超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法評(píng)價(jià)白芍-甘草對(duì)抑郁大鼠大腦皮層中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

杜暉，楊會(huì)鴿，劉鵬鳴，任靜（.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 70054；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，西安 70038）

抑郁癥是以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的慢性綜合性腦疾病。隨著生活與工作節(jié)奏的加快，抑郁癥的發(fā)病率逐年上升。全球抑郁癥患者約為3.4億，且患者數(shù)量還在以每年11.3%的速率增長(zhǎng)[1-2]。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，它與應(yīng)答反應(yīng)和大腦血流變化的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[3]。5-HT、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺（dopamine，DA）等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在正常生物體內(nèi)存在動(dòng)態(tài)平衡，參與抑郁發(fā)生的全過(guò)程[4]。分析這些單胺遞質(zhì)可為包括抑郁癥在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的研究提供重要依據(jù)。通常這類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法有液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)[5-6]、熒光檢測(cè)[7-8]和質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]。質(zhì)譜法以其靈敏度高而特別適用于神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的定量分析。白芍、甘草是治療抑郁癥較常用的配伍組合，在四逆散、逍遙散和柴胡舒肝散等眾多古方中均有記載。本研究采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法考察白芍-甘草藥對(duì)對(duì)抑郁大鼠大腦中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，從而進(jìn)一步探討這種變化與抑郁發(fā)生的關(guān)系。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q Advantage超純水機(jī)（美國(guó)Merck Millipore公司）；MS105十萬(wàn)分之一天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BSA124S-CW萬(wàn)分之一天平（德國(guó)Sartorius公司）；HC-3018R低溫冷凍高速離心機(jī)（合肥科大創(chuàng)新股份有限公司）。

1.2 試藥

白芍和甘草飲片（市售藥材，產(chǎn)地陜西，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院孫濤副主任藥師鑒定為符合《中國(guó)藥典》2020年一部要求的合格飲片）；重酒石酸去甲腎上腺素（批號(hào)：100169-201103，純度：94.5%）、鹽酸多巴胺（批號(hào)：100070-201006，純度：100.0%）和5-HT（批號(hào)：111656-200101，純度：100.0%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鹽酸丁螺環(huán)酮片（規(guī)格：5 mg，批號(hào)：20210509，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；4-乙基鄰苯二酚（4-EC，美國(guó)Sigma公司）；甲醇、乙腈、甲酸和乙酸（色譜純，德國(guó)Merck公司）；高氯酸和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）（分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；健康SD大鼠（5～7周齡，約250 g，西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK2007-001）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 樣品溶液的制備 白芍飲片1000 g，10倍水合煎3次，減壓濃縮至每毫升相當(dāng)于飲片2 g；白芍、甘草飲片各500 g，10倍水合煎3次，減壓濃縮至每毫升相當(dāng)于飲片2 g。

2.1.2 蛋白沉淀溶液的制備 取高氯酸和EDTA-2Na適量，用水稀釋制成含0.1 mol·L－1高氯酸和0.1 mmol·L－1EDTA的蛋白沉淀溶液。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)工作溶液的制備 精密稱取4-EC適量，用蛋白沉淀溶液配制成質(zhì)量濃度為1 μg·mL－1的溶液。

2.1.4 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取重酒石酸去甲腎上腺素、鹽酸多巴胺和5-HT對(duì)照品各10 mg，置同一100 mL量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液；精密量取儲(chǔ)備液1 mL，置100 mL量瓶中，用蛋白沉淀溶液稀釋至刻度；再精密量取上述溶液0.2、0.5、1、2、5和10 mL，置100 mL量瓶中，分別加入內(nèi)標(biāo)工作溶液1 mL，用蛋白沉淀溶液稀釋制成約2、5、10、20、50和100 ng·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 安捷倫 C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈（90∶10）；流速0.3 mL·min－1；柱溫30℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI＋）；接口溫度：300℃；脫溶劑溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；霧化器流量：3.0 L·min－1；干燥器流量：10.0 L·min－1；加熱器流量：10.0 L·min－1。質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1 4種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Fig 1 MS parameters of the 4 compounds

2.3 慢性應(yīng)激大鼠抑郁模型的建立

雄性SD大鼠50只，分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分成A～E 4組，每組10只。A為空白組，B為模型組，給予蒸餾水；C為陽(yáng)性對(duì)照組，按照1.0 mg·kg－1劑量灌胃給予丁螺環(huán)酮；D和E分別為白芍組和白芍-甘草組，按照5 g·kg－1劑量灌胃給藥。采用長(zhǎng)期不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激建立慢性應(yīng)激大鼠抑郁模型，除A組外，每組接受多種不同應(yīng)激，包括禁食和禁水（24 h）、夾尾（2 min）、冰水游泳（5 min）、搖晃（2次·s－1，10 min）、擁擠（10只一籠）和晝夜顛倒，每日刺激1次，順序隨機(jī)，持續(xù)20 d。造模第21日，C～E組開(kāi)始每日1次給藥，連續(xù)給藥14 d。在造模開(kāi)始后，分別在每日下午4點(diǎn)稱量每只大鼠的體質(zhì)量，比較每組大鼠在體質(zhì)量增長(zhǎng)方面的差異。

