鉀元素對(duì)蘋果樹腐爛病菌生長發(fā)育的影響

李玉玲，楊軍玉，韓澤園，孟祥龍，曹克強(qiáng)，王樹桐

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001）

由黑腐皮殼菌（Valsa maliMiyabe et Yamada）引起的蘋果樹腐爛病是危害我國蘋果的主要病害之一［1-2］，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可導(dǎo)致毀園［3-4］，影響了我國蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［5］。礦物質(zhì)元素在病原真菌和寄主植物的生長發(fā)育中均起著至關(guān)重要的作用［6-7］，可以通過影響寄主對(duì)病原物的抗性或易感性，寄主的組織學(xué)或形態(tài)結(jié)構(gòu)或性能，以及病原物的表觀毒力和存活能力等來影響病害嚴(yán)重程度［8-9］。而鉀作為植物生長所需的大量元素，在植物生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用［10-11］。Perrenoud［12］綜述了關(guān)于鉀和植物健康的近2 450 篇文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)情況下，鉀的使用降低了真菌病害的發(fā)病率。Wang J等［13］發(fā)現(xiàn)鉀含量與腐爛病發(fā)生的嚴(yán)重程度呈密切相關(guān)。馬宏彪研究表明在蘋果葉片中鉀含量達(dá)到1.25%時(shí)，腐爛病在蘋果樹上不會(huì)發(fā)生［14］。而后有研究發(fā)現(xiàn)，提高蘋果樹的鉀含量可減少腐爛病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，特別是當(dāng)葉片鉀含量大于1.30%時(shí)，腐爛病菌侵染受到嚴(yán)重限制甚至難以侵染［15］。呂寧等的研究也表明，隨著枝條含鉀量的降低，腐爛病發(fā)生程度加重［16］。這些研究表明，樹體中鉀元素可以影響蘋果樹腐爛病的發(fā)生和發(fā)展，但是這些研究都認(rèn)為鉀元素對(duì)樹體的影響是腐爛病發(fā)生程度發(fā)生變化的原因。而針對(duì)鉀元素對(duì)腐爛病菌本身的影響尚未見報(bào)道。本研究以不同濃度鉀元素對(duì)腐爛病菌生長發(fā)育的影響作為切入點(diǎn)，系統(tǒng)研究了不同濃度鉀元素對(duì)腐爛病菌菌絲生長速率、干重、菌絲形態(tài)、孢子萌發(fā)等病菌生長發(fā)育過程的影響，通過鉀元素調(diào)控病菌的侵染，降低腐爛病危害，并為蘋果產(chǎn)業(yè)農(nóng)藥減施增效提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 蘋果腐爛病菌Vm470 菌株，采集自陜西省禮泉縣，由國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲害防控研究室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 所有處理組均使用滅菌的KCl粉劑，以純鉀(K2O)含量作為培養(yǎng)基鉀含量標(biāo)準(zhǔn)，KCl 處理濃度梯度參考孫廣宇等人蘋果樹葉鉀含量完全抑制腐爛病發(fā)生時(shí)的鉀含量［14,17］，經(jīng)測(cè)定未經(jīng)任何處理的半量PDA、半量PDB 的平均純鉀含量為0.22 g/L（c(K2O)=c(KCl)×0.63）。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。半量PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。半量PDB 培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g，葡萄糖10 g，水1 000 mL。這3 種培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃，20 min 高壓蒸汽滅菌。大麥粒培養(yǎng)基：每個(gè)100 mL 錐形瓶稱取浸泡好的大麥粒35 g，6%蜂蜜水10 mL 和1%蛋白胨10 mL，121 ℃，60 min高壓蒸汽滅菌。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度鉀對(duì)腐爛病菌菌絲生長速率的影響 將PDA 培養(yǎng)2 d 的Vm470 菌落邊緣用打孔器（?=5.0 mm）打取菌餅，將菌餅置于分別含有0.22、0.85、1.48、2.11、3.37、4.63、6.25、8.41、9.04、10.93、12.82、14.7、16.60 和19.12 g/L K2O的半量PDA（20 mL/皿）平板中培養(yǎng)，每個(gè)處理5次重復(fù)。置于（25±2）℃培養(yǎng)箱內(nèi)，分別黑暗培養(yǎng)24，36 和48 h 后，采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑的大小并記錄。

1.2.2 不同濃度鉀對(duì)腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響 將腐爛病菌菌餅置于分別含有0.22、1.48、3.37、6.52、9.04、12.82、16.60 和20.83 g/L K2O 的半量PDA（20 mL/皿）平板上，（25±2）℃黑暗培養(yǎng)，3 d后觀察菌落形態(tài)，顯微觀察菌絲形態(tài)并拍照。

