甲醛/二氧六環(huán)預處理慈竹制單糖及乳酸

馬騰飛，戰(zhàn)雅微，劉 悅，李志強

(國際竹藤中心；國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學與技術重點實驗室，北京 100102)

隨著塑料的使用范圍越來越廣，產(chǎn)生的塑料廢棄物也越來越多，其中包裝材料、農(nóng)用材料、醫(yī)用材料等占據(jù)絕大部分[1-2]。以乳酸為單體、經(jīng)化學方法合成的聚乳酸是一種新型生物降解材料。乳酸是一種極具潛力和用途廣泛的生物質(zhì)衍生化學平臺化合物。目前我國乳酸工業(yè)化生產(chǎn)主要采用玉米為原料，經(jīng)粉碎、液化、水解、發(fā)酵生產(chǎn)乳酸[3]。雖然以玉米淀粉制備乳酸的技術已較為成熟，但是受國際環(huán)境變化及2020年新冠肺炎疫情影響，工業(yè)化生產(chǎn)乳酸勢必要面臨與人爭糧的嚴重問題。以玉米秸稈、大豆秸稈、玉米芯、米糠和蔗渣等農(nóng)林廢棄物可制備乳酸，轉(zhuǎn)化率一般在20%～80%，暫未見竹材制備乳酸相關報道[4-6]。近年來我國竹材加工利用產(chǎn)業(yè)正蓬勃發(fā)展，竹林面積達641.16 hm2，可為竹產(chǎn)業(yè)提供充足的原料[7]。而主要竹產(chǎn)品的竹材原料利用率分別為：竹家具30%、竹席45%～50%、竹地板20%～25%，在對竹材采伐及加工利用過程中會產(chǎn)生大量廢竹[8]。因此，以竹材特別是竹材采伐和加工剩余物為原料制備液體燃料和化學品，是當前竹資源綠色可持續(xù)利用途徑之一[9]。本研究以竹材為原料，通過甲醛/二氧六環(huán)溶液預處理來破壞竹材的抗降解屏障，提高纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的得率，再利用水解液中的單糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，以期為竹材及其加工剩余物制備聚乳酸可降解材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

慈竹(BambusaemeiensisL.C.China & H.L.Fang)，兩年生，采于廣西壯族自治區(qū)崇左市江州區(qū)馱盧鎮(zhèn)。將竹材劈成竹條并烘干后，經(jīng)高速粉碎機粉碎，取粒徑0.25～0.38 mm的慈竹粉末備用。

1，4-二氧雜環(huán)己烷(二氧六環(huán))、鹽酸、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CaCO3、蛋白胨、甲醛和乳酸等，均為市售分析純。纖維素酶(C1794-5KU)，Sigma公司；β-葡萄糖苷酶，諾維信(中國)投資有限公司；乳酸菌酸奶發(fā)酵劑(4 g/L，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌)，北京川秀科技有限公司。

KYC-100C恒溫搖床；Metrohm 850離子色譜儀，瑞士萬通(中國)有限公司；100 mL水熱合成反應釜；YZJXFQ-6均相反應器；Quanta 200HV高分辨場發(fā)射環(huán)境掃描電鏡(SEM)，PHILIPS公司；X PERTPRO X射線衍射(XRD)儀，Panalytical公司；SBA-40E型葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所。

1.2 甲醛/二氧六環(huán)預處理竹材

稱取1.25 g竹粉，置于100 mL水熱合成反應釜中，依次加入45 mL二氧六環(huán)、2.1 mL鹽酸(或1.1 mL硫酸)和3～5 mL的甲醛試劑。將水熱合成反應釜置于均相反應器中，在溫度80 ℃，旋轉(zhuǎn)速率為20 r/min的條件下，預處理8 h。不加入甲醛的樣品在相同的條件下反應，作為對照樣。

