劉 婷 李嘉妮 沈俊利 陸 俊 楊雯驛

(1. 中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)湖南有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410021； 2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

乳酸飲料由于口味酸甜爽口，富含活性益生菌和乳酸類代謝成分，在飲料市場(chǎng)中占比越來(lái)越高。有色米乳酸飲料是以黑米和紫米為主要原料，利用乳酸菌發(fā)酵形成的一種功能性乳酸飲料。黑米和紫米富含包括類黃酮(特別是花青素和原花青素)、酚酸類化合物(如咖啡酸、阿魏酸等)、植物甾醇(如β-谷甾醇、豆甾醇和辣椒醇)等活性成分[1-3]，具有抗氧化、降膽固醇、降血糖等作用。其中黑米含有的活性成分相對(duì)其他有色米較多，使之有較強(qiáng)的清除活性氧自由基、羥自由基和DPPH自由基的抗氧化作用[4-5]。研究[6-10]表明，利用一些益生菌發(fā)酵果蔬或糧谷類食品，能有效提升產(chǎn)品口感，增強(qiáng)特殊風(fēng)味，同時(shí)，還能提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。如利用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌接種濃縮黑米漿發(fā)酵，可得到口感清爽，紫紅色、有淡淡米香味和發(fā)酵風(fēng)味的復(fù)合益生菌黑米飲料[7]；以黑米和紅棗為原料，可制得比紅棗乳酸飲料有更好色澤、風(fēng)味、滋味和適口性的黑米紅棗乳酸飲料[8]；以黑米和脫脂乳粉為主要原料可制得口感、色澤和質(zhì)地良好的乳酸飲料[9]；以及以嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵劑發(fā)酵燕麥、黑米、糙米，可得到狀態(tài)均勻、谷香濃郁、酸甜可口的發(fā)酵谷物飲料[10]。而關(guān)于以不同比例復(fù)配的有色米為原料，利用復(fù)合益生菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸飲料，并分析其抗氧化活性和降糖活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究擬以黑米、紅米和紫米等有色米為研究對(duì)象，以益生菌果蔬酵素發(fā)酵粉為發(fā)酵菌種，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究有色米乳酸飲料的發(fā)酵工藝條件，并對(duì)其抗氧化活性和降血糖活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為黑米、紫米等有色米的加工利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

黑米、紫米、紅米：陜西洋縣；

發(fā)酵粉：川秀益生菌果蔬酵素發(fā)酵粉，北京川秀科技有限公司；

熱穩(wěn)定性α-淀粉酶:酶活4萬(wàn) U/g，上海源葉生物科技有限公司；

糖化酶:酶活10萬(wàn) U/mL，上海源葉生物科技有限公司；

磁力攪拌水浴鍋:HSJ-3A型，常州澳華儀器有限公司；

回旋式氣浴振蕩器:SHZ-82型，長(zhǎng)葛式明途機(jī)械設(shè)備有限公司；

模式高速分散均質(zhì)機(jī):FA25型，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；

酶標(biāo)儀:SpectraMax i3X型，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 有色米乳酸飲料制備工藝 參照文獻(xiàn)[10-11]修改如下：將3種有色米粉碎制粉過(guò)60目篩后按所需比例稱取混合后，加純水浸泡，放入磁力攪拌水浴鍋中進(jìn)行加熱攪拌糊化，92.5 ℃恒溫30 min，冷卻至70 ℃，按8 U/g有色米加入熱穩(wěn)定性α-淀粉酶，放入水浴鍋進(jìn)行磁力攪拌加熱，待升溫至90 ℃后保溫10 min，冷卻至62 ℃，再按100 U/g有色米加入糖化酶，在62 ℃的磁力水浴鍋中不斷攪拌5 h，即得糖化醪。然后用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)(500 W，10 000 r/min) 5～10 min，將糖化醪細(xì)化后，放入升溫至100 ℃的沸水中，持續(xù)5 min使酶滅活。冷卻后按需接種乳酸菌，放入恒溫箱(37 ℃)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 總酚含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.3 抗氧化活性測(cè)定