1.2.3 不同濃度鉀對(duì)腐爛病菌菌絲干重的影響 將菌餅置于分別含有0.22、1.48、2.11、3.37、4.63、6.52、8.41、10.93、12.82、14.71、18.49、22.27、26.05 和29.20 g/L K2O 的半量PDB（100 mL/瓶）中，（25±2）℃ 140 r/min 搖床內(nèi)搖培72 h 后，取出菌絲團(tuán)，置于錫箔紙上，80 ℃ 恒溫烘干至恒重，稱量菌絲團(tuán)干重。

1.2.4 不同濃度鉀對(duì)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的影響 將菌餅置于大麥培養(yǎng)基中，于（25±2）℃ 恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，使用黑光燈照射12 h/d，直至產(chǎn)生孢子角。挑取新鮮的分生孢子角，制備孢子懸浮液［18］，濃度為1×105～1×106個(gè)/mL。在分別含有0.22、1.48、3.37、5.26、8.41、9.04、10.93、12.82、16.60、20.38 和22.90 K2O 的半量PDB 和半量PDA 培養(yǎng)基。

取50 μL 孢子懸浮液涂布平板，分別在18 和24 h 后檢查分生孢子萌發(fā)率。檢查時(shí)取培養(yǎng)皿上均勻分布的3 個(gè)點(diǎn)切取1 cm2的小塊，放在載玻片上，在顯微鏡下檢查孢子萌發(fā)狀況，每個(gè)小塊檢查100個(gè)孢子。

1.2.5 不同濃度鉀對(duì)腐爛病菌致病力的影響 分別用K2O 含量為0.22、3.37、7.78、12.82、16.60 和19.12 g/L的半量PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)腐爛病菌2 d 后，使用打孔器（?=5.0 mm）在菌落邊緣取新鮮菌絲，針刺接種至大小一致，健康的富士蘋果上，每組處理9 個(gè)蘋果，25 ℃保濕培養(yǎng)7 d 后，使用十字交叉法測(cè)量病斑橫、縱徑，計(jì)算病斑面積，并拍照記錄；用電烙鐵在生長狀況一致且健康的1 ～2 年生王林離體枝條上，距頂端 10 cm 處造成1 個(gè)燙傷傷口，隔15 cm 再燙傷1 個(gè)傷口，每個(gè)處理15 支枝條，每支枝條2 個(gè)傷口，將菌餅接種于枝條燙傷處，枝條兩端使用固體石蠟25 ℃ 保濕培養(yǎng)10 d 后［19］，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量枝條上下截面直徑，使用直尺測(cè)量枝條長度，計(jì)算樹枝表面積；十字交叉法測(cè)量病斑橫、縱徑，計(jì)算病斑面積，并拍照記錄。

分別將未經(jīng)任何處理的野生型Vm470 和KVm470 接種到生長狀態(tài)一致且健康的1 ～2 年生王林枝條上，方法同上，每組10 支枝條，25 ℃保濕培養(yǎng)10 d 后拍照記錄觀察病斑情況，

枝條發(fā)病率（%）=發(fā)病組織數(shù)/接種組織數(shù)×100

病斑面積（mm2）=π(圓周率)×a×b(其中a,b分別是病斑橫縱半徑)

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)整理及作圖所用軟件為 Microsoft Office Excel 2010，使用 SPSS22.0 軟件，LSD 法進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鉀元素對(duì)腐爛病菌菌絲生長的影響

如圖1 所示，鉀元素對(duì)于腐爛病菌菌絲生長的影響呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)高濃度抑制。當(dāng)純鉀含量為3.37 g/L 時(shí)，腐爛病菌菌絲生長速率最快，達(dá)到32 mm/d；鉀元素濃度高于此濃度后，腐爛病菌菌絲生長速率開始下降，當(dāng)純鉀含量高于8.41 g/L 時(shí)，開始抑制腐爛病菌菌絲的生長。

圖1 不同濃度鉀元素對(duì)蘋果樹腐爛病菌菌絲生長速率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of potassium on mycelial growth rate of apple tree Valsa mali

