腫瘤抗體藥物偶聯(lián)物的研發(fā)進(jìn)展和挑戰(zhàn)*

李博樂 馮紅蕾 魏楓 孟帥 吳春暖 張潔 任秀寶

抗體藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）是新一代的以大分子為載體的靶向藥物，由抗體和小分子細(xì)胞毒藥物（載荷毒素）通過連接子形成偶聯(lián)物，利用抗體的靶向性，特異性識別靶細(xì)胞表面的抗原，經(jīng)由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，通過裂解或酶解的方式，釋放細(xì)胞毒藥物，達(dá)到殺傷靶細(xì)胞的目的（圖1）。其獨(dú)特的構(gòu)成方式，使其藥物設(shè)計、藥代動力學(xué)、藥效學(xué)、療效、不良反應(yīng)甚至耐藥機(jī)制均不同于其他類型的藥物。Adcetris?和Kadcyla?等ADC 藥物相繼取得成功，顯示了此類藥物在抗腫瘤治療領(lǐng)域的巨大潛力，并引起了廣泛關(guān)注。截至2022年2月，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)12 款A(yù)DC 藥物上市，全球共有14 款A(yù)DC 藥物上市（表1）；同時，超過80 款A(yù)DC 藥物正在開展臨床試驗(yàn)，適應(yīng)證也拓展到更多的疾病領(lǐng)域[1]。

表1 全球已上市ADC 藥物概覽

表1 全球已上市ADC 藥物概覽 （續(xù)表1）

ADC 藥物自發(fā)展之初，經(jīng)歷了三代技術(shù)變革，第一代ADC 使用鼠源單抗，存在免疫原性反應(yīng)，載荷毒素活性較差，連接穩(wěn)定性差，導(dǎo)致治療窗窄，安全性低；第二代ADC 采用人源化單抗，免疫原性降低，且靶向性和連接穩(wěn)定性均有所提高；第三代ADC 在偶聯(lián)方式上有所改進(jìn)，由隨機(jī)偶聯(lián)改為定點(diǎn)偶聯(lián)，并采用計量載荷毒素技術(shù)，使藥物-抗體偶聯(lián)比（drug-to-antibody ratio，DAR）的分布集中，增強(qiáng)療效的同時降低不良反應(yīng)，改善了藥代動力學(xué)特性[2]。本文就ADC 藥物的靶點(diǎn)、抗體、載荷毒素、連接子及偶聯(lián)方式的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 靶標(biāo)抗原的選擇

靶細(xì)胞的識別和內(nèi)吞是ADC 藥物發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，一個有效的靶標(biāo)抗原是將載荷毒素成功遞送進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞的關(guān)鍵驅(qū)動因素。隨著更多靶標(biāo)抗原的發(fā)現(xiàn)，一些適于ADC 藥物靶點(diǎn)的關(guān)鍵特性如下：1）靶標(biāo)抗原需要有特定的表達(dá)譜，即在藥物的作用部位（通常是腫瘤細(xì)胞）高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)。2）靶點(diǎn)的內(nèi)化和周轉(zhuǎn)率，控制著載荷毒素輸送至生物層的效率，影響藥物的活性。非內(nèi)化或內(nèi)化效率低使未內(nèi)吞的藥物引發(fā)毒性，因此提高細(xì)胞的穿透效率對靶抗原的選擇很重要。3）靶標(biāo)抗原的密度（受體拷貝數(shù)）同樣重要，從單抗與靶標(biāo)抗原結(jié)合的機(jī)制出發(fā)，對于內(nèi)化速率低的靶標(biāo)抗原而言，載荷毒素的遞送效率對靶點(diǎn)密度更敏感[3]。

近年來也發(fā)展出一些多樣化的篩選方法，如基于mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)庫、TCGA 數(shù)據(jù)庫等分析ADC 藥物靶標(biāo)的表達(dá)譜，但因mRNA 的局限，如未翻譯成蛋白質(zhì)、產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不呈現(xiàn)在細(xì)胞表面、不能內(nèi)化等因素，須謹(jǐn)慎解釋 mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。也有報道利用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的方法候選mRNA 分析中掩蓋的靶標(biāo)抗原從而發(fā)現(xiàn)潛在靶點(diǎn)。目前已上市的ADC 藥物針對血液腫瘤的靶點(diǎn)有CD19、CD22、CD30、BCMA等，針對實(shí)體瘤的靶點(diǎn)有HER2、TROP2、Nectin4、EGFR 和HF。實(shí)體瘤的抗原表達(dá)存在不穩(wěn)定的問題，抗原缺失會造成耐藥問題，因此，除腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原外，利用腫瘤微環(huán)境或腫瘤干細(xì)胞表達(dá)的抗原也已進(jìn)入臨床階段，如CD25、CD205、B7-H3、DLL3、PTK7、5T4 等[4]，這些基因組產(chǎn)生突變的可能性更低，并能在腫瘤微環(huán)境中的特殊環(huán)境下響應(yīng)斷裂，釋放藥物至腫瘤細(xì)胞外的基質(zhì)，從此方向解決耐藥性問題。