預處理結束后，反應釜自然冷卻至室溫，打開密閉反應釜，使用真空泵、砂芯過濾裝置和45 μm孔徑有機系微孔過濾膜進行固液分離。向過濾后所得廢液中加入去離子水以析出木質(zhì)素沉淀，所得的濾液存于4 ℃ 冰箱中用于濾液化學成分分析。固體樣品先用25 mL二氧六環(huán)洗滌至淡黃色，以沖洗去除殘留的甲醛和鹽酸，再用去離子水對其洗滌直至洗滌水為無色，除去殘留的二氧六環(huán)。預處理得到的固體樣品取部分在103 ℃烘箱中烘干測量含水率，其余部分保存于4 ℃冰箱中用于化學成分分析和酶水解。每個預處理條件均進行3次試驗，結果記為平均值±標準差(SD)。

1.3 預處理后樣品酶水解

以預處理后得到的固體樣品用于酶水解實驗，在50 mL三角瓶中進行，底物添加量為20 g/L，添加到20 mL pH值為4.8的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液中，酶用量為纖維素酶10 FPU/g(以底物質(zhì)量計，下同)、β-葡萄糖苷酶30 IU/g(以底物質(zhì)量計，下同)。酶解溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，酶解時間為24 h，未經(jīng)預處理的竹粉原料作為空白對照。為了提高酶水解后葡萄糖的得率，對竹材預處理條件進行了優(yōu)化，將1.2節(jié)的2.1 mL鹽酸換成1.1 mL硫酸，酶解條件同時優(yōu)化為纖維素酶用量20 FPU/g、β-葡萄糖苷酶30 IU/g，酶解時間48 h。

1.4 酶水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸

將酶水解液置于高壓滅菌鍋中滅菌1 h，取出待其自然冷卻后，再加入1 mL營養(yǎng)鹽、0.3 g/L KH2PO4、5 g/L(NH4)2SO4、0.75 g/L MgSO4·7H2O、0.2 g/L ZnSO4·7H2O、10 g/L CaCO3、3.5 g/L蛋白胨。以NaHCO3調(diào)節(jié)酶解液至pH值為6.8，按酶水解液中葡萄糖質(zhì)量的3%接種量接入乳酸菌，在42 ℃、200 r/min 的條件下恒溫振蕩發(fā)酵24 h。

1.5 分析方法

1.5.1化學組分分析 原料慈竹和預處理固體樣品的纖維素、半纖維素含量按照美國國家可再生能源實驗室(NREL)推薦的方法測定[10]。

1.5.2SEM分析 預處理后固體樣品的表面形貌，采用Quanta 200HV高分辨場發(fā)射環(huán)境SEM進行觀察，放大倍數(shù)為500倍。

1.5.3XRD分析 預處理后固體樣品結晶度使用XRD儀分析，Cu靶Kα輻射(40 kV，40 mA)，譜圖范圍(2θ)為5～45 °，掃描速率為5(°)/min。每個樣品的相對結晶度(ICr)按Segal提出的經(jīng)驗公式進行計算：

式中：I002—晶格衍射極大強度；I15.8°—無定形區(qū)背景散射強度。

1.5.4乳酸質(zhì)量濃度測定 乳酸采用SBA-40E型葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀測定，該儀器以固定化酶為關鍵元件，配備兩支生物探測電極，可以在20 s內(nèi)得到葡萄糖及乳酸的定量分析結果，乳酸的最大檢出限為0.5 g/L。

2 結果與分析

2.1 預處理對竹材化學組成的影響

預處理是竹材生物轉(zhuǎn)化制取液體燃料及化學品過程中一個關鍵且高成本的步驟。表1列出了甲醛/二氧六環(huán)溶液中甲醛用量對預處理后固體樣品化學組成的影響。由表1可知，固體樣品得率在51.7%～55.3%之間。酸性二氧六環(huán)預處理可以脫除半纖維素和部分木質(zhì)素，從而提高了固體樣品中纖維素的含量。而添加不同體積的甲醛對預處理后固體樣品收率影響不大，原因是在預處理過程中甲醛不參與脫除半纖維素和木質(zhì)素，其主要與降解木質(zhì)素發(fā)生接枝反應，減少木質(zhì)素降解物再次發(fā)生團聚而影響后續(xù)酶水解效率。添加甲醛可以保留木質(zhì)素的反應活性[9]，為后續(xù)研發(fā)木質(zhì)素衍生產(chǎn)品打基礎。當甲醛添加量增加時，固體樣品中纖維素的含量會降低。從固體樣品中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三者之和來看，隨著甲醛量的加大，總含量就越小。原因可能是甲醛用量的增大導致二氧六環(huán)預處理效果降低，從而使底物中的木質(zhì)素與甲醛的接枝反應產(chǎn)物含量增加。