(1) 鐵離子還原能力：參照文獻(xiàn)[13]。

(2) ABTS自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.4α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]。

1.2.5 感官評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)[11]并適當(dāng)修改，見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)價(jià)表Table 1 Sensory evaluation table

1.2.6 單因素試驗(yàn)

(1) 有色米比例構(gòu)成對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響：固定乳酸菌發(fā)酵粉添加量為4%，料液比為1∶6 (g/mL)，發(fā)酵時(shí)間為44 h，考察紅米和黑米質(zhì)量比(m紅米∶m黑米分別為1∶1，1∶3，1∶5)，以及紫米和黑米質(zhì)量比(m紫米∶m黑米分別為1∶1，1∶3，1∶5)對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響。

(2) 乳酸菌發(fā)酵粉添加量對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響：固定紫米和黑米質(zhì)量比(m紫米∶m黑米)為1∶5，料液比為1∶6 (g/mL)，發(fā)酵時(shí)間為44 h，考察乳酸菌發(fā)酵粉添加量(3%，4%，5%， 6%)對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響。

(3) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響：固定紫米和黑米質(zhì)量比(m紫米∶m黑米)為1∶5，乳酸菌發(fā)酵粉添加量為4%，料液比為1∶6 (g/mL)，考察發(fā)酵時(shí)間(24，28，32，36，40，44 h)對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響。

(4) 料液比對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響：固定紫米和黑米質(zhì)量比(m紫米∶m黑米)為1∶5，乳酸菌發(fā)酵粉添加量為4%，發(fā)酵時(shí)間為44 h，考察料液比[1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12 (g/mL)]對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響。

1.2.7 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取紫米和黑米質(zhì)量比、乳酸菌發(fā)酵粉添加量、發(fā)酵時(shí)間和料液比4個(gè)因素，考察各因素對(duì)有色米乳酸發(fā)酵飲料感官評(píng)價(jià)及抗氧化活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)平行3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析，使用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性檢測(cè)，P<0.05表示有顯著性差異；P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 有色米比例構(gòu)成對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響

由表2可知，紅米與黑米配方組得到的有色米乳酸飲料感官評(píng)分整體低于紫米與黑米配方組，紫米和黑米復(fù)配后有色米乳酸飲料感官評(píng)分隨黑米比重的增加逐漸升高，且以m紫米∶m黑米為1∶5的最佳。同理，當(dāng)m紫米∶m黑米為1∶5時(shí)，有色米乳酸飲料的多酚含量最高，鐵離子還原能力最高為(24.52±1.30) mmol Fe2+/g·DW，ABTS自由基清除能力達(dá)最大為(77.08±13.18) mmol TE/g·DW。當(dāng)m紅米∶m黑米為1∶1時(shí)，有色米乳酸飲料對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，稍高于m紫米∶m黑米為1∶5的，可能與黑米的總酚含量遠(yuǎn)大于紫米和紅米有關(guān)[15]，尤其是與黑米中含有豐富的矢車菊-3-O-葡萄糖苷等花青素有較大關(guān)系。同時(shí)，紫米也具有良好的抗氧化性，在消化過(guò)程中釋放出的總酚量和總抗氧化性優(yōu)于紅米[16]，因此，紫米和黑米發(fā)酵的乳酸飲料整體品質(zhì)要優(yōu)于紅米和黑米發(fā)酵的。而黑米比重越大，總酚含量也隨之增加，抗氧化活性越強(qiáng)，可能是有色稻的花青素和抗氧化能力與種皮顏色深淺呈正相關(guān)[3]。同時(shí)，乳酸發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸如乳酸、丙酸、醇醛等物質(zhì)的香味交融滲透，產(chǎn)生了較好的香味[17]，使整體感官變佳。

表2 有色米比例構(gòu)成對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響Table 2 The effects of mass ratio of purple rice to black rice on the quality of pigmented rice lactic acid beverage

