白少川，張樂超，杜小龍，郭艷麗，王 濤，高啟萌，王德賀，李蘭會(huì)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001）

雞快羽和慢羽表型與性別相關(guān)，并由一對(duì)等位基因（K 和k+） 控制［1］。家禽生產(chǎn)中，以主翼羽長(zhǎng)于覆主翼羽2 mm 以上為快羽，其他情況為慢羽，作為羽型判斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于雛雞性別鑒定［2］，不僅節(jié)省人力，還能避免對(duì)雛雞造成傷害，在我國(guó)地方雞自別雌雄配套系生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用［3-5］。

K 基因的大片段重復(fù)由PRLR和SPEF2基因的部分重復(fù)dPRLR-dSPEF2融合基因構(gòu)成［6-7］，PRLR和dPRLR反向定位在Z 染色體上，分別與dSPEF2和SPEF2的5′ 末端以“頭碰頭”方式連接［8］。禽PRLR 蛋白存在2 個(gè)跨膜域［9］，與催乳素（PRL）結(jié)合后，可以激活JAK2-STAT5 信號(hào)通路，從而控制靶標(biāo)基因的表達(dá)。SPEF2基因主要表達(dá)于精子鞭毛中，在精子尾部發(fā)育中有至關(guān)重要的作用，RNA-seq 測(cè)序發(fā)現(xiàn)該基因在卵巢中也有表達(dá)［10］，表明在沒有纖毛結(jié)構(gòu)的卵巢中該基因可能仍然具有功能。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)骨折愈合有積極作用［11］，除此之外BMP 可以抑制毛囊的生長(zhǎng)，維持毛囊休止期，且在毛囊發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)量不同［12-13］，其家族成員BMP2與Shh（Sonic hedge hog）參與調(diào)控羽毛的分支［14］。牦牛BMP2和BMPR-IA能夠維持毛囊處于休止?fàn)顟B(tài)，Noggin 阻斷劑抑制BMP2的表達(dá)，使毛囊由休止期過渡到生長(zhǎng)期［15］。卵泡抑制素（FST）作為一種單鏈糖蛋白對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 超家族許多成員如肌肉抑素和BMP 等具有拮抗作用，過表達(dá)FST 小鼠的肌肉重是野生小鼠的2 ～3 倍［16］，F(xiàn)ST 可通過與BMP2 結(jié)合抑制其發(fā)揮作用，阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響毛囊發(fā)育［17］。

壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞作為河北省優(yōu)質(zhì)地方雞品種分別于2005 年和2015 年通過國(guó)家品種遺傳資源委員會(huì)鑒定，被收入《國(guó)家畜禽遺傳資源品種名錄》。兩品種雞存在豐富的羽色遺傳資源［18］，此外太行雞ev21病毒占位區(qū)上游278 bp C＞T 的T 突變型與ev21整合緊密連鎖［19］，但在羽毛形成過程中主翼羽和覆主翼羽長(zhǎng)度變化以及羽型相關(guān)基因的表達(dá)情況未見報(bào)道。

雞毛囊在16 胚齡時(shí)形態(tài)發(fā)生基本完成，之后絨羽逐漸形成，最終在胚胎期結(jié)束時(shí)羽型出現(xiàn)明顯的區(qū)別。本研究以壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞為研究對(duì)象，測(cè)量19E 和21E 壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞主翼羽和覆主翼羽的長(zhǎng)度，采用RT-qPCR 檢測(cè)雞胚翅羽毛囊中PRLR、SPEF2、BMP2和FST 基因的表達(dá)變化，以期探究基因表達(dá)對(duì)羽型形成的影響，為明確羽型形成的分子調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)孵化室采集19E 和21E 壩上長(zhǎng)尾雞雞胚各16 枚，64 枚19E 和58 枚21E 太行雞雞胚毛囊、肝臟、主翼羽和覆主翼羽；北京全式金公司試劑：EasyPure? Genomic DNA Kit、RNAhold?、EasyPure? RNA Kit、Trans2K? Plus DNA Marker；保定康為世紀(jì)公司試劑：Super GelRed 和2xES Taq MasterMix(Dye)； 大連寶生物公司試劑：PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser；蘇州金唯智公司合成引物。

