李青卓，張 楠，梅興國(guó)，吳基良*

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市康健醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)園)

β-胡蘿卜素是自然界普遍存在的天然色素之一，可作為著色劑應(yīng)用于飲料、糖果及人造奶油當(dāng)中。β-胡蘿卜素是維生素A的前體，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為維生素A，用于治療夜盲癥，并且在臨床前和臨床研究中已被證明沒(méi)有蓄積毒性[1]。β-胡蘿卜素可以憑借其抗氧化特性抑制某些癌癥(如乳腺癌、肺癌結(jié)腸癌)及其他疾病(如年齡相關(guān)性黃斑變性)的發(fā)生[2-3]，還可以預(yù)防糖尿病及心血管疾病，提升機(jī)體免疫力，從而增強(qiáng)疾病抵抗力，改善健康狀況[4]。螺旋藻中含有豐富的β-胡蘿卜素，約為700～1 700mg/kg[5]。

螺旋藻(spirulina，SP)是一種低等的自養(yǎng)型生物，在顯微鏡下呈不分枝的螺旋狀；在分類上屬于藍(lán)藻門、顫藻亞目、顫藻科、螺旋藻屬[6]，可被用于生物修復(fù)、硝化[5，7]和二氧化碳固定[8]。螺旋藻中除了含有豐富的蛋白質(zhì)和幾乎所有必需氨基酸外，還有維生素、γ-亞麻酸、礦物質(zhì)等其他活性成分，近年來(lái)被用于營(yíng)養(yǎng)食品補(bǔ)充劑[9]，被稱為“21世紀(jì)最理想的食品”[10]。

目前現(xiàn)市場(chǎng)上螺旋藻食品或藥品都是由新鮮螺旋藻經(jīng)噴霧干燥后的螺旋藻粉加工制作，可能造成螺旋藻中β-胡蘿卜素的損失。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)研究提取螺旋藻的最佳條件，分光光度法測(cè)定并比較新鮮螺旋藻與螺旋藻藻粉中β-胡蘿卜素的含量，為螺旋藻的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

ME1 002電子天平(梅特勒)，KH5 200超聲波振蕩器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，HJ-A4恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)，LD5-2B離心機(jī)(北京雷波爾醫(yī)療器械)，TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

新鮮螺旋藻由湖北省真奧金銀花研究院提供；螺旋藻藻粉(云南施普瑞生物工程有限公司)冷藏備用；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚均為分析純(常熟市鴻盛精細(xì)化工有限公司)；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(上海麥克林生化科技有限公司，純度>96%)。

1.2 方法

1.2.1 波長(zhǎng)選擇

用石油醚作為溶劑溶解一定量的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，在波長(zhǎng)200～850nm范圍內(nèi)，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，獲得β-胡蘿卜素的特征吸收峰。

1.2.2 提取劑選擇

分別以無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和石油醚作為提取劑浸提4h，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，與對(duì)照品波長(zhǎng)進(jìn)行比較，確定提取是否成功。

1.2.3 β-胡蘿卜素標(biāo)曲繪制

依據(jù)文獻(xiàn)[11]配置一系列β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以石油醚為空白溶劑，在450nm測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4 新鮮螺旋藻中含水量測(cè)定

取適量新鮮螺旋藻，經(jīng)紗布反復(fù)過(guò)濾、洗凈、抽濾，將螺旋藻搓至直徑為3～5mm的條狀，置于培養(yǎng)皿中，將其放于80℃真空干燥箱中烘干，研磨至粉末，得螺旋藻藻粉。依據(jù)《中國(guó)藥典第四部》[12]中水分測(cè)定法中的烘干法測(cè)定水分，按下列公式計(jì)算新鮮螺旋藻含水量。螺旋藻藻粉含水量用快速水分測(cè)定儀測(cè)定。

