏馬毒素B3 (FB3);赭曲霉毒素A(OTA);赭曲霉毒素B (OTB);雜色曲霉毒素(STC);玉米赤霉烯酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(玉米赤霉酮(ZAN)、赤霉烯酮(ZEN)、α-赤霉醇(α-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL);13C黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液(U-[13C17]-AFTB1、U-[13C17]-AFTB2、U-[13C17]-AFTG1、U-[13C17]-AFTG2);13C伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液(U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2);U-[13C34]-FB3;U-[13C17]-3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON);U-[13C15]-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON);U-[13C17]-15-乙?;撗跹└牭毒┐迹籙-[13C18]-玉米赤霉烯酮(ZEN);U-[13C22]-HT-2毒素;U-[13C20]-赭曲霉毒素A(OTA);U-[13C24]-T-2毒素(T-2);U-[13C24-STC];U-[D4-α-ZEL]

      1.3 方法

      1.3.1 19種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

      分別移取一定體積的19種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL容量瓶中,加入適量乙腈∶水(80∶20)溶液定容,配制成19種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,充分混勻后于-20 ℃以下冰箱內(nèi)避光保存,質(zhì)量濃度見表1。

      表1 19種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度

      1.3.2 16種真菌毒素穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

      分別移取一定體積的16種真菌毒素同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 mL容量瓶中,加入適量乙腈∶水(80∶20)溶液定容,充分混勻后于-20 ℃以下冰箱內(nèi)避光保存,質(zhì)量濃度見表2。由于ZAN、α-ZAL、OTB 3種毒素?zé)o市售商品化內(nèi)標(biāo)物質(zhì),因此分別選擇與其結(jié)構(gòu)類似、出峰相鄰的ZEN、α-ZEL、OTA對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)13C18-ZEN、D4-α-ZEL、13C20-OTA進(jìn)行定量。

      表2 16種真菌毒素穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合工作液質(zhì)量濃度

      1.3.3 真菌毒素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的配制

      準(zhǔn)確吸取2、4、6、8、20、40、80 μL真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,均加入10 μL同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1)溶液稀釋成體積為200 μL的19種真菌毒素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液。

      1.3.4 樣品前處理

      取玉米試樣,高速粉碎機(jī)粉碎,混勻,準(zhǔn)確稱取2 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入50 μL的內(nèi)標(biāo)混合工作液,加入10 mL乙腈∶水∶甲酸 (80∶18∶2)溶液提取,渦旋振蕩1 min,超聲提取20 min,在4 ℃下8 000 r/min離心10 min;將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈離心管中,渦旋混勻1 min,取5 mL在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?,加?00 μL甲醇∶水∶甲酸(30∶70∶0.1)溶液復(fù)溶,渦旋震振1 min,超聲5 min,12 000 r/min離心10 min,取上層清液待測(cè)。

      1.3.5 色譜條件

      色譜柱:Shiseido-C18(100 mm×2.0 mm×3 μm),進(jìn)樣量10 μL,流速0.3 mL/min;流動(dòng)相:A相為0.1%甲酸/水溶液,B相為甲醇溶液,梯度洗脫條件如表3所示。

      表3 梯度洗脫程序

      1.3.6 質(zhì)譜條件

      電噴霧離子源(ESI),離子源溫度:550 ℃;離子噴霧電壓:5 500 V(正模式)/-4 500 V(負(fù)模式);氣簾氣:35 psi;氣體1∶50 psi;氣體2∶55 psi;采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè),質(zhì)譜參數(shù)見表4。

      表4 質(zhì)譜條件參數(shù)

      續(xù)表4

      2 結(jié)果與討論

      2.1 真菌毒素的分離優(yōu)化

      本研究通過優(yōu)化液相流動(dòng)相洗脫梯度、質(zhì)譜離子源參數(shù)以及各真菌毒素的碎裂能和去簇電壓,以期獲得最優(yōu)的分離效率和檢測(cè)靈敏,結(jié)合19種真菌毒素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異,分別使用正、負(fù)離子模式采集,MRM色譜圖如圖1和圖2所示。

      圖1 13種真菌毒素混標(biāo)的正模式MRM色譜圖

      圖2 6種真菌毒素混標(biāo)的負(fù)模式MRM色譜圖

      2.2 前處理方法優(yōu)化

      為有效避免糧食基質(zhì)對(duì)真菌毒素提取效率的影響,綜合考慮19種真菌毒素的極性差異,分別使用不同有機(jī)相比例的提取液進(jìn)行提取。以玉米基質(zhì)為例,分別考察使用10 mL乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2的提取液和10 mL乙腈∶甲酸=98∶2提取液提取,本實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用乙腈∶水 (98∶2) 進(jìn)行提取時(shí),提取液中高比例的有機(jī)溶劑會(huì)大量溶出基質(zhì)中的雜質(zhì),造成方法靈敏度降低;其次,大部分毒素的回收率也無法滿足要求。經(jīng)過優(yōu)化,使用乙腈∶水∶甲酸(80∶18∶2) 提取液時(shí),非極性較大的毒素如黃曲霉毒素、鐮刀菌屬毒素、赭曲霉毒素等均有較好的提取效率,同時(shí),各真菌毒素的回收率均在60%~120%之間,綜合考慮,選取乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2的提取液可實(shí)現(xiàn)19種真菌毒素的統(tǒng)一前處理并保證各毒素目標(biāo)物回收率均滿足要求。

      2.3 基質(zhì)效應(yīng)