1.2 方法

1.2.1 主翼羽和覆主翼羽的羽長(zhǎng)測(cè)量 采集壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞右翅第4 和第5 根主翼羽和覆主翼羽，游標(biāo)卡尺量測(cè)羽長(zhǎng)（mm），將第4 和第5 根羽長(zhǎng)的平均值作為羽長(zhǎng)數(shù)據(jù)。

1.2.2 DNA 和RNA 提取及cDNA 的合成 按試劑盒使用說明提取壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞毛囊總RNA 和肝臟DNA，電泳檢測(cè)DNA 和RNA 的完整性；將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用雞內(nèi)參引物β-action檢驗(yàn)反轉(zhuǎn)錄成功與否。

1.2.3 壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞的羽型鑒定 羽型鑒定參考張秀玲［20］的雙重PCR 灰度值法。PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×ES Taq MasterMix 5 μL，ddH2O 補(bǔ)齊10 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，24個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。

1.2.4 RT-qPCR 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雞PRLR（NM_204854.1）、SPEF2（XM_015277513.1）、BMP2（NM_204358.1）、FST（NM_205200.1）、β-action（L08165.1）序列，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，引物要求跨外顯子，并通過NCBI Primer Blast 檢驗(yàn)引物特異性。試驗(yàn)所用引物見表1。

表1 試驗(yàn)用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS 24.0 單因素方差分析兩胚齡的快慢羽太行雞和壩上長(zhǎng)尾雞的主翼羽和覆主翼羽長(zhǎng)度差異和羽型相關(guān)基因表達(dá)變化，組間差異進(jìn)行Duncan 多重比較，P＜0.05 被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞的羽型鑒定

電泳檢測(cè)結(jié)果僅有857 bp 擴(kuò)增的個(gè)體為快羽雞，除857 bp 外還存在1 305 bp 擴(kuò)增的個(gè)體為慢羽雞，該片段由慢羽雞特有的融合基因擴(kuò)增產(chǎn)生（見圖1）。

圖1 羽型檢測(cè)凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis images of feather type detection

不同品種雞羽型見表2， 19E 和21E 壩上長(zhǎng)尾雞快慢羽各有8 枚，太行雞19E 與21E 的快羽和慢羽型分別有22 和42、13 和45 枚。

表2 快慢羽雞數(shù)量Table 2 Number of early- feathering and late-feathering chickens

2.2 快慢羽雞主翼羽和覆主翼羽長(zhǎng)度變化

快慢羽雞主翼羽和覆主翼羽長(zhǎng)度見表3。19E壩上長(zhǎng)尾和太行慢羽雞主翼羽分別長(zhǎng)于覆主翼羽1.35 mm（P＜0.05）和0.42 mm（P＞0.05），太行慢羽雞覆主翼羽顯著長(zhǎng)于壩上長(zhǎng)尾雞（P＜0.05）；另外，19E 壩上長(zhǎng)尾快羽雞的2 種羽長(zhǎng)均顯著短于太行快羽雞（P＜0.05），表明19E 前的壩上長(zhǎng)尾雞翼羽生長(zhǎng)較慢或發(fā)育較晚，慢羽表型不明顯。

表3 19 和21E 快慢羽雞翼羽長(zhǎng)度Table 3 Length of flight feathers for early and late feathering chickens on 19E and 21E

19E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞的主翼羽略長(zhǎng)于快羽雞（P＞0.05），21E 時(shí)顯著短于快羽雞（P＜0.05）；19 和21E 的覆主翼羽均顯著長(zhǎng)于后者（P＜0.05）。19 和21E 太行慢羽雞的主翼羽均顯著短于快羽雞（P＜0.05）；19E 覆主翼羽略短于快羽雞（P＞0.05），21E 顯著短于后者（P＜0.05）。由此可知，壩上長(zhǎng)尾雞慢羽表型的形成在于主翼羽生長(zhǎng)速度的降低和覆主翼羽生長(zhǎng)速度的提高，太行慢羽雞在19E呈現(xiàn)慢羽表型后，其翼羽21E 基本保持原來(lái)的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。