2 抗體的選擇

抗體的選擇應(yīng)滿足低免疫原性，低交叉反應(yīng)活性，高靶點(diǎn)結(jié)合能力和在血漿中適宜的半衰期。

IgG 是目前已上市和在研ADC 藥物主要的抗體骨架。人類IgG 包含4 個亞型，分別為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，四者在恒定結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)有所不同，導(dǎo)致其與補(bǔ)體及Fcγ 受體的親和力及半衰期不同。因IgG1 亞型有豐度較高，較好地平衡免疫激活效應(yīng)和半衰期的關(guān)系，更易開發(fā)，大多數(shù)ADC 藥物采用該亞型；IgG2 由不同的二硫異構(gòu)體結(jié)構(gòu)連接成復(fù)雜的鉸鏈區(qū)；IgG3 由于清除率過快而不被采用；而IgG4 因鉸鏈區(qū)的絲氨酸-脯氨酸突變可能形成半抗體或雙特異性抗體而造成脫靶效應(yīng)，目前多采用S228P 點(diǎn)突變來克服此缺陷。IgG2 和IgG4 與補(bǔ)體及Fcγ 受體的親和力稍弱，抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）效應(yīng)相對較弱。研發(fā)過程中，為了提高藥物的效力或降低ADCC，CDC 效應(yīng)疊加載荷毒素帶來的不良反應(yīng)，而采用不同的IgG 亞型；或在相同亞型上進(jìn)行去巖藻糖修飾或氨基酸突變等[5]。如曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物保留了曲妥珠單抗本身的特征，與HER2 結(jié)合并抑制PI3K-AKT 通路，發(fā)揮Fcγ 受體介導(dǎo)的ADCC 效應(yīng)以增強(qiáng)藥物效力。而靶向CXCR4的先導(dǎo)ADC 713，為了減輕對造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的毒性，通過Fc 段N297A 的突變降低了ADCC 和CDC 效應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)低毒高效的目的[6]。

隨著抗體工程的發(fā)展，近年來出現(xiàn)了為增加抗原親和力及克服腫瘤異質(zhì)性而采用的雙特異性抗體藥物偶聯(lián)物[7]；此外，抗體作為大分子，限制了其向腫瘤組織的遞送和滲透能力，為了提高滲透能力而采用的抗體片段藥物偶聯(lián)物[8]，多肽偶聯(lián)藥物，以及小分子配體偶聯(lián)藥物均成為目前研究的熱點(diǎn)。

3 載荷毒素的選擇

小分子細(xì)胞毒藥物作為ADC 藥物發(fā)揮殺傷腫瘤的主要組成部分，其毒性和理化特性會直接影響療效，其選擇需要考慮以下方面：1）具有較高的抗腫瘤活性，IC50范圍通常在10?10～10?12M[9]。毒素偶聯(lián)至抗體后仍保持穩(wěn)定性和細(xì)胞毒活性，傳統(tǒng)的化療藥如甲氨蝶呤、長春花堿等，偶聯(lián)后細(xì)胞毒作用大幅降低，無法發(fā)揮殺傷能力。2）具有適當(dāng)?shù)挠H水性，確保偶聯(lián)物在生理條件下有較好的溶解度。疏水性過高，尤其是疊加DAR 值高的因素后，易誘發(fā)抗體聚集，引起藥物清除率和免疫原性增加，從而降低藥效。3）有適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)，便于與連接子進(jìn)行偶聯(lián)[10]。

