腎移植患者血清miR-338-5p水平表達及其臨床意義研究

陳 輝，何 偉，崔 勇，遲 凱，王鎖剛

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外腎移植科，河南 鄭州 450000

終末期腎臟?。‥SRD）病死率較高，其可導(dǎo)致患者出現(xiàn)水腫、貧血、電解質(zhì)酸堿平衡紊亂等情況。臨床上針對ESRD 患者可采取腎移植治療，可以有效提高患者的短期存活率，但隨著移植時間的延長，部分患者移植腎功能會逐漸喪失，降低了患者的長期存活率，影響預(yù)后［1-2］。臨床認(rèn)為移植腎功能喪失的原因包含兩方面，即免疫與非免疫兩種因素，其中影響腎移植患者長期存活率的主要因素為免疫因素介導(dǎo)的腎移植排斥。免疫介導(dǎo)的腎移植排斥反應(yīng)在急性、慢性排斥反應(yīng)中均有重要作用，可溶性B 細胞活化因子（sBAFF）主要由單核細胞、T 細胞、樹突狀細胞產(chǎn)生，其可促進B 細胞成熟、分化，在機體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。sBAFF 參與了多種免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，sBAFF 參與了腎移植患者術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生過程，與患者的長期存活率具有密切關(guān)聯(lián)，sBAFF 異常時，表明患者已經(jīng)存在異常的免疫應(yīng)答，其對腎移植患者的排斥反應(yīng)并沒有良好的預(yù)警作用［3］。miR-338-5p 是一種長為22個核苷酸的微小RNA，其具有608個靶基因，其中TRAF3、NF-kB1 就是miR-338-5p 靶基因中的一種，而TRAF3 是sBAFF 信號傳導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)接蛋白、NF-kB1 途徑是重要的sBAFF 信號之一。且有研究表明，血清miR-338-5p水平與sBAFF之間存在一定的關(guān)聯(lián)性［4］。但臨床上關(guān)于該類型的研究報道相對較少，故本研究旨在探討腎移植患者血清miR-338-5p 水平表達及其臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年7 月—2019 年8 月河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的100 例接受腎移植手術(shù)患者，依據(jù)腎移植術(shù)后是否出現(xiàn)排斥反應(yīng)進行分組，將出現(xiàn)排斥反應(yīng)的36例患者的臨床資料歸為觀察組，將未出現(xiàn)排斥反應(yīng)的64例患者的臨床資料歸為對照組。觀察組男25 例，女11 例，年齡20～78 歲，平均年齡（49.23±7.62） 歲，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18.5～28 kg/m2，平均BMI（23.25±1.36）kg/m2。對照組男39 例，女25 例，年齡男21～78 歲，平均年齡（49.75±7.59） 歲，BMI 19～28 kg/m2，平 均BMI （23.50±1.28）kg/m2。兩組患者一般資料具有可比性（P＞0.05）。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合腎移植指征，如各種原因所致的不可逆ESRD 患者、心肺功能良好，精神、認(rèn)知功能正常，凝血功能正常，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤且已發(fā)生轉(zhuǎn)移，活動性肝炎，術(shù)前早期腎功能不全，活動性慢性感染病灶、活動性消化性潰瘍病。

1.3 血清miR-338-5p水平及sBAFF水平測定方法

術(shù)后3 d采集所有患者的肘靜脈血4 mL，以3 500r/min的離心速率，15 cm 離心半徑離心10 min 后取血清，按照miRNeaySerum/PlasmaKit 試劑盒提取血清中總RNA，應(yīng)用分光光度計（青島市三凱醫(yī)學(xué)科技有限公司，魯械注準(zhǔn)20152220266，型號SK6880） 測定RNA 的純度、濃度，RNA 溶液無雜質(zhì)后可行下一步逆轉(zhuǎn)錄過程。逆轉(zhuǎn)錄應(yīng)用SYBR-PrimerScript-miRNA RTPCR kit 試 劑 盒，U6n 為 內(nèi)參，PCR 反應(yīng)應(yīng)用實時熒光定量PCR 儀[卡尤迪生物科技（北京）有限公司，國械注準(zhǔn)20163401400，型號Mini8 Plus]進行。逆轉(zhuǎn)錄過程：37 ℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，85 ℃5 s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。miR-338-5p反應(yīng)體系：95℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環(huán)。血清sBAFF 水平應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定。每例標(biāo)本重復(fù)兩次，取其平均值。