2.2 不同濃度鉀元素對(duì)腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響

正常的腐爛病菌菌落，菌絲長勢(shì)基本一致，呈現(xiàn)均勻的圓形菌落；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常生長的病菌菌絲細(xì)而直，粗細(xì)均勻一致，表面光滑，分枝間距較大，距離頂端較遠(yuǎn)，并且分支長勢(shì)良好（圖2-a）。與正常生長的病菌菌絲相比，在純鉀含量為1.48 g/L 和3.37 g/L 的腐爛病菌（圖2-b,c），整體菌落形態(tài)無明顯變化，但生長速率較正常菌絲更快；粗細(xì)無明顯變化，但是分支明顯增多，分支間距縮短、變密集，這也與菌落生長速率明顯增快相一致。而當(dāng)純鉀濃度為6.52 g/L 時(shí)，菌落邊緣開始呈現(xiàn)不規(guī)則且分層；菌絲分枝數(shù)減少并且出現(xiàn)分支長度較短（圖2-d）。當(dāng)純鉀含量在9.04 g/L 和12.82 g/L 時(shí)（圖2-e,f），菌落邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則羽狀，分層現(xiàn)象明顯，菌落表面略微油漬狀態(tài)；菌絲體變得纖細(xì)，菌絲分枝數(shù)急劇減少，分支間距增大，且大多數(shù)分支發(fā)育受阻。當(dāng)純鉀含量高于12.82 g/L 時(shí)，腐爛菌菌落邊緣呈不規(guī)則雪花狀，菌落表面油污狀；菌絲體明顯變細(xì)且表面粗糙彎曲畸形，分枝數(shù)很少，且大多數(shù)分支不能正常發(fā)育（圖2-g,h）。

圖2 不同濃度鉀元素對(duì)腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of potassium on the mycelial morphology of Valsa mali

2.3 不同濃度鉀元素對(duì)腐爛病菌菌絲干重的影響

菌絲干重受到鉀元素影響的規(guī)律與菌絲生長速率的規(guī)律基本一致，即低濃度促進(jìn)高濃度抑制（圖3），當(dāng)純鉀含量低于9.04 g/L 時(shí)促進(jìn)腐爛病菌菌絲生長，此時(shí)腐爛病菌的干重均高于對(duì)照組。而當(dāng)純鉀含量高于9.04 g/L 時(shí)，腐爛病菌菌絲生長受到抑制，菌絲干重均顯著低于對(duì)照組。

圖3 不同濃度鉀元素對(duì)蘋果樹腐爛病菌菌絲干重的影響Fig.3 Effects of different concentrations of potassium on dry weight of apple tree Valsa mali

2.4 不同濃度鉀元素對(duì)腐爛病菌孢子萌發(fā)的影響

不同鉀濃度對(duì)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的影響與對(duì)菌絲的影響規(guī)律基本一致。不同的是低濃度鉀含量并不能促進(jìn)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)（圖4）。但當(dāng)純鉀含量小于9.04 g/L 時(shí)，孢子萌發(fā)率在80%以上；當(dāng)純鉀含量達(dá)到22.9 g/L 時(shí)，基本可以完全抑制孢子萌發(fā)。相同的是當(dāng)純鉀含量低于9.04 g/L 時(shí)對(duì)孢子萌發(fā)抑制程度相對(duì)較低，萌發(fā)率高達(dá)80%，高于9.04 g/L時(shí)孢子萌發(fā)受到的抑制作用迅速增強(qiáng)，在12.82 g/L 時(shí)，孢子萌發(fā)率下降至44.4%。當(dāng)純鉀含量為22.9 g/L 時(shí)，孢子萌發(fā)幾乎受到完全抑制。

圖4 不同濃度鉀元素對(duì)蘋果樹腐爛病菌孢子萌發(fā)率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of potassium on spore germination rate of apple tree Valsa mali

2.5 不同濃度鉀元素對(duì)腐爛病菌致病力影響

用經(jīng)不同鉀濃度處理的腐爛病菌接種蘋果果實(shí)均能發(fā)病，但隨著鉀濃度的增加，腐爛病菌在蘋果果實(shí)上造成的病斑面積略有降低，在純鉀含量為16.6 g/L時(shí)相較于野生型菌株接種處理出現(xiàn)了極顯著的差異，但不同處理間的病斑大小無明顯規(guī)律（圖5）。

圖5 不同濃度鉀元素對(duì)蘋果樹腐爛病菌在蘋果果實(shí)上的致病力測(cè)定Fig.5 Determination of pathogenicity of different concentrations of potassium on apple fruit Valsa mali

用經(jīng)不同鉀濃度處理的腐爛病菌接種蘋果離體枝條，發(fā)病率均達(dá)到80 %以上，當(dāng)純鉀濃度為3.37 g/L 時(shí)病斑面積顯著高于其他處理（P<0.05），其他處理之間無顯著差異（見圖6）。

圖6 不同濃度鉀元素對(duì)蘋果樹腐爛病菌在蘋果枝條上的致病力測(cè)定Fig.6 Different concentrations of potassium on the apple tree Valsa mali pathogenic force measurement in apple branches