式中：

W：新鮮螺旋藻含水量，單位為克每百克(g/100g)；

m1：新鮮螺旋藻及培養(yǎng)皿重量，單位為克(g)；

m2：螺旋藻烘干后及培養(yǎng)皿重量，單位為克(g)；

m3：培養(yǎng)皿重量，單位為克(g)；

100：換算系數(shù)。

1.3 提取方法優(yōu)化

1.3.1 超聲時(shí)間選擇

稱取新鮮螺旋藻藻泥0.5g(相當(dāng)于0.1g螺旋藻藻粉)，加入10mL提取劑，用功率200W的超聲波振蕩器，分別超聲0、5、10、15、20min，置于35℃恒溫水浴鍋中加熱4h，離心取上清液定容于25mL棕色容量瓶中，測(cè)定β-胡蘿卜素的吸光度。

1.3.2 提取劑體積選擇

稱取新鮮螺旋藻藻泥0.5g，分別加入5、10、15、20、25mL提取劑，超聲10min，置于35℃恒溫水浴鍋中加熱4h，離心取上清液定容于25mL棕色容量瓶中，測(cè)定β-胡蘿卜素的吸光度。

1.3.3 提取溫度選擇

稱取新鮮螺旋藻藻泥0.5g，加入10mL提取劑，超聲10min，分別置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃恒溫水浴鍋中加熱4h，離心取上清液定容于20mL棕色容量瓶中，測(cè)定β-胡蘿卜素的吸光度。

1.3.4 浸提時(shí)間選擇

稱取新鮮螺旋藻藻泥0.5g，加入10mL提取劑，超聲10min，置于35℃恒溫水浴鍋中，分別加熱4、6、8、10、12h，離心取上清液定容于25mL棕色容量瓶中，測(cè)定β-胡蘿卜素的吸光度。

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34)正交試驗(yàn)表，以石油醚為提取劑，選取超聲時(shí)間(A)、提取劑體積(B)、浸提溫度(C)、浸提時(shí)間(D)4個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，其因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素表

1.5 螺旋藻中β-胡蘿卜素含量測(cè)定

分別稱取新鮮螺旋藻藻泥0.5g，螺旋藻藻粉0.1g，在正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度，代入線性回歸方程求β-胡蘿卜素含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究首先利用單因素實(shí)驗(yàn)分別探討了超聲時(shí)間、提取劑體積、提取溫度、浸提溫度與β-胡蘿卜素提取效果的相關(guān)關(guān)系，在此過(guò)程中利用EXCEL圖標(biāo)進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)，最后通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行提取方法優(yōu)化。在結(jié)果計(jì)算時(shí)首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，利用回歸方程求取樣品含量。

2 結(jié) 果

2.1 β-胡蘿卜素吸收光譜

β-胡蘿卜素在200～850nm范圍內(nèi)的吸收光譜如圖1所示。由圖1可知，β-胡蘿卜素在450nm和480nm處均有較大吸收，在450nm處有最大吸收，是β-胡蘿卜素的特征吸收峰，因此，本試驗(yàn)選擇450nm作為β-胡蘿卜素的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 β-胡蘿卜素對(duì)照品全波長(zhǎng)掃描

2.2 提取劑選擇

分別以丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯和石油醚作為提取劑提取新鮮螺旋藻中的β-胡蘿卜素，并進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，以丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯作為提取劑進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描時(shí)，最大吸收在437nm左右，并且偶爾會(huì)出現(xiàn)450nm處吸收峰消失的情況；以石油醚作為提取劑進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描時(shí)，最大吸收在450nm處，且穩(wěn)定，因此，選擇石油醚作為提取劑。

圖2 提取劑對(duì)提取效果的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。由圖3可得，β-胡蘿卜素濃度(C)在0～3μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為A=0.2 321C-0.0 006，R2=0.9996。

圖3 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 新鮮螺旋藻中含水量測(cè)定

經(jīng)計(jì)算，新鮮螺旋藻含水量達(dá)80%，烘干后螺旋藻藻粉含水量達(dá)5.44%，購(gòu)買的螺旋藻藻粉含水量達(dá)6.67%(<7%)，符合國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)中食用螺旋藻藻粉水分限定。

2.5 提取方法優(yōu)化

2.5.1 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在樣品浸提之前超聲0、5、10、15、20min，計(jì)算試樣中β-胡蘿卜素含量，如圖4所示。結(jié)果顯示，超聲可以顯著提升新鮮螺旋藻中β-胡蘿卜素的含量，且在10min以后含量上升速度減緩。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

