切向流過濾結(jié)合超速離心分離小細胞外囊泡方法的建立

王靈，李夢詩，徐莎，陳國棟，王越

1.海軍軍醫(yī)大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心干細胞與再生醫(yī)學研究室，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，上海 200433；3.上海市細胞工程重點實驗室，上海 200433

小細胞外囊泡是由細胞分泌的納米級囊泡，內(nèi)部含核酸、蛋白質(zhì)、小分子等物質(zhì)，能在細胞間發(fā)揮信息交流的作用［1-2］。近年來陸續(xù)有研究報道，外泌體等小細胞外囊泡由于與母本細胞具有較高的相似性，相較于人工納米顆粒，具有更低的免疫清除率和細胞毒性，有望成為新一代的體內(nèi)藥物載體［3-4］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有類型的細胞均能分泌小細胞外囊泡，基于細胞外囊泡的載藥研究已逐步由實驗室研究轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用［5］。但在細胞外囊泡載藥治療研究的開展過程中，如何大批量獲取細胞外囊泡成為瓶頸問題［6］。

常規(guī)的小細胞外囊泡分離方法主要包括超速離心法［7］、密度梯度分離［8］、尺寸排阻色譜柱［9］、聚乙二醇沉淀法［10］等。聚乙二醇沉淀法易獲取、產(chǎn)量較高，但會同時沉淀出其他雜蛋白；密度梯度分離和尺寸排阻色譜柱分離純度較高，但獲取效率較低，耗時偏長；超速離心法最為常用，但處理體積受到儀器限制，難以進行大批量分離［11-12］。在過去幾年中，切向流過濾逐步在脂質(zhì)體、慢病毒等納米顆粒分離中推廣應(yīng)用，與傳統(tǒng)死端過濾不同，切向流過濾系統(tǒng)中的流體沿膜包表面切向流動，既不會堵塞過濾孔徑，也可根據(jù)粒徑大小適時調(diào)整，是一種有效的放大工藝［13］。

考慮到小細胞外囊泡的直徑通常小于200 nm，其物理尺寸與脂質(zhì)體、病毒類載體尺寸類似，因此我們使用0.45 μm和300 kD膜包切向流過濾對細胞上清中的小細胞外囊泡進行富集濃縮。本研究采用切向流過濾結(jié)合超速離心法分離小細胞外囊泡，以期提升小細胞外囊泡的分離效率，為細胞外囊泡載藥的拓展應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞 人源臍帶間充質(zhì)干細胞購自弗元（上海）生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 新生牛血清和BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人CD63單克隆抗體（ab134045）和兔抗ALIX單克隆抗體（ab275377）購自美國Abcam公司；兔抗人CD9單克隆抗體（#13-174）和HRP標記的山羊抗兔IgG購自美國CST公司；切向流過濾夾具和膜包（規(guī)格分別為0.45 μm和300 kD）均購自杭州九齡科技有限公司；Amicon Ultra-15超濾離心管購自德國默克生命科學公司；納米顆粒追蹤分析儀（ZetaView PMX 110）購自德國Particle Metrix公司；超速離心機（XPN-100，配套轉(zhuǎn)子為SW 32 Ti）購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 原始物料的配置 將新生牛血清置4℃解凍，加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制成含10%新生牛血清的培養(yǎng)基作為測試分離小細胞外囊泡的原始物料。

1.4 細胞培養(yǎng) 將人源臍帶間充質(zhì)干細胞置于T25培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基（含5%血小板裂解液和1%青-鏈霉素的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基）5 mL，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達70%～80%時，傳代培養(yǎng)。

1.5 間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基的獲取 取培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞，在細胞融合至90%時棄去原培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后添加無血清培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)24 h，收集間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基，置－80℃保存。

1.6 超速離心法分離小細胞外囊泡 取原始物料或臍帶間充質(zhì)干細胞上清，在4℃條件下，依次300×g離心10 min收集上清、2 000×g離心30 min收集上清、10 000×g離心30 min收集上清、100 000×g離心70 min棄上清收集沉淀，將沉淀用50 μL PBS重懸后，置－80℃保存。

1.7 切向流過濾濃縮分離、濃縮小細胞外囊泡 組裝切向流夾具，安裝0.45 μm膜包，取原始物料或臍帶間充質(zhì)干細胞上清，在4℃條件下解凍，通過切向流過濾獲得流出液作為下一步物料。將切向流過濾膜包更換為300 kD膜包，取上一步的流出液作為物料進行過濾、濃縮，物料體積濃縮為200 mL時終止過濾，收集濃縮液。切向流過濾模式圖見圖1。