表1 甲醛用量對竹材固體樣品化學組成的影響1)

在對所有預處理廢液進行糖分分析后，發(fā)現(xiàn)廢液中的木糖含量可以忽略不計，說明在預處理過程中，半纖維素幾乎全部被降解了。這可能是由于二氧六環(huán)和HCl將半纖維素降解，與預處理溶劑中是否添加甲醛關系不大。

2.2 固體樣品分析

2.2.1SEM分析 圖1為竹材及其預處理固體樣品的SEM照片。由圖1(a)可知，未處理的竹粉表面尚有一層蠟質(zhì)。蠟質(zhì)層會阻礙纖維素對酶的吸附能力，從而降低酶水解效率[11]。而使用二氧六環(huán)作為有機溶劑的預處理可將竹材中大部分蠟質(zhì)溶解脫除，使酶與纖維素的可及度大幅增加，從而提高了酶水解葡萄糖得率。由圖1(b)可以發(fā)現(xiàn)，預處理底物不再成纖維束狀且結構疏松，表明木質(zhì)素脫除提高了孔隙率，增大反應可及性和底物比表面積。然而，伴隨甲醛添加量的逐步增大，預處理底物表面的纖維更加致密，反應可及性和比表面積減小，以至于酶不能輕易到達竹材內(nèi)部進行酶水解反應；其表面纖維卷曲程度也逐漸變小，說明甲醛的添加對木質(zhì)素和纖維素宏觀結構均起到了保護作用。

a.未處理竹材untreated bamboo；b.0 mL；c.3 mL；d.4 mL；e.4.5 mL；f.5 mL

2.2.2XRD分析 圖2為未處理竹材及添加不同體積甲醛預處理樣品的XRD圖。譜圖中各峰高均由同方向排列的晶面分布數(shù)量決定，樣品晶粒為同方向排列的峰高要大于樣品晶粒無規(guī)律排列的峰高；半峰寬由晶粒大小決定，峰寬值越小，晶粒越大。由圖可見，竹纖維的XRD衍射峰位出現(xiàn)在2θ為15.8°、22°、34°，為天然纖維素的特征峰[12]。樣品峰高隨著甲醛添加量的減少而增高，也證實了預處理底物纖維素含量是在增加的；峰寬變化不大，可忽略不計，表明預處理對結晶區(qū)晶粒尺寸影響較小。

a.未處理竹材untreated bamboo；b.0 mL；c.3 mL；d.4 mL；e.4.5 mL；f.5 mL

未處理竹材的結晶度為49.0%，而甲醛添加量為0、3.0、4.0、4.5、5.0 mL時，底物纖維素的結晶度分別為55.5%、56.7%、55.4%、53.5%和50.5%?？梢钥闯觯诩兹┨砑恿繛?.0 mL時，底物中纖維素含量為未處理竹材的1.9倍，但結晶度卻只是稍大于未處理竹材。原因可能是在脫除木質(zhì)素的同時，甲醛對底物纖維素無定形區(qū)乃至結晶區(qū)也起到了破壞降解作用。隨著甲醛添加量的減少，底物的結晶度隨之增大，這可以說明底物纖維素含量提高的同時，預處理對底物纖維素無定形區(qū)的降解作用也在加劇。

2.3 預處理對酶水解的影響

以預處理后固體樣品為底物，在纖維素酶用量10 FPU/g、酶水解時間24 h時的酶水解結果如表2所示(總糖得率即水解后六碳糖和五碳糖的得率之和)。由表2可得，不添加甲醛的預處理還原糖得率高達94.0%，葡萄率得率33.2%，均高于添加甲醛的預處理底物的酶解效果。這表明不添加甲醛的預處理過程中大部分木質(zhì)素及半纖維素被脫除，從而提高了底物纖維素含量，有助于酶水解反應的進行。

