嚴(yán)赟，郭雯雯，林小娟，張赟赟，楊海船，王彩玉，黃莉（.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧 500；.廣西食品藥品檢驗所，南寧 500；.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 54004）

網(wǎng)絡(luò)雞血藤根是豆科植物網(wǎng)絡(luò)崖豆藤Millettia reticulataBenth.的干燥根，瑤族習(xí)用藥材?！度珖胁菟巺R編》《中國民族藥志要》《中國瑤藥學(xué)》《廣西藥用植物名錄》等對其原植物、藥用價值、地理分布等情況均有簡要記述，其具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)、強筋骨、鎮(zhèn)靜的功效，用于治療風(fēng)濕筋骨痛、四肢麻木、腰膝酸痛、癱瘓、貧血、遺精、盜汗、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、跌打損傷等病癥，為多民族使用的民間草藥[1-4]。目前尚無國家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)對網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材進行質(zhì)量控制和評價，近年來，廣西打造特色健康醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，鼓勵壯瑤藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大，因此有必要全面地評價網(wǎng)絡(luò)雞血藤根的化學(xué)成分，建立能有效、全面控制該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。中藥成分復(fù)雜，利用中藥指紋圖譜中的相似度分析評定各批次樣品指紋圖譜間的相似程度，描述它們各自化學(xué)組分的差異性和波動情況，能更全面地反映出藥材的質(zhì)量[5-8]。主成分分析是近年來中藥指紋圖譜結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計方法形成的一種方法研究。中藥為多成分物質(zhì)且很多成分均未有研究報道，主成分分析是為了預(yù)測該中藥可能的主要作用成分，對于該中藥進行后期的物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立以及藥效藥理等方面的研究具有指導(dǎo)意義[9-12]。本試驗采用高效液相色譜法對10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材進行分析，建立HPLC指紋圖譜進行相似度分析，并結(jié)合聚類分析和主成分分析，為不同產(chǎn)地的網(wǎng)絡(luò)雞血藤根質(zhì)量評價提供理論依據(jù)和參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Milli-Q超純水儀（德國默克）；XS205DU型電子天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；S120H超聲儀（德國艾爾瑪）。

1.2 材料

對照品芒柄花素（批號：111703-200501，供鑒別用，中國食品藥品檢定研究院，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.12%）；乙腈、磷酸、甲醇、三氯甲烷均為色譜純，其他化學(xué)試劑為分析純，水為超純水；10批廣西不同產(chǎn)地網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材（見表1），經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為豆科植物網(wǎng)絡(luò)崖豆藤的干燥根。

表1 網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材來源信息表Tab 1 Source of Millettia reticulata radix

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Purospher STAR RP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）和0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2），流速1.0 mL·min－1，檢測波長249 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 供試品溶液的制備

稱取網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材粉末（過2號篩）約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液50 mL超聲提?。üβ剩?00 W，頻率：37 kHz）30 min，過濾，藥渣用30 mL三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液洗滌3次，每次10 mL，合并濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解定容到5 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取芒柄花素對照品15.74 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解定容作為對照品儲備液，精密吸取上述對照品儲備液3 mL置20 mL的量瓶中，加甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為23.61 μg·mL－1的對照品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批（S1）網(wǎng)絡(luò)雞血藤根樣品，按“2.2”項下的方法制備，連續(xù)進樣6次，記錄指紋圖譜，以4號峰為參照物峰，結(jié)果各共有峰相對峰面積的RSD為0.14%～4.9%，相對保留時間的RSD為0.091%～1.8%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批（S1）網(wǎng)絡(luò)雞血藤根樣品，按照“2.2”項下條件平行制備6份，進樣測定，記錄指紋圖譜，以4號峰為參照物峰，結(jié)果各共有峰相對峰面積的RSD為2.2%～4.9%，相對保留時間的RSD為0.10%～0.13%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批（S1）網(wǎng)絡(luò)雞血藤根樣品，按照“2.2”項下方法進行制備，分別在0、1.5、3、6、12、24 h，進樣測定，以4號峰為參照物峰，結(jié)果各共有峰相對峰面積的RSD為0.18%～4.3%，相對保留時間的RSD為0.060%～0.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立

分別取10批不同產(chǎn)地網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，并導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行全譜匹配，以S1號色譜圖為參照圖譜，采用中位數(shù)法生成共有模式R，共確定了17個共有色譜峰（見圖1）。經(jīng)過與對照品圖譜對比，指認(rèn)13號峰為芒柄花素（見圖2），4號峰峰面積較大，且分離度符合要求，故設(shè)為參照物峰，計算得到10批圖譜中各共有峰相對保留時間的RSD值均小于1.1%，表明各共有色譜峰保留時間穩(wěn)定，但相對峰面積的RSD值為53.9%～146.4%（見表3），差異較大。說明10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材在化學(xué)成分種類上具有一致性，但各批次同一成分的含量差異明顯。

圖1 10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材HPLC指紋圖譜重疊圖Fig 1 Overlapping map of the HPLC fingerprints of 10 batches of Millettia reticulata radix