2.1.2 乳酸菌發(fā)酵粉添加量對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響 由表3可知，當(dāng)乳酸菌發(fā)酵粉添加量為4%時(shí)，有色米乳酸飲料的感官評(píng)分最高，可能是在一定添加量范圍內(nèi)，乳酸菌發(fā)酵粉添加量的增加使飲料中乳酸、乙酸、甲酸等物質(zhì)增加[18]，產(chǎn)生特有的乳酸發(fā)酵風(fēng)味，超過(guò)一定范圍后，乳酸菌代謝的酸性物質(zhì)過(guò)量，會(huì)使有色米乳酸飲料酸味過(guò)重，風(fēng)味口感較差。當(dāng)乳酸菌發(fā)酵粉添加量為3%時(shí)，總酚含量最多，且隨著乳酸菌發(fā)酵粉添加量的增加，樣品中總酚含量呈下降趨勢(shì)，當(dāng)乳酸菌發(fā)酵粉添加量為6%時(shí)，有色米乳酸飲料的總酚含量小幅度增加，可能是由于隨著復(fù)合乳酸菌添加量的增加，發(fā)酵反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生了越來(lái)越多的酸性代謝物、二氧化碳和細(xì)菌素等物質(zhì)，對(duì)多酚有一定抑制或失活作用[19]。研究[20]表明，黑米中含有原兒茶酸、兒茶素、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸等游離和結(jié)合酚類，當(dāng)乳酸菌發(fā)酵粉添加量為6%時(shí)總酚含量有小幅度的上升，可能是因?yàn)獒尫诺慕Y(jié)合多酚含量多于損耗的。有色米乳酸飲料的鐵離子還原能力和ABTS自由基清除能力均以乳酸菌發(fā)酵粉添加量為3%的最高，而后呈波動(dòng)趨勢(shì)，其中ABTS自由基清除能力的變化趨勢(shì)與總酚的一致，均在乳酸菌發(fā)酵粉添加量為5%時(shí)達(dá)最低值，在6%時(shí)輕微上升，可能是由于較低乳酸菌發(fā)酵粉添加量下，游離抗氧化活性物質(zhì)的損失量較低，而乳酸菌發(fā)酵粉添加量較高時(shí)產(chǎn)生的一些酸性物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致抗氧化成分的損失增加。有色米乳酸飲料對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率隨乳酸菌發(fā)酵粉添加量的增加而升高，且在乳酸菌發(fā)酵粉添加量為5%～6%時(shí)增幅明顯變大，可能是由于乳酸菌利用碳源進(jìn)行同型發(fā)酵和異型發(fā)酵，產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸等代謝產(chǎn)物，從而對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用[18]。

表3 乳酸菌發(fā)酵粉添加量對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響Table 3 The effects of the addition amount of Lactobacillus on the quality of pigmented rice lactic acid beverage