2.3 不同胚齡兩品種快慢羽雞羽型相關(guān)基因的表達(dá)變化

PRLR在19E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞表達(dá)量是快羽雞的1.61 倍（P＜0.05），2 種羽型在21E 的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），但羽型間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。19E 太行慢羽雞的PRLR表達(dá)約為19E 快羽雞和21E 快慢羽雞的4 倍以上（P＜0.05），后三者表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05），太行快羽雞的PRLR表達(dá)未隨雞胚發(fā)育出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05）。

SPEF2在19E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞的表達(dá)為快羽雞的2.6 倍（P＜0.05），21E 快慢羽雞均顯著升高（P＜0.05），且達(dá)到相同水平（P＞0.05）；SPEF2在19 和21E 太行慢羽雞表達(dá)均顯著高于同胚齡的快羽雞（P＜0.05），但2 種羽型雞的表達(dá)未隨胚齡發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。

BMP2在19E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞表達(dá)量顯著高于21E（P＜0.05），19E 和20E 慢羽雞表達(dá)量分別為快羽雞的4.6 倍和2.8 倍（P＜0.05），而快羽雞的表達(dá)未隨胚齡出現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。太行雞BMP2的表達(dá)量未隨胚齡和羽型發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。

FST在19E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞的表達(dá)顯著低于此時(shí)快羽雞和21E 的2 種羽型雞（P＜0.05），后三者無(wú)顯著差異（P＞0.05）。19E 太行快羽雞和21E快慢羽雞FST的表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05），而19E 太行慢羽雞表達(dá)量分別為前三者的5 倍（P＜0.05）。

圖2 壩上長(zhǎng)尾雞（A）和太行雞（B）毛囊中基因的表達(dá)Fig.2 Gene expression in hair follicles of Bashang long-tailed chickens (A) and Taihang chickens (B)

2.4 不同品種快慢羽雞相關(guān)基因的表達(dá)變化

PRLR和SPEF2在壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞上均表現(xiàn)出慢羽雞表達(dá)顯著高于快羽雞（P＜0.05），尤其在太行慢羽雞表達(dá)量分別為快羽雞的2.3 倍和4.2 倍；BMP2 在壩上長(zhǎng)尾慢羽雞的表達(dá)為快羽雞的3.4 倍（P＜0.05），而太行快慢羽雞間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；FST 在壩上長(zhǎng)尾慢羽雞的表達(dá)顯著低于快羽雞（P＜0.05），而在太行慢羽雞的表達(dá)為快羽雞的3.1 倍（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 壩上長(zhǎng)尾雞（A）和太行雞（B）不同羽型毛囊中基因的表達(dá)Fig.3 Differences of gene expression in follicles of Bashang Long-tail chicken (A) and Taihang chicken (B)with different feather type

3 討論與結(jié)論

3.1 快慢羽雞主翼羽和覆主翼羽長(zhǎng)度變化

配套系生產(chǎn)的商品雞根據(jù)羽型自別雛雞雌雄，主翼羽長(zhǎng)于覆主翼羽2 mm 以上為快羽，其它為慢羽。婁義州等發(fā)現(xiàn)不同日齡武農(nóng)I 系烏骨雞主翼羽和覆主翼羽變異程度存在差異［21］，趙彩娟等發(fā)現(xiàn)2周齡快羽雞覆主翼羽長(zhǎng)度顯著大于慢羽雞［22］。本試驗(yàn)對(duì)19E 和21E 快慢羽壩上長(zhǎng)尾雞和太行雞的主翼羽和覆主翼羽長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)19E 前壩上長(zhǎng)尾雞的羽毛發(fā)育較晚或生長(zhǎng)較慢；19-21E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞2 種翼羽生長(zhǎng)速度快于太行慢羽雞，但其主翼羽相對(duì)于快羽雞生長(zhǎng)受到抑制。壩上長(zhǎng)尾雞的羽型分化時(shí)間較太行雞晚，主翼羽和覆主翼羽生長(zhǎng)速度差異是快慢羽表型形成的原因之一。