圖1 切向流過濾模式圖Fig.1 Pattern of TFF

1.8 100 kD超濾管超濾

1.8.1 1次超濾 取Amicon Ultra-15超濾離心管，加入15 mL切向流過濾濃縮液，放入擺桶轉(zhuǎn)子，3 000×g離心15 min，回收離心獲得的純化產(chǎn)物即為1次100 kD超濾管濃縮產(chǎn)物。

1.8.2 2次超濾 取Amicon Ultra-15超濾離心管，加入15 mL 1次100 kD超濾管濃縮產(chǎn)物，放入擺桶轉(zhuǎn)子，3 000×g離心15 min，回收離心獲得的純化產(chǎn)物即為2次100 kD超濾管濃縮產(chǎn)物。

1.9 細胞外囊泡形態(tài)的透射電鏡觀察 樣本溶解后稍離心，吸取15 μL置于銅網(wǎng)上靜置1 min，用濾紙將銅網(wǎng)上的樣本吸干，吸取15 μL 2%醋酸雙氧鈾染色液，室溫染色1 min，將樣本置燈下烤10 min，透射電鏡拍照觀察。該檢測委托和元生物技術(shù)（上海）有限公司進行。

1.10 切向流過濾后濃縮培養(yǎng)基的納米顆粒追蹤分析先用去離子水清洗樣本池，再用聚苯乙烯微球（110 nm）校準納米顆粒追蹤分析儀（ZetaView PMX 110），再次用1×PBS清洗樣本池，最后將樣本用1×PBS稀釋，進樣檢測。該檢測委托和元生物技術(shù)（上海）有限公司進行。

1.11 蛋白表達的Western blot分析 在樣本中加入等體積的RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），置于冰上裂解30 min，用BCA試劑盒進行蛋白定量。取等量的蛋白，加入5×上樣緩沖液，95℃金屬浴10 min使蛋白變性，經(jīng)10% SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5% BSA室溫封閉1 h；分別加入CD63、ALIX、CD9抗體（均1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST緩沖液洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h；清洗后加入增強型化學發(fā)光試劑（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，SQ101）作用3 min，使用成像儀拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1 切向流過濾分離原始物料產(chǎn)物的鑒定 濃縮液產(chǎn)物經(jīng)納米顆粒追蹤分析，發(fā)現(xiàn)顆粒直徑主要分布在0～250 nm之間，見圖2。對濃縮培養(yǎng)基進行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)存在大量雜蛋白，未見細胞外囊泡，見圖3。提示需要后續(xù)工藝來進一步純化細胞外囊泡。

圖2 切向流過濾濃縮產(chǎn)物的粒徑分布Fig.2 Size distribution of concentrated product of isolate by TFF

圖3 切向流過濾濃縮產(chǎn)物的透射電鏡觀察Fig.3 Transmission electron microscopy of concentrated product of isolate by TFF

2.2 100 kD超濾分離切向流過濾濃縮液產(chǎn)物的鑒定 濃縮液產(chǎn)物經(jīng)100 kD超濾管1次和2次過濾純化的產(chǎn)物經(jīng)納米顆粒追蹤分析發(fā)現(xiàn)，顆粒直徑仍主要分布在0～250 nm之間，但2次超濾會嚴重減少獲得的顆粒數(shù)量，見圖4。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，1次和2次超濾后的濃縮液里均未檢測到囊泡樣結(jié)構(gòu)，仍存在較多的雜蛋白，見圖5，因此，無法使用100 kD超濾純化切向流過濾濃縮后的培養(yǎng)基。

圖4 切向流過濾濃縮產(chǎn)物經(jīng)1次和2次100 kD超濾后產(chǎn)物的粒徑分布Fig.4 Size distribution of concentrated products of isolates by TFF and subsequent 100 kD ultrafiltration for 1 and 2 times

圖5 切向流過濾濃縮產(chǎn)物經(jīng)1次（A）和2次（B）100 kD超濾后的透射電鏡觀察Fig.5 Transmission electron microscopy of concentrated products of isolates by TFF and subsequent 100 kD ultrafiltration for 1（A）and 2（B）times