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響 由表4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，有色米乳酸飲料感官評(píng)分呈逐漸上升趨勢(shì)，以發(fā)酵44 h的最高，可能是由于乳酸菌得到了充分的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生了較多的有機(jī)酸、酮、醛、酯等風(fēng)味物質(zhì)[21]，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，風(fēng)味物質(zhì)濃度越高，因此感官評(píng)分上升。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚含量在36 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后降低，可能是由于發(fā)酵前36 h，乳酸菌處于遲緩期和對(duì)數(shù)期前期，黑米和紫米中結(jié)合多酚的釋放也較為緩慢；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期和穩(wěn)定期前期后，對(duì)樣品的利用率增大，結(jié)合多酚得到大量釋放；之后進(jìn)入穩(wěn)定期后期甚至衰亡期，乳酸菌生產(chǎn)代謝物對(duì)多酚的損耗導(dǎo)致總酚含量下降。發(fā)酵時(shí)間對(duì)有色米乳酸飲料的FRAP值和ABTS自由基清除能力的影響趨勢(shì)與總酚的類似，均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先上升，且分別在32，36 h時(shí)達(dá)到峰值，而后下降?？赡苁且远喾宇悶榇淼拇蟛糠挚寡趸曰钚晕镔|(zhì)，前期只有一定量處于游離態(tài)，隨著乳酸菌對(duì)樣品的利用，結(jié)合態(tài)抗氧化活性物質(zhì)得到釋放，當(dāng)中期乳酸菌含量達(dá)到一定程度時(shí)，對(duì)結(jié)合態(tài)抗氧化活性物的釋放能力大大增強(qiáng)，樣液中的抗氧化活性物質(zhì)含量增大；隨著乳酸菌代謝產(chǎn)物的增多和結(jié)合態(tài)抗氧化活性物質(zhì)的釋放程度減少，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)引起花青素發(fā)生酶促和非酶促氧化[22]，導(dǎo)致樣液內(nèi)的抗氧化活性物質(zhì)降低，因此抗氧化活性呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵0～32 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，有色米乳酸飲料對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑酶能力先緩慢增加后驟然降低再上升，可能是在發(fā)酵前期，隨著乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生的具有抑酶作用的代謝產(chǎn)物累加，抑酶率上升，而發(fā)酵后期因乳酸菌的大量繁殖，各種代謝產(chǎn)物增加，產(chǎn)生一定的拮抗作用使得抑酶率下降，而后乳酸菌的代謝產(chǎn)物濃度上升，抑酶率再次上升。

表4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響Table 4 The effects of fermentation time on the quality of pigmented rice lactic acid beverage

2.1.4 料液比對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響 由表5可知，當(dāng)料液比為1∶4 (g/mL)時(shí)，有色米乳酸飲料的感官評(píng)分最好，隨著料液的增加，感官評(píng)分越低，可能是由于水量的增加，造成了風(fēng)味物質(zhì)的濃度變低，口感相對(duì)較寡淡，乳酸發(fā)酵風(fēng)味相對(duì)較差?？偡雍侩S料液比的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶8 (g/mL)時(shí)，總酚含量達(dá)最大，可能是由于該比例下促進(jìn)了乳酸菌和樣品的充分接觸和反應(yīng)，有利于乳酸菌對(duì)樣品的利用和結(jié)合多酚的釋放，多酚濃度增大；水量繼續(xù)增加則不利于發(fā)酵的有效進(jìn)行，因此多酚難以有效釋放，總酚含量有所降低。有色米乳酸飲料FRAP值隨料液比的增大先上升后下降，可能是料液比在一定范圍內(nèi)時(shí)，水量的增多可以促進(jìn)乳酸菌和樣品的充分接觸和反應(yīng)，有利于乳酸菌對(duì)樣品的利用和結(jié)合抗氧化性活性物質(zhì)的釋放，但同時(shí)酸性物質(zhì)含量相對(duì)增加，而在酸性條件下對(duì)FRAP的測(cè)定產(chǎn)生了一定影響，F(xiàn)RAP值呈下降趨勢(shì)。ABTS自由基清除能力受酸性條件的影響較小，料液比越大，可溶性抗氧化成分相對(duì)增加，在一定范圍內(nèi)促進(jìn)了ABTS自由基清除能力的提升。隨著料液比的增加，有色米乳酸飲料對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率明顯下降，其最佳料液比為1∶4 (g/mL)，可能是由于抑制葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)隨發(fā)酵體積量的增多，單位濃度內(nèi)的活性物質(zhì)濃度降低，抑酶率下降。

表5 料液比對(duì)有色米乳酸飲料品質(zhì)的影響Figure 5 The effects of the ratio of material to liquid on the quality of pigmented rice lactic acid beverage

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時(shí)間、乳酸菌發(fā)酵粉添加量、有色米比例構(gòu)成和料液比進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表6，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Table 6 Test factors and level design