2.4 蔗糖偏嗜度實(shí)驗(yàn)

蔗糖偏嗜度實(shí)驗(yàn)在禁食和禁水12 h后進(jìn)行，訓(xùn)練開(kāi)始前予大鼠適應(yīng)飲用蔗糖水。訓(xùn)練開(kāi)始后，第1日在籠內(nèi)放置兩瓶均裝有1%蔗糖水的水瓶；第2日放置一瓶1%蔗糖水，一瓶純水，并相隔2 h交換水瓶位置；第3日禁水禁食；第4日放置一瓶1%蔗糖水和一瓶純水，進(jìn)行2 h飲水量測(cè)定。通過(guò)稱飲水瓶質(zhì)量測(cè)定純凈水和蔗糖水飲用量，以快感缺乏的客觀指標(biāo)蔗糖偏嗜度[蔗糖偏嗜度（%）＝蔗糖水飲用量/（蔗糖水飲用量＋純凈水飲用量）×100%]作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，比較造模前后各組動(dòng)物蔗糖偏嗜度的變化。

2.5 樣品溶液的制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后將大鼠斷頭處死，分取大鼠大腦皮層組織，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗盡其他殘留組織，輕輕擦干，記錄組織的質(zhì)量。精密稱取約0.2 g，在冰浴內(nèi)的玻璃勻漿管中勻至糜狀，加入約5 mL的蛋白沉淀液，12 000 g離心20 min，取上清液再次12 000 g離心20 min，取上清液按一定比例加入內(nèi)標(biāo)工作溶液，并定容至10 mL，即得。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 線性范圍、檢測(cè)限和定量限 精密量取“2.1.4”項(xiàng)下的系列混合對(duì)照品溶液，分別注入U(xiǎn)PLC-MS/MS，以主成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值y對(duì)質(zhì)量濃度x（ng·mL－1）進(jìn)行線性回歸，分別以信噪比為3和10時(shí)，測(cè)定3種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ），具體見(jiàn)表2。

表2 3種化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab 2 Linear equations，ranges，correlation coefficients (r)，LODs and LOQs of the three compounds

3.1.2 回收率和精密度考察 精密稱取大腦皮層樣品約0.20 g，置15 mL具塞離心管中，分別精密加入低、中、高3個(gè)濃度水平（0.2、0.5、2 μg·g－1）的混合對(duì)照品溶液，按“2.5”項(xiàng)下方法配制樣品溶液，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3，3種神經(jīng)遞質(zhì)的平均回收率在83.7%～94.1%，RSD均小于9.0%。

表3 3種化合物的加樣回收率(%)Tab 3 Spiked recovery of the 3 compounds (%)

3.1.3 穩(wěn)定性考察 將高濃度水平的回收率測(cè)試液保存在4℃環(huán)境中，并在6、12、24和48 h后進(jìn)樣分析，3種化合物的含量變化小于7.2%，說(shuō)明樣品溶液在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

3.1.4 流動(dòng)相的考察 考察0.1%乙酸-乙腈（A）、0.1%乙酸-甲醇（B）、0.1%甲酸-乙腈（C）和0.1%甲酸-甲醇（D）等4種流動(dòng)相體系對(duì)待測(cè)化合物離子化強(qiáng)度的影響。由于實(shí)驗(yàn)采用0.1 mol·L－1高氯酸作為蛋白沉淀溶液，故在水相中添加酸保持溶劑與流動(dòng)相酸度大體一致，從而增強(qiáng)了色譜體系的穩(wěn)定性。當(dāng)水中添加乙酸時(shí)，5-HT的靈敏度較甲酸明顯降低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)3種神經(jīng)遞質(zhì)在甲醇體系中塔板數(shù)略低，所以最終選擇0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相體系。

3.1.5 樣品稀釋溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)中分別考察了蛋白沉淀溶液、流動(dòng)相和水溶液作為樣品稀釋溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相和水溶液的質(zhì)譜信號(hào)噪音較大，且重現(xiàn)性較差。最終確定0.1 mol·L－1高氯酸作為樣品稀釋溶劑。由于金屬離子會(huì)加速單胺遞質(zhì)的氧化，故稀釋溶劑中加入0.1 mmol·L－1EDTA與金屬離子絡(luò)合。