為了進(jìn)一步研究鉀元素對(duì)腐爛病菌的影響，從經(jīng)19.12 g/L 高鉀處理的腐爛病菌接種發(fā)病的果實(shí)上分離獲得1 株腐爛病菌菌株，命名為KVm470。并對(duì)野生菌株Vm470 及高鉀分離菌株KVm470 進(jìn)行致病性測(cè)定，其中野生型的發(fā)病率高達(dá)95%，KVm470 的發(fā)病率只有55 %。KVm470 與野生型Vm470 的發(fā)病情況相比，發(fā)病率、病斑面積及相對(duì)病斑面積均顯著低于野生型（圖7），這表明經(jīng)高鉀處理后腐爛病菌致病力下降，且具有一定程度的可遺傳性。

圖7 Vm470 和KVm470 在枝條上的致病性測(cè)定Fig.7 Vm470 and KVm470 from the branches of pathogenic determination

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，鉀元素對(duì)腐爛病菌菌絲生長速率及干重影響規(guī)律基本一致，均呈低濃度促進(jìn)高濃度抑制的關(guān)系，而與其孢子萌發(fā)率呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。在腐爛病菌菌絲生長率及干重測(cè)試中，鉀離子對(duì)菌絲生長從促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制的拐點(diǎn)濃度分別為8.41 和9.04 g/L。孫廣宇等［17］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葉片鉀含量＜9 mg/g 時(shí)，葉片鉀含量與腐爛病的發(fā)生程度呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，因此，本研究中菌絲干重試驗(yàn)中的9.04 g/L 作為從促進(jìn)轉(zhuǎn)向抑制的拐點(diǎn)濃度，與孫廣宇等的研究結(jié)果高度吻合。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鉀含量＞9.04 g/L 時(shí)，對(duì)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制顯著提高，當(dāng)鉀元素含量達(dá)到12.82 g/L 及以上濃度時(shí)，孢子萌發(fā)率急劇下降至44%以下。已有研究認(rèn)為在腐爛病菌侵染發(fā)育后期主要靠病原菌在病斑處產(chǎn)生分生孢子感染蘋果樹皮［20-21］，因此樹皮中鉀含量達(dá)到9 mg/g 及以上濃度時(shí)，病菌孢子萌發(fā)侵染和菌絲擴(kuò)展都會(huì)受到抑制。同時(shí)，在果園中發(fā)現(xiàn)當(dāng)枝條鉀含量超過7.5 g/kg 時(shí)，果樹韌皮部厚度就會(huì)增加，產(chǎn)生木質(zhì)化-木栓化阻隔帶［16］，這時(shí)蘋果樹腐爛病菌可以定殖但不能有效降解木質(zhì)部導(dǎo)管 ，從而阻隔了病斑擴(kuò)展。這些研究結(jié)果表明，鉀元素對(duì)蘋果樹腐爛病發(fā)生的影響既包括提升寄主的抗病性，也包括對(duì)病菌侵染和擴(kuò)展的直接抑制作用。

在致病性分析試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，除去極個(gè)別差異外，受到不同濃度鉀元素處理的腐爛病菌接種在果實(shí)及枝條上時(shí)所產(chǎn)生的病斑長度和面積均無顯著差異，這與劉向陽等人的研究結(jié)論基本一致［21］。但是從19.12 g/L 高鉀處理接種的病果上分離出的KVm470的致病能力明顯小于野生型Vm470。綜合來看，腐爛病菌在培養(yǎng)基上所受到的生長抑制在接種寄主時(shí)并未對(duì)其致病力產(chǎn)生相應(yīng)的影響，這可能是腐爛病菌恢復(fù)至正常生長環(huán)境條件所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。但本研究還發(fā)現(xiàn)，高鉀分離菌株KVm470 的致病力與Vm470 相比受到了明顯的抑制，這表明鉀元素在影響腐爛病菌生長、菌絲形態(tài)及孢子萌發(fā)的同時(shí)，也很有可能在一定程度上改變了其遺傳分子水平。即便是鹽脅迫下所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)可以暫時(shí)性保留腐爛病菌的致病能力，但是其生長發(fā)育受到的抑制作用是顯而易見的，所以在實(shí)際生產(chǎn)中防治腐爛病菌，可以先在病斑處噴施或注射鉀鹽再搭配殺菌劑使用就可以更加有效的抑制腐爛病菌的擴(kuò)散，這也避免了過量施用鉀肥造成蘋果苦痘病發(fā)生的弊端［22］。下一步通過探究鉀元素調(diào)控蘋果樹腐爛病菌致病力變化的分子機(jī)制，將為尋找新的抗腐爛病菌靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。