2.3 超速離心法分離切向流過濾濃縮液產(chǎn)物的鑒定超速離心產(chǎn)物經(jīng)納米顆粒追蹤分析發(fā)現(xiàn)，純化后的顆粒直徑主要分布在0～250 nm之間，見圖6。透射電鏡下可在不同視野中均明確觀察到囊泡樣結(jié)構(gòu)，見圖7。表明使用切向流濃縮培養(yǎng)基后，可通過超速離心進一步分離純化細胞外囊泡。

圖6 切向流過濾濃縮產(chǎn)物經(jīng)超速離心后的粒徑分布Fig.6 Size distribution of concentrated product of isolate by TFF and subsequent ultracentrifugation

圖7 不同視野下切向流過濾濃縮產(chǎn)物經(jīng)超速離心后的透射電鏡觀察Fig.7 Transmission electron microscopy of concentrated products of isolates by TFF and subsequent ultracentrifugation under different visual fields

2.4 切向流過濾結(jié)合超速離心分離間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基產(chǎn)物的鑒定 納米顆粒追蹤分析發(fā)現(xiàn)，純化后產(chǎn)物的顆粒直徑均主要分布在0～250 nm之間，見圖8。透射電鏡觀察可見囊泡樣結(jié)構(gòu)，見圖9。Western blot分析顯示，純化后的細胞外囊泡CD9、CD63和ALIX蛋白呈陽性表達，見圖10，證明純化的小細胞外囊泡中含有外泌體，因此該方法也可用于外泌體的分離提取。

圖8 切向流過濾結(jié)合超離分離臍帶間充質(zhì)干細胞上清產(chǎn)物的粒徑分布Fig.8 Size distribution of product of umbilical cord mesenchymal stem cell supernatan tisolated by TFF combined with ultracentrifugation

圖9 切向流過濾結(jié)合超離分離臍帶間充質(zhì)干細胞上清產(chǎn)物的透射電鏡觀察Fig.9 Transmission electron microscopy of product of umbilical cord mesenchymal stem cell supernatant isolated by TFF combined with ultracentrifugation

圖10 切向流過濾結(jié)合超離分離臍帶間充質(zhì)干細胞上清產(chǎn)物的Western blot分析Fig.10 Western blotting of product of umbilical cord mesenchymal stem cell supernatant isolated by TFF combined with ultracentrifugation

3 討論

由于血清中存在大量的細胞外囊泡，本實驗配置含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為測試切向流分離小細胞外囊泡的原始物料。考慮到小細胞外囊泡粒徑大小范圍一般為30～200 nm［14］，因此在切向流過濾系統(tǒng)中，選擇0.45 μm膜包去除較大的雜蛋白和囊泡，選擇300 kD膜包過濾去除小分子蛋白，并對培養(yǎng)基中的小細胞外囊泡進行濃縮。隨后，本實驗檢測了100 kD超濾管過濾對切向流過濾濃縮液的分離效果，發(fā)現(xiàn)使用100 kD超濾管分別進行1次過濾和2次過濾均無法獲得細胞外囊泡。

超速離心作為分離小細胞外囊泡的常規(guī)方法，能夠有效地從細胞上清中分離、純化小細胞外囊泡，但該方法能否用于分離濃縮后的細胞上清目前尚不明確。本實驗發(fā)現(xiàn)，切向流過濾后的濃縮培養(yǎng)基能夠通過超速離心獲取細胞外囊泡，證明該方法可應(yīng)用于實際生產(chǎn)中大批量的小細胞外囊泡分離。

以外泌體為代表的小細胞外囊泡治療應(yīng)用目前已得到越來越多的重視［15-16］，但在相關(guān)臨床試驗開展過程中，如何快速、高效地分離小細胞外囊泡一直是亟待解決的問題［17-18］。聚乙二醇沉淀法、尺寸排阻柱法等方法在分離過程中會引入化學試劑，難以應(yīng)用于臨床治療中；超速離心法不涉及外源物質(zhì)的添加，但分離耗時較長，難以應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化批量制備［19-23］。前期有研究發(fā)現(xiàn)，可使用切向流過濾來富集外泌體［24-26］，但切向流過濾與超速離心法的結(jié)合能否進一步提升小細胞外囊泡的分離效率尚不明確。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步證明了切向流過濾結(jié)合超速離心法在有效獲得細胞上清中小細胞外囊泡的同時能夠縮短實驗時間，提升小細胞外囊泡的分離效率，因此，該方法有望在細胞外囊泡的產(chǎn)業(yè)制備應(yīng)用中進行推廣。