3.1.6 專屬性考察 分取“2.1.2”項(xiàng)下蛋白沉淀溶液和“2.5”項(xiàng)下樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件分析測(cè)定，結(jié)果如圖1所示，表明蛋白稀釋溶液在4種化合物峰位處均無(wú)干擾，該法具有良好的專屬性。

圖1 4種化合物的MRM圖Fig 1 MRM chromatograms of the 4 compounds

3.2 行為學(xué)測(cè)試

在應(yīng)激之前，對(duì)照組大鼠蔗糖偏嗜度[（78.9±6.9）%]與模型組大鼠[（81.3±6.1）%]無(wú)明顯差異（P＞0.05）。造模34 d后，模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，而陽(yáng)性對(duì)照組、白芍組和白芍-甘草組大鼠上述情況均有改善。與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯變慢（P＜0.01），蔗糖偏嗜度[（48.3±2.9）%]顯著降低（P＜0.01），提示大鼠造模成功；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組體質(zhì)量增長(zhǎng)速率和蔗糖偏嗜度[（83.1±5.8）%]百分比均明顯提高（P＜0.01），顯著高于白芍組和白芍-甘草組（P＜0.05）。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果

如圖2所示，與空白組比較，模型組大鼠大腦皮層中5-HT、NE和DA含量均明顯降低（P＜0.01），結(jié)合行為學(xué)指標(biāo)，說(shuō)明造模成功。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和藥物組均能升高大鼠大腦皮層中5-HT、NE和DA的含量，其中陽(yáng)性對(duì)照組變化最大，且白芍-甘草組相較于白芍組更接近空白組。

圖2 藥物對(duì)大鼠大腦皮層中5-HT、NE和DA含量的影響Fig 2 Effect of the drugs on the contents of 5-HT、NE and DA in the rat cerebral cortex

4 討論

本研究采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激法建立抑郁大鼠模型，該法操作簡(jiǎn)便、可靠性高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑郁癥的發(fā)病與5-HT、NE和DA等含量降低有密切關(guān)系。5-HT是抑郁病癥中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，它的降低可能引起抑郁發(fā)作。本研究選取的模型藥物5-HT再攝取抑制劑丁螺環(huán)酮是新型的一線抗抑郁藥物，它通過(guò)選擇性地抑制5-HT重?cái)z取，增加突觸間隙內(nèi)5-HT的濃度，發(fā)揮抗抑郁作用[11-12]。有研究表明，抑郁癥可能會(huì)抑制NE的合成和釋放，導(dǎo)致突觸間隙中NE濃度降低[13]。腦內(nèi)NE代謝產(chǎn)物為3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇，其可作為評(píng)價(jià)抑郁癥發(fā)生及發(fā)展的指標(biāo)，提示抑郁癥發(fā)生及發(fā)展與NE密切相關(guān)[14]。有報(bào)道稱，與正常人比較，抑郁癥患者前額葉、紋狀體和海馬等功能區(qū)的DA含量降低，相關(guān)突觸功能下調(diào)[15]。上述研究表明3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量水平與抑郁癥的發(fā)病有著密切關(guān)系。

盡管治療抑郁癥的化學(xué)藥物不斷更新，但是均有不同程度的毒副作用，如起效慢、嗜睡、體質(zhì)量增加等；遠(yuǎn)期療效不確切且存在用藥依賴，復(fù)發(fā)率非常高，嚴(yán)重影響了在我國(guó)的臨床推廣和使用[16]。因此，尋求安全有效的治療抑郁癥的藥物是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。中醫(yī)“抑郁”應(yīng)歸為郁癥、虛勞等疾病。白芍具柔肝養(yǎng)血、斂陰止痛的功效，廣泛用于郁癥的防治[17-18]；甘草有健脾寧心、和中緩急、調(diào)和諸藥之功效[19-20]，兩者配伍肝脾同治，共奏緩肝和脾、益血養(yǎng)陰之功，為治療郁癥的常見(jiàn)組方。本研究結(jié)果表明，白芍-甘草配伍能顯著提高大鼠大腦皮層中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量水平；白芍-甘草組方效果相較于白芍單藥更接近空白組，但在治療郁癥中白芍-甘草不同提取部位對(duì)結(jié)果的影響及協(xié)同作用機(jī)制尚不明確。

本研究通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相和前處理步驟，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定5-HT、NE和DA等3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的方法。研究表明，白芍-甘草藥對(duì)較模型組能顯著提升抑郁大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速率和蔗糖偏嗜度百分比，并能提高抑郁大鼠大腦皮層中神經(jīng)遞質(zhì)的含量水平。