1.4 評價指標(biāo)

（1）比較兩組患者的血清miR-338-5p 及sBAFF 水平。（2）分析血清miR-338-5p水平與sBAFF水平的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗。采用Pearson分析miR-338-5p 水平與sBAFF 水平的相關(guān)性，r＞0 為正相關(guān)，r＜0為負相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清miR-338-5p及sBAFF水平情況

觀察組患者血清miR-338-5p 水平低于對照組患者，sBAFF 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者血清miR-338-5p及sBAFF水平情況（±s）

表1 兩組患者血清miR-338-5p及sBAFF水平情況（±s）

組別對照組（n=64）觀察組（n=36）t值P值miR-338-5p 3.78±1.62 0.17±0.05 13.337 0 sBAFF（pg/mL）764.28±96.72 1 749.43±127.64 43.472 0

2.2 兩組患者miR-338-5p 水平與sBAFF 水平的相關(guān)性分析情況

經(jīng)Pearson 分析，miR-338-5p 與sBAFF 呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.677，P=0）。

3 討論

腎移植患者術(shù)后的排斥反應(yīng)的發(fā)生機制主要與患者體內(nèi)的抗同種供體人類白細胞抗原（HLA）分子、ABO 同種凝集素或抗內(nèi)皮細胞抗體介導(dǎo)的免疫排斥有關(guān)。腎移植排斥反應(yīng)不僅加重了患者的痛苦，對患者的腎移植后的長期存活率也造成了嚴(yán)重的影響［4-5］。臨床上將腎移植的排斥反應(yīng)分為急性排斥反應(yīng)與慢性排斥反應(yīng)兩種，其中急性排斥反應(yīng)是由高效價的抗體所致補體系統(tǒng)激活及移植物內(nèi)皮細胞的溶解性損傷有關(guān)，患者具有臨床癥狀加重、大劑量激素沖擊治療無效、治療難度較大、預(yù)后差等特點，臨床上常給予免疫抑制劑進行治療［6-7］。而慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生機制尚未明確，患者多出現(xiàn)蛋白尿、貧血、腎功能逐漸惡化等癥狀，臨床上目前暫無有效的治療方法［7-8］。因此，探討腎移植患者免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的發(fā)生機制具有不可忽視的重要性。