表2 預處理底物的酶水解性能

甲醛的加入會增大底物中木質(zhì)素的含量，導致預處理底物難以被酶水解。在酸性少水的環(huán)境中，甲醛與木質(zhì)素側(cè)鏈發(fā)生縮醛反應，阻止了芐基陽離子的形成；其次，被質(zhì)子化的甲醛進攻芳香環(huán)甲氧基的對位或鄰位，通過親電芳香取代形成羥甲基結構，從而使這些反應性位置被穩(wěn)定下來[13]。以二氧六環(huán)為溶劑，甲醛為主要化學添加劑的化學預處理過程中，甲醛可以對木質(zhì)素起到保護作用，但也間接的保護了纖維素，導致預處理底物的酶水解效率低下。但甲醛保留了木質(zhì)素的活性，對后續(xù)研發(fā)高附加值木質(zhì)素衍生產(chǎn)品有重要意義。竹材綜纖維素可水解生成單糖進而發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，加上活性木質(zhì)素用于研發(fā)高附加值衍生產(chǎn)品，從而可實現(xiàn)竹材的全組分利用[14-15]。

2.4 底物酶水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸

采用優(yōu)化后的預處理的酸和甲醛添加量(表3)，在其他預處理條件不變的情況下得到預處理的固體樣品；再將底物用于酶水解，酶水解過程的酶用量為纖維素酶20 FPU/g和β-葡萄糖苷酶30 IU/g，酶水解時間48 h；酶水解液用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，結果如表3所示。

表3 竹材酶水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸的預處理條件及結果

從表3中可以看到，纖維素酶增加為20 FPU/g(以底物質(zhì)量計)后，不添加甲醛的底物酶水解葡萄糖得率有了顯著的提高，最高可達92.8%，但樣品2和4的乳酸得率卻不高。相比較樣品2和4，樣品1和3因為添加甲醛的緣故，酶水解產(chǎn)葡萄糖得率不高，但乳酸得率卻較高，原因可能是其葡萄糖濃度較低對乳酸菌的反饋抑制作用較弱或是由于酶水解液中葡萄糖濃度低以及葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀的檢測精度較低的原因。

與添加鹽酸的預處理相比，添加硫酸的預處理底物的乳酸得率較高，樣品4比樣品2的乳酸得率高12.2個百分點，主要是因為稀硫酸處理能降低底物纖維素的平均聚合度，形成多孔或溶脹型的結構，增大反應能力，有益于乳酸菌的發(fā)酵[16]。發(fā)酵結束后，還測定了發(fā)酵液中殘留的糖含量，結果發(fā)現(xiàn)殘留的糖可以忽略不計，表明糖類已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化消耗掉了。但縱觀4個樣品的乳酸得率均偏低，究其原因可能是水解發(fā)酵液中葡萄糖含量不高，在發(fā)酵過程中很大一部分可能作為營養(yǎng)物質(zhì)被乳酸菌消耗了，也可能與乳酸菌活力及營養(yǎng)鹽配置有關。同時，對比樣品1和樣品2，及樣品3和樣品4可得出，添加甲醛的預處理樣品酶水解性能普遍降低，但酶水解液發(fā)酵后乳酸的得率增高。進一步表明，甲醛的添加對纖維素酶酶解有抑制作用，而對乳酸菌發(fā)酵有促進作用。未來可從微生物學角度來開展進一步研究，從而探索出竹材制備乳酸的最佳工藝路線。

3 結 論

3.1酸性甲醛/1,4-二氧六環(huán)溶液預處理竹材可以脫除半纖維素和木質(zhì)素，大幅提高固體樣品中纖維素的質(zhì)量分數(shù)至75.6%～90.7%。

3.2預處理后底物在纖維素酶用量20 FPU/g、β-葡萄糖苷酶用量30 IU/g和酶解時間48 h條件下，酶水解后纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的最高得率為92.8%；酶水解液可以直接用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的得率最高可達73.2%。

3.3甲醛/1,4-二氧六環(huán)溶液預處理過程可使竹材表面蠟質(zhì)層幾乎完全被溶解脫除，得到的底物結構變得疏松，從而有效提高了竹材纖維素酶解和發(fā)酵效率。