目前已上市的ADC 藥物的載荷毒素主要有兩大類型，一類是微管蛋白抑制劑，另一類是DNA 破壞劑，見圖2。

3.1 微管蛋白抑制劑

微管對細(xì)胞的形態(tài)維持，細(xì)胞運(yùn)動、分裂，胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均起著重要的作用。因其動態(tài)不穩(wěn)定性，微管蛋白抑制劑可分為微管蛋白聚合抑制劑和促進(jìn)微管蛋白聚合的穩(wěn)定劑，代表藥物分別是長春堿類和紫杉烷類，已上市的ADC 載荷毒素多屬于前者。dolastatins-10 是海洋軟體動物Dolabellaauricularia的一種多肽，以其結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)合成的單甲基auristatin E（MMAE）和單甲基auristatin F（MMAF），細(xì)胞毒性是長春堿的200 倍；MMAE 和MMAF 也是在研臨床試驗(yàn)中采用最多的載荷毒素。Maytansine（美登素）從Maytenus 屬植物分離而得，經(jīng)過半合成得到maytansinoids（美登素類化合物）如DM1、DM3、DM4，其細(xì)胞毒性是長春新堿的100 倍，三者的區(qū)別在于側(cè)鏈不同帶來的穩(wěn)定性差異和連接方式的可選擇性。Tubulysins 分離自粘細(xì)菌培養(yǎng)物，IC50值為0.01～10 nM，其細(xì)胞毒性是紫杉醇的1 000 倍，但本身水溶性差，通過連接β-環(huán)糊精和聚乙二醇及納米顆粒的封裝，大幅提高了其水溶性和效力[11]。Cryptophycins（念珠藻素）從陸地藍(lán)綠藻分離而來，因穩(wěn)定性和水溶性差，在體內(nèi)無活性，經(jīng)結(jié)構(gòu)改造得到的cryptophycin 52 在皮摩爾濃度水平有抗腫瘤活性[12]。

3.2 DNA 破壞劑

DNA 破壞劑較微管蛋白抑制劑有更高的效力，其IC50值范圍通常在皮摩爾濃度水平，不依賴細(xì)胞周期，對非分裂細(xì)胞的殺傷更顯優(yōu)勢。目前研發(fā)的載荷毒素DNA 破壞劑有四種作用機(jī)制[13]：1） DNA 雙鏈斷裂，代表藥物為calicheamicin（卡奇霉素），由Micromonospora echinospora 細(xì)菌分離得到，calicheamicin γ1 效力較高，其細(xì)胞毒性約為多柔比星的4 000 倍。2）DNA 烷基化，代表藥物duocarmycin（倍癌霉素），由Streptomyces zelensis 鏈霉菌分離得到，可與DNA 小溝結(jié)合，引起不可逆的烷基化。3）DNA嵌入，代表藥物為喜樹堿類似物，即拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，如Exatecan mesylate（DX-8951f），經(jīng)過氨基羥基乙酰化得到DS8201 的載荷部分），對MDR1 介導(dǎo)的耐藥細(xì)胞有效；再如SN-38，伊利替康的活性代謝物，比母體效力高約1 000 倍。4）DNA 交聯(lián)，代表藥物為吡咯并苯二氮?類化合物（pyrrolobenzodiazepines，PBD），可識別并交聯(lián)到DNA 小溝的特定序列，選擇性烷基化形成惰性的共價化合物。Anthramycin（安曲霉素）是第一個合成的PBD 化合物，目前已有超過10 個PBD 類似物在研。PBD 的二聚體使其體外效力提升了600 倍，此外，PBD 可以避免MDR1 介導(dǎo)的耐藥性[14]。

3.3 新型載荷毒素

除了上述兩類上市ADC 藥物采用的載荷毒素類型，近年來又發(fā)展出多種類型的載荷毒素，包括凋亡誘導(dǎo)劑（Bcl-xl 抑制劑）、RNA 剪接抑制劑、轉(zhuǎn)錄抑制劑、蛋白酶抑制劑[15]等。此外，將疾病相關(guān)信號通路的藥物作為載荷毒素，也將ADC 藥物拓展至腫瘤外的其他領(lǐng)域。

4 連接子的選擇

連接子是建立抗體與載荷毒素共價連接的部分，不僅關(guān)系到藥物的穩(wěn)定性，還影響其藥代動力學(xué)、藥效學(xué)和治療窗。連接子應(yīng)具有適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，避免到達(dá)靶點(diǎn)前裂解而產(chǎn)生脫靶毒性；并能在作用位點(diǎn)快速裂解或酶解，釋放載荷毒素；同時還需保持適當(dāng)?shù)挠H水性，疏水性連接子偶聯(lián)疏水性載荷毒素促進(jìn)ADC 藥物聚化，增加了MDR1 的外排和藥物清除，降低了藥物的效力。

為了增強(qiáng)連接子和載荷毒素連接的穩(wěn)定性，近年來發(fā)展出一些新的連接策略，如組織蛋白酶特異性識別的肽鍵、糖苷酶可裂解的糖苷鍵、磷酸酶可裂解的磷酸二酯鍵等，利用這些化學(xué)觸發(fā)器，增強(qiáng)了裂解特異性的同時增加了藥物在血漿中的穩(wěn)定性。如利用含有β-半乳糖苷鍵的鄰羥基保護(hù)的芳基硫酸鹽連接子，在PBS 和血漿中均表現(xiàn)出7 天的穩(wěn)定性[16]。此外，簡化連接子結(jié)構(gòu)以降低臨床前研究難度也是改進(jìn)策略，如通過二硫鍵將載荷毒素與抗體上的工程化氨基酸直接相連，實(shí)現(xiàn)藥物在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性[17]。