2.5.2 提取劑體積對(duì)提取效果的影響

新鮮螺旋藻中β-胡蘿卜素的含量隨著提取劑體積的增加呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)，如圖5所示。在15mL時(shí)含量水平最高，為64.72mg/100g，超過(guò)15mL時(shí)含量逐漸減少，由此可見(jiàn)提取劑體積對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素含量的提取也有一定影響。

圖5 提取體積對(duì)提取效果的影響

2.5.3 提取溫度對(duì)提取效果的影響

新鮮螺旋藻中β-胡蘿卜素的含量隨著溫度的升高先增加后降低，如圖6所示。在40℃時(shí)提取效果最好，為64.80mg/100g，因此，選擇40℃作為最佳提取溫度。

圖6 提取溫度對(duì)提取效果的影響

2.5.4 浸提時(shí)間對(duì)提取效果的影響

新鮮螺旋藻中β-胡蘿卜素的含量隨著浸提時(shí)間的增長(zhǎng)而提高，如圖7所示。在8h以后提取效果增加減緩。

圖7 浸提時(shí)間對(duì)提取效果的影響

2.6 正交試驗(yàn)

新鮮螺旋藻中有關(guān)β-胡蘿卜素提取效果的正交實(shí)驗(yàn)(表2)如下。結(jié)果顯示，對(duì)新鮮螺旋藻中β-胡蘿卜素提取效果的影響因素：超聲時(shí)間(A)>浸提溫度(C)>浸提時(shí)間(D)>提取劑體積(B)，最優(yōu)提取工藝為超聲20min，石油醚15mL，提取溫度35℃，浸提時(shí)間10h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.7 螺旋藻中β-胡蘿卜素含量

分別稱取新鮮螺旋藻藻泥0.5g，螺旋藻藻粉0.1g，在15mL石油醚中超聲20min，于35℃中浸提10h，在450nm處測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算得新鮮螺旋藻和螺旋藻粉中的β-胡蘿卜素含量分別為177.95mg/100g和117.40mg/100g。

3 討 論

目前對(duì)β-胡蘿卜素的提取溶劑存在很大差異，本實(shí)驗(yàn)證明丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯對(duì)β-胡蘿卜素的提取有不良影響，故只采用單溶劑進(jìn)行提取。而提取物吸收峰偶爾消失是β-胡蘿卜素的偏移還是其他物質(zhì)，以及混合溶劑是否更有益于β-胡蘿卜素的提取需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)因?yàn)閮x器限制原因使用固定功率超聲波振蕩器，未探究超聲功率對(duì)β-胡蘿卜素提取效果的影響。

目前β-胡蘿卜素的測(cè)定方法主要有紙層析法、薄層層析法、柱層析法、分光光度法、高效液相色譜法等[13]。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行含量測(cè)定，因其方法簡(jiǎn)單，快捷高效，且本實(shí)驗(yàn)主要是用于新鮮螺旋藻與螺旋藻粉的比較，對(duì)其準(zhǔn)確度要求不高。

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到提取螺旋藻中β-胡蘿卜素的最佳提取工藝為以石油醚為提取溶劑，提取劑體積15mL，超聲20min，提取溫度35℃，浸提10h。在此條件下提取新鮮螺旋藻和螺旋藻粉中的β-胡蘿卜素，測(cè)定含量分別為177.95mg/100g和117.40mg/100g，說(shuō)明螺旋藻藻粉中β-胡蘿卜素含量損失極大。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知新鮮螺旋藻中β-胡蘿卜素的含量遠(yuǎn)大于螺旋藻藻粉，所以若將螺旋藻作為輔助治療時(shí)，新鮮螺旋藻的效果可能比螺旋藻粉要好很多。且因本實(shí)驗(yàn)主要在比較新鮮螺旋藻與螺旋藻粉中β胡蘿卜素的含量差異，所以提取溶劑未考慮其毒性，若要對(duì)其中的β-胡蘿卜素進(jìn)行提取應(yīng)用則要更換溶劑或提取方法，也可考慮對(duì)石油醚進(jìn)行剔除。