3.2 快慢羽雞基因表達(dá)變化

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRLR基因在慢羽的壩上長(zhǎng)尾和太行雞胚翅羽毛囊中的表達(dá)均顯著高于快羽雞，這一結(jié)果與Luo 等發(fā)現(xiàn)文昌慢羽雞與快羽雞的PRLR的表達(dá)一致［23］。Craven 等發(fā)現(xiàn)敲除PRLR的小鼠毛發(fā)周期休止期縮短，并提前進(jìn)入毛囊的生長(zhǎng)期［24］，提示PRLR在毛囊激活中起到抑制作用。白春艷等也提出PRLR對(duì)毛囊激活有抑制作用，是慢羽性狀的主要候選基因［25］，PRLR基因參與調(diào)控抑制慢羽雞的羽毛生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)對(duì)不同胚齡雞胚翅羽毛囊PRLR的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，19E 壩上長(zhǎng)尾和太行慢羽雞的表達(dá)高于快羽雞，且高于21E 快慢羽雞間差異。另一方面，19E 快羽的壩上長(zhǎng)尾雞的表達(dá)高于21E 的慢羽雞，而19E 太行快羽雞與21E 的太行快慢羽雞表達(dá)無(wú)差異，這與19E 的慢羽表型壩上長(zhǎng)尾雞未形成而太行雞已顯現(xiàn)，19E 壩上長(zhǎng)尾雞快羽雞主翼羽和覆主翼羽長(zhǎng)度均短于同胚齡壩上長(zhǎng)尾慢羽雞和太行快羽雞一致，表明19E 時(shí)壩上長(zhǎng)尾快羽雞高濃度的PRLR抑制快羽雞毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育。

SPEF2由于存在ATP/GTP 結(jié)合位點(diǎn)和富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，因此被認(rèn)為可能與羽毛生長(zhǎng)通路中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除21E 壩上長(zhǎng)尾快慢羽雞外，SPEF2在壩上長(zhǎng)尾和太行慢羽雞中的表達(dá)均高于快羽雞，Zhao 等研究表明，在1 日齡綠殼快羽和慢羽蛋雞中SPEF2的表達(dá)一致［26］，說明在雞胚羽毛發(fā)育過程中SPEF2與PRLR協(xié)同作用發(fā)揮抑制慢羽羽毛生長(zhǎng)的作用。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)21E 壩上長(zhǎng)尾2 種羽型雞的SPEF2表達(dá)均高于19E，且快慢羽間無(wú)差異，這可能與壩上長(zhǎng)尾雞慢羽表型分化較晚或翅羽生長(zhǎng)速度的差異有關(guān)。

19E 和21E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞BMP2表達(dá)量均高于快羽雞，提示BMP2可能存在抑制毛囊發(fā)育的功能，與宋亮麗發(fā)現(xiàn)牦牛BMP2發(fā)揮維持毛囊休止?fàn)顟B(tài)功能相似［15］。但在太行快慢羽雞中各胚齡之間表達(dá)量無(wú)差異，可能太行雞羽型分化完成早，BMP2抑制毛囊發(fā)育功能已完成。Liu 等發(fā)現(xiàn)FST可通過與BMP2結(jié)合抑制其發(fā)揮作用，阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響毛囊發(fā)育，F(xiàn)ST對(duì)BMP2有拮抗作用［17］，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)19E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞FST表達(dá)量低于快羽雞，說明慢羽雞中FST對(duì)BMP2的拮抗作用較低，BMP2能發(fā)揮抑制毛囊發(fā)育的功能。21E 壩上長(zhǎng)尾慢羽雞FST顯著高于19E，且與同胚齡快羽雞之間無(wú)差異，此時(shí)羽型已經(jīng)完成分化，表明高水平FST發(fā)揮對(duì)BMP2的拮抗作用，羽毛發(fā)育生長(zhǎng)加快。同理，19E 太行慢羽雞中FST的高表達(dá)，也是太行慢羽雞此時(shí)羽型分化完成所致。

本試驗(yàn)通過測(cè)量翅羽長(zhǎng)度和基因表達(dá)定量發(fā)現(xiàn)，太行雞在19 胚齡已表現(xiàn)慢羽表型，而壩上長(zhǎng)尾雞的慢羽表型在21 胚齡才呈現(xiàn)；推測(cè)PRLR和SPEF2在慢羽雞翅羽毛囊中的高表達(dá)，及BMP2和FST在太行雞和壩上長(zhǎng)尾雞翅羽毛囊中的差異表達(dá)，參與雞慢羽表型的形成。