B細胞活化因子（BAFF）是一種Ⅱ型三聚體跨膜糖蛋白，可被Furin 樣蛋白酶裂解呈sBAFF，進而重組為包含20 個三聚體的有序衣殼樣結(jié)構(gòu)，利于受體結(jié)合。BAFF 主要有免疫細胞、活化的T 細胞及部分B 細胞分泌合成，在腎移植患者中，其在γ 干擾素、白細胞介素-10 等激活下，T細胞和活化的B細胞會上調(diào)BAFF水平，致使其出現(xiàn)異常高表達情況，而高水平的BAFF 會導(dǎo)致B 細胞持續(xù)存活，進而導(dǎo)致患者sBAFF 水平增長，致使患者發(fā)生免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)［9-10］。miRNA是長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，其可通過與靶基因非編碼小分子結(jié)合來起到調(diào)控靶基因表達的作用，其參與了機體正常發(fā)育的調(diào)節(jié)等過程。其中miR-338-5p 是miRNA 家族中的一種，且有研究表明，miR-338-5p 在BAFF 高表達的腎移植患者中呈明顯的低表達情況，且移植腎中的miRNA表達與mRNA存在明顯的相關(guān)性，miRNA水平的表達情況可有效反應(yīng)出腎移植患者的急性排斥反應(yīng)及腎功能狀態(tài)，故臨床上可通過miRNA表達情況來預(yù)測患者發(fā)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險性［11-12］。正常情況下，成熟microRNA 是以microRNA 核糖核蛋白復(fù)合體形式來發(fā)揮作用，其可與靶mRNA 的3’-非編碼區(qū)（3’-UTR）堿基互補、配對來起到降解mRNA、抑制蛋白質(zhì)翻譯等作用，又或者讓靶mRNA 以miRNA 依賴方式聚集至P小體中，來讓其逃避翻譯，進而介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，達到使特定基因沉默的作用［13］。TRAF3 基因可與多種受體結(jié)合，其除了可以調(diào)節(jié)B 淋巴細胞信號，還對B 淋巴細胞轉(zhuǎn)化期至成熟期的各個階段均有影響，TRAF3基因在B 淋巴細胞自穩(wěn)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［14］。在B 淋巴細胞中，TRAF3 可以對CD40 誘導(dǎo)的NF-κB2 信號途徑具有負調(diào)節(jié)作用，對EB 病毒編碼的CD40 模擬物低分子量蛋白1（LMP1）誘導(dǎo)的非經(jīng)典NF-κB2 信號起正向調(diào)節(jié)作用。當(dāng)TRAF3過表達時，可對未受刺激的B 淋巴細胞瘤細胞株NF-κB 報告基因活性具有抑制性。且相關(guān)研究表明，TRAF3 可以對BAFF-BAFF-R 介導(dǎo)的NF-κB 激活具有負調(diào)節(jié)作用。這或許可間接反映TRAF3 可能通過調(diào)節(jié)BAFF 信號而參與機體免疫耐受的調(diào)節(jié)過程［15］。NF-KB 信號通路可控制轉(zhuǎn)錄的DNA、細胞因子產(chǎn)生及細胞存活，其與sBAFF 具有一定的關(guān)聯(lián)性。當(dāng)sBAFF 與其受體TACI、BCMA 結(jié)合時，對經(jīng)典NF-KB 信號通路激活具有誘導(dǎo)作用，而激活后的NF-KB 轉(zhuǎn)位入核與靶基因啟動子/增強子上的KB 位點進行結(jié)合，進而起到調(diào)控多種靶基因表達的作用。NF-KB 信號通路在感染、免疫反應(yīng)、細胞凋亡等多種生理、病理過程中均發(fā)揮著重要作用［16］。miR-338-5p 具有較多的靶基因，其中包含了TRAF3、NF-KB1 兩種基因，miR-338-5p可以通過調(diào)控基因TRAF3、NF-KB1參與腎移植患者的排斥反應(yīng)過程，而NF-KB1 是BAFF 信號的重要途徑之一，而TRAF3 參與了BAFF 下路信號傳導(dǎo)過程，且NF-KB1對TRAF3具有靶向調(diào)控作用，miR-338-5p通過直接作用于TRAF3、NF-KB1，對BAFF信號起到間接調(diào)控作用。miR-338-5p 通過調(diào)節(jié)TRAF3mRNA 水平，活化BAFF信號，進而刺激B 淋巴細胞分泌免疫球蛋白G，從而導(dǎo)致腎移植患者出現(xiàn)排斥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-338-5p 水平低于對照組，sBAFF 水平高于對照組，經(jīng)Pearson 分析，miR-338-5p 與sBAFF 呈負相關(guān)。這表明在出現(xiàn)排斥反應(yīng)的腎移植患者血清中miR-338-5p 呈明顯低表達情況，且其水平與sBAFF水平呈明顯負相關(guān)，miR-338-5p 對BAFF 信號具有調(diào)節(jié)作用，對腎移植患者術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生具有一定的預(yù)測價值。

對本研究結(jié)果進行分析后認(rèn)為，BAFF 因子與TACI、BCMA 受體結(jié)合后可激活miR-338-5p的靶分子NF-KB1信號通路，致使NF-KB1 與靶基因上的KB 位點結(jié)合，進而起到調(diào)節(jié)多種靶基因的表達，而NF-KB1 信號通路參與了機體的免疫反應(yīng)、炎癥等多種病理過程，其對細胞周期的調(diào)控及分化具有一定作用，進而引發(fā)了腎移植患者出現(xiàn)免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。本研究結(jié)果仍然存在一定的局限性，本研究中的樣本量有限，這可能會在一定程度上影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，且本研究尚未觀察腎移植手術(shù)對患者血清miR-338-5p 的影響，關(guān)于血清miR-338-5p 水平與腎移植手術(shù)治療之間的因果關(guān)系仍需今后進一步研究證實。此外，本研究所選的研究對象均為隨訪的腎移植患者，該研究并未取得所有腎移植患者的腎活檢組織，因此，對于血清miR-338-5p 水平表達與腎移植患者病理的相關(guān)性尚未明確。

綜上所述，血清miR-338-5p 水平與sBAFF 水平呈明顯負相關(guān)，臨床上可通過檢測miR-338-5p 水平來預(yù)測腎移植患者術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險性。