由表7可知，以感官評(píng)分作為主要指標(biāo)時(shí)，最佳工藝配方為A3B3C2D2，各因素對(duì)感官評(píng)分的影響程度從高到低為乳酸菌發(fā)酵粉添加量(B)>發(fā)酵時(shí)間(A)>料液比(D)>有色米比例構(gòu)成(C)。以總酚含量作為主要指標(biāo)時(shí)，最佳工藝配方為A2B3C1D2，各因素對(duì)總酚含量的影響程度從高到低為料液比(D)>乳酸菌發(fā)酵粉添加量(B)>發(fā)酵時(shí)間(A)>有色米比例構(gòu)成(C)。以鐵離子還原能力作為主要指標(biāo)時(shí)，最佳工藝配方為A3B3C2D3，各因素對(duì)鐵離子還原能力的影響程度從高到低為發(fā)酵時(shí)間(A)>料液比(D)>有色米比例構(gòu)成(C)>乳酸菌發(fā)酵粉添加量(B)。以ABTS 自由基清除能力為主要指標(biāo)時(shí)，最佳工藝配方為A3B1C2D3，各因素對(duì)鐵離子還原能力的影響程度從高到低為料液比(D)>發(fā)酵時(shí)間(A)>有色米比例構(gòu)成(C)>乳酸菌發(fā)酵粉添加量(B)。以α-葡萄糖苷酶抑制率為主要指標(biāo)時(shí)，最佳工藝配方為A1B3C1D1，各因素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響由大到小為發(fā)酵時(shí)間(A)>料液比(D)>有色米比例構(gòu)成(C)>乳酸菌發(fā)酵粉添加量(B)。

表7 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 L9(34) orthogonal test results

根據(jù)各指標(biāo)所得的最佳工藝配方為A3B3C2D2、A2B3C1D2、A3B3C2D3、A3B1C2D3、A1B3C1D1，其中以總酚含量為主要參考依據(jù)所得的最佳配方A2B3C1D2為正交試驗(yàn)第6組，其余所得的最佳配方均不是正交試驗(yàn)內(nèi)的配方，且有一定差距，需進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)和指標(biāo)測(cè)定。

由表8可知，A2B3C1D2的抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制能力均為最佳，感官評(píng)分為83.60±2.51，略低于A3B3C2D2的，且又具有良好的抗氧化能力，總酚含量為(4 208.78±281.26) μg GAE/g·DW，ABTS自由基清除能力為(145.02±7.88) mmol TE/g·DW，總酚含量和ABTS自由基清除能力顯著高于采用單一菌種發(fā)酵單一或復(fù)合有色米的總酚含量[22]。鐵離子還原能力(FRAP)為 (33.41±1.70) mmol Fe2+/g·DW，α-葡萄糖苷酶抑制活性為(13.94±0.01)%，因此，選擇最佳配方為A2B3C1D2，即紫米和黑米質(zhì)量比為1∶5，料液比為1∶8 (g/mL)，乳酸菌發(fā)酵粉添加量為5%，發(fā)酵時(shí)間為40 h，該條件下有色米乳酸飲料產(chǎn)品色澤均一，呈紫紅色，有典型的發(fā)酵香味，口感柔和，酸甜味適中，無(wú)沉淀物。

表8 驗(yàn)證組的感官評(píng)價(jià)，總酚含量，鐵離子還原能力，ABTS自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制率Table 8 Sensory evaluation value,total phenolics content, FRAP, ABTS free radical scavenging ability, and the inhibition rate of α-glucosidase of the validation group

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，有色米乳酸飲料的最佳發(fā)酵工藝條件為紫米和黑米質(zhì)量比為1∶5，料液比為1∶8 (g/mL)，乳酸菌發(fā)酵粉添加量為5%，發(fā)酵時(shí)間為40 h，該條件下有色米乳酸飲料感官評(píng)分近84，產(chǎn)品色澤均一，呈紫紅色，有典型的發(fā)酵香味，口感柔和，酸甜味適中，無(wú)沉淀物。后續(xù)可借助液質(zhì)等手段解析有色米乳酸飲料發(fā)酵過(guò)程中酚酸及花色苷等多酚類活性成分的組成與含量變化，以及測(cè)定出乳酸飲料中各菌種的含量水平，進(jìn)一步研究其體內(nèi)的作用效果和機(jī)理。