圖2 芒柄花素對照品Fig 2 Formononetin reference substance

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 指紋圖譜相似度分析

采用國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），計算10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材的相似度，以S1號色譜圖為參照圖譜，采用多點校正法進行色譜峰匹配，中位數(shù)法生成共有模式（R），結(jié)果各批藥材的相似度值在0.801～0.951（見表4），說明各產(chǎn)地的藥材有較好的一致性，本研究建立的指紋圖譜可以用于網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材的質(zhì)量控制。

表4 10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材相似度分析結(jié)果Tab 4 Similarity analysis of 10 batches of Millettia reticulata radix

3.2 聚類分析

以網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材HPLC指紋圖譜的17個共有峰的峰面積為特征，得到 17×10階原始數(shù)據(jù)矩陣，運用 SPSS 23.0 分析軟件對其進行聚類分析，采用組間連接法，以歐式平方距離為測度，Z標(biāo)準(zhǔn)化，對樣品進行聚類分析，結(jié)果如圖3。當(dāng)分類距離為10時，10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材可以聚為三大類，其中S1、S4、S6、S7、S8、S9、S10 聚為第Ⅰ類；S2、S3聚為第Ⅱ類；S5單獨聚為第Ⅲ類。

圖3 10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材聚類分析圖Fig 3 Cluster analysis diagram of 10 batches of Millettia reticulata radix

3.3 網(wǎng)絡(luò)雞血藤根指紋圖譜的主成分分析

主成分分析運用數(shù)學(xué)中的降維思想，在基本保留原始指標(biāo)信息的前提下，以互不相關(guān)的綜合指標(biāo)來反映原始指標(biāo)所提供的信息。將10批樣品的17個共有峰的峰面積作為變量，通過SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)Z標(biāo)準(zhǔn)化處理，并作為新變量進行主成分分析。計算主成分的特征值及方差貢獻率見表5。從表5可以看出，網(wǎng)絡(luò)雞血藤根主成分分析中成分1、2、3、4 主成分的特征值均＞1，累積方差貢獻率87.219%。進一步分析主成分載荷矩陣，主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小和作用方向，載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大，見表6，從表6可以看出，主成分1 的信息來自色譜峰1、3、6、13、16，其中13號峰為芒柄花素，主成分2 的信息來自色譜峰9、12、14，主成分3 的信息來自色譜峰8、10，主成分4 的信息來自色譜峰4、15。

表5 主成分特征值及方差貢獻率Tab 5 Principal component eigen values and variance contribution rate

表6 主成分載荷矩陣Tab 6 Principal component loading matrix

4 討論

本研究對10批不同產(chǎn)地網(wǎng)絡(luò)雞血藤根的HPLC指紋圖譜進行相似度分析、聚類分析和主成分分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材之間相似度均大于0.8，說明藥材中化學(xué)成分相似度較高，各產(chǎn)地的藥材有較好的一致性。但是不同產(chǎn)地藥材各共有峰含量差異較大，通過對10批藥材指紋圖譜以及17個共有峰峰面積的比較，發(fā)現(xiàn)相似度低于0.9的4批藥材呈現(xiàn)兩個極端，S4、S7、S9指紋圖譜各峰含量相比其他批次都較小，17個共有峰峰面積總和排名最后三位，S5指紋圖譜各峰含量是10批藥材中最高的，17個共有峰峰面積總和排名第一，是排名最后的S7總峰面積的5倍多，證明了藥材的生長環(huán)境對藥材有效成分的含量影響非常大，這對我們后期規(guī)范種植選址具有重要的參考意義。

采用SPSS 23.0分析軟件系統(tǒng)聚類發(fā)現(xiàn)，可聚為三大類，其中S1、S4、S6、S7、S8、S9、S10 聚為第Ⅰ類；S2、S3聚為第Ⅱ類；S5單獨聚為第Ⅲ類。由圖3可以看出S5被單獨聚為一類，S4、S7、S9在第Ⅰ類中被單獨聚為一小類，與相似度分析的結(jié)果基本一致。

采用SPSS 23.0分析軟件進行主成分分析，確定 4個主成分，其方差貢獻率依次為39.421%、23.888%、15.202%、8.708%，累積方差貢獻率為87.219%，代表了網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材80%以上的信息。進一步分析主成分載荷矩陣，考察各峰對主成分的貢獻大小。結(jié)果表明色譜峰1、3、6、13、16，對主成分1的貢獻率較大，可作為網(wǎng)絡(luò)雞血藤根質(zhì)量評價指標(biāo)成分，其中13號峰為芒柄花素，為后期含量測定標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)和參考。

傳統(tǒng)瑤藥由于成分復(fù)雜，需要利用現(xiàn)代色譜技術(shù)對盡可能多的化學(xué)成分進行表征。本試驗建立了不同產(chǎn)地網(wǎng)絡(luò)雞血藤根藥材 HPLC 指紋圖譜，對其中1個共有峰進行了化學(xué)成分指認(rèn)，初步反映了網(wǎng)絡(luò)雞血藤根整體化學(xué)特征，同時結(jié)合聚類分析和主成分分析多方面評價網(wǎng)絡(luò)雞血藤根質(zhì)量，為其整體質(zhì)量控制提供了依據(jù)。