      基質(zhì)效應(yīng)主要是由于樣品中的內(nèi)源性組分以及樣品處理過程中引入的雜質(zhì)造成的,在電噴霧離子化模式下,各類真菌毒素的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度均易受到基質(zhì)干擾[25,26],本實(shí)驗(yàn)根據(jù)純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線和空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來判斷基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱?;|(zhì)效應(yīng)按公式計(jì)算:C= ( 1-Ss/Sm) ×100%;式中:C為基質(zhì)效應(yīng);Ss為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率,Sm為空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。|C| 在20% 以下為較弱基質(zhì)效應(yīng),在20%~50%之間為中等基質(zhì)效應(yīng),50%~100%為之間強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[27]。小麥和玉米的基質(zhì)效應(yīng)見表5。結(jié)果顯示,黃曲霉毒素、嘔吐毒素和伏馬毒素都具有強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),其余的少數(shù)真菌毒素屬于較弱基質(zhì)效應(yīng)。因此,在所有樣品和標(biāo)品中均加入穩(wěn)定同位素,利用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,從而彌補(bǔ)真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng),保證質(zhì)譜結(jié)果的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。

      表5 小麥和玉米的基質(zhì)效應(yīng)

      2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

      2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

      以目標(biāo)分析物面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)、相應(yīng)目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以3倍信噪比和10倍信噪比時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物峰面積計(jì)算濃度,確定方法對(duì)于各目標(biāo)物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果如表6所示。在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)19種真菌毒素色譜峰面積與質(zhì)量濃度成良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2大于0.992,檢出限(LOD)為0.04~10.00 μg/kg,定量限(LOQ)為0.12~30 μg/kg。

      表6 線性方程和檢出限、定量限

      2.4.2 回收率和精密度

      取空白樣品,分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次,計(jì)算6次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表7。本方法回收率和精密度結(jié)果良好,回收率在61%~117%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于15%,符合GB/T 27404—2008的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范要求[28],方法具有良好的準(zhǔn)確和精密度,適用于糧食中19種真菌毒素的日常檢測(cè)。

      表7 回收率和精密度結(jié)果(n=6)

      續(xù)表7

      2.4.3 質(zhì)控樣品的考察

      為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和適用性,使用建立的檢測(cè)方法對(duì)FAPAS能力測(cè)試樣品玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(TCL0406QC)進(jìn)行檢測(cè)。如表8所示,10種真菌毒素的檢測(cè)值均在范圍內(nèi),且接近標(biāo)示值,表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法準(zhǔn)確可靠。

      表8 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)玉米中各真菌毒素檢測(cè)結(jié)果

      2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

      應(yīng)用建立的方法,對(duì)來自不同產(chǎn)地的14份小麥和14份玉米樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表6所示。玉米主要受到嘔吐毒素、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮的污染,其中嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的檢出率均為86%;我國真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017對(duì)谷物及其制品中DON和ZEN的限量為1 000、60μg/kg[12],而樣品中DON和ZEN的含量為1 870.25、266.75 μg/kg,嚴(yán)重超過國家限量標(biāo)準(zhǔn),超標(biāo)率均為43%;而小麥中主要污染的毒素為15-AC-DON、DON、FB1,小麥中各真菌毒素均未超過國家限量。為確保糧食質(zhì)量安全,在糧食種植和生產(chǎn)的過程中進(jìn)行真菌毒素的監(jiān)測(cè)十分有必要。

      表9 小麥、玉米實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

      3 結(jié)論

      本研究基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)定量,建立了小麥和玉米中19種真菌毒素的精準(zhǔn)檢測(cè)方法。該方法靈敏度高、前處理簡單、分析速度快。經(jīng)驗(yàn)證,準(zhǔn)確度和精密度滿足方法學(xué)要求,方法定量限遠(yuǎn)低于我國國家標(biāo)準(zhǔn)小麥和玉米中真菌毒素最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn),適用于批量糧食樣品中多種類真菌毒素殘留污染的快速篩查和精準(zhǔn)定量檢測(cè)。

      猜你喜歡
      內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液乙腈
      高純乙腈提純精制工藝節(jié)能優(yōu)化方案
      煤化工(2022年3期)2022-07-08 07:24:42
      氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)洗滌劑中的甲醇
      有機(jī)熱載體熱穩(wěn)定性測(cè)定內(nèi)標(biāo)法的研究
      碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的均勻性、穩(wěn)定性及不確定度研究
      GC內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定青刺果油中4種脂肪酸
      中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:32
      Portal vein embolization for induction of selective hepatic hypertrophy prior to major hepatectomy: rationale, techniques, outcomes and future directions
      標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及使用中容易忽略的問題
      中國氯堿(2016年9期)2016-11-16 03:07:39
      核磁共振磷譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定磷脂酰膽堿的含量
      丁二酮肟重量法測(cè)定雙乙腈二氯化中鈀的含量
      銅標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及定值
      沭阳县| 新宾| 阳山县| 秭归县| 漳州市| 西平县| 博客| 西畴县| 南溪县| 金沙县| 河津市| 克什克腾旗| 来安县| 沈丘县| 梅河口市| 荣成市| 广昌县| 陆良县| 泽普县| 天等县| 探索| 舒兰市| 镇远县| 霞浦县| 安岳县| 福泉市| 泸溪县| 乐山市| 弋阳县| 昔阳县| 南木林县| 廉江市| 平顶山市| 钟祥市| 合作市| 诏安县| 德州市| 昭觉县| 朝阳市| 长寿区| 定兴县|