連接子從載荷毒素的釋放機(jī)制上可分為可裂解連接子和不可裂解連接子（圖3）；從連接方法上分為化學(xué)依賴的連接和酶依賴的連接。

4.1 可裂解的連接子

4.1.1 pH 敏感的腙鍵 設(shè)計的初衷是偶聯(lián)物在胞內(nèi)核內(nèi)體（pH 5.0～6.0）或溶酶體（pH 約4.8）進(jìn)行降解，但實(shí)際情況是藥物在血液循環(huán)（pH 7.4）中也存在不穩(wěn)定的情況，易裂解而造成脫靶毒性。如輝瑞公司的Mylotarg?2010年自主退市，正是因?yàn)槠涑跏紕┝吭O(shè)置過高加上連接子不穩(wěn)定造成的嚴(yán)重肝臟毒性[18]。目前，該類型連接子構(gòu)成的ADC 藥物主要應(yīng)用局限于血液腫瘤。

4.1.2 可還原的二硫鍵 l 在生理pH 條件下穩(wěn)定，但容易受到硫醇的親核攻擊。腫瘤胞質(zhì)中含大量的谷胱甘肽（1～10 mM），含有硫醇基團(tuán)。因此，利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)外谷胱甘肽的濃度差，尤其是腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激會提高胞內(nèi)GSH 水平，實(shí)現(xiàn)裂解釋放載荷毒素。在二硫鍵旁插入甲基進(jìn)一步增強(qiáng)此類連接子在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性。輝瑞公司的Mylotarg?和Besponsa?均采用此技術(shù)；另外，美登素類化合物因其酰胺鍵的β 位含有硫醇基團(tuán)，而便于采用此種策略進(jìn)行偶聯(lián)[19]。

4.1.3 組織蛋白酶B 特異性識別的二肽或多肽鍵組織蛋白酶B 在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，該酶有很多底物，但優(yōu)先識別苯丙氨酸-賴氨酸（Phe-Lys）和纈氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）等序列，并裂解C-末端的肽鍵。Phe 和Val 作為疏水殘基，保持了在血漿中的穩(wěn)定性，而Lys 和Cit 作為親水殘基，保證了水溶性并降低了藥物的聚集性。為了使載荷結(jié)構(gòu)和單抗結(jié)構(gòu)間利于酶的進(jìn)入，引入一個無活性的間隔單元對氨基芐氧羰基（PABC），上述序列連接PABC 構(gòu)成Val-Cit-PABC和Val-Ala-PABC 連接子[20]。代表藥物有美國Seagen公司的Adcetris?和Padcev?。值得注意的是，盡管該類型連接子較腙鍵和酯鍵有更好的穩(wěn)定性，但Phe-Lys 的長期穩(wěn)定性仍待提高。此外，不同序列的親疏水性不同，穩(wěn)定性不同，可實(shí)現(xiàn)的的藥物DAR 值也有所區(qū)別。

4.1.4 糖苷酶可裂解的糖苷鍵 β-葡萄糖醛酸酶是一種糖苷酶，可水解多糖中的β-葡萄糖醛酸殘基，專屬性強(qiáng)；在腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)均有分布，理論上提供了ADC 藥物在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮作用的可能性。結(jié)構(gòu)上采用β-葡萄糖醛酸單元連接間隔單元構(gòu)成連接子。該連接子的親水性使構(gòu)成的ADC 藥物不易聚化，從而降低了藥物清除率而提高效力，且能負(fù)載更多的載荷毒素提高DAR 值，進(jìn)一步提高藥物效力[21]。

4.1.5 （焦）磷酸酶可裂解的（焦）磷酸二酯鍵 該類酶在溶酶體中選擇性表達(dá)，結(jié)構(gòu)是一種陰離子連接子，具有更好的親水性和穩(wěn)定性。偶聯(lián)物內(nèi)化后，通過內(nèi)體-溶酶體的（焦）磷酸酶進(jìn)行兩步酶切，裂解得到醇類化合物。釋放載荷藥物的速率取決于靠近（焦）磷酸結(jié)構(gòu)的取代基，通過引入乙縮醛間隔單元加速藥物釋放[22]。但該類型連接子血漿穩(wěn)定性稍差，需進(jìn)行進(jìn)一步修飾，如引入芳烴硫酸鹽[23]。

4.2 不可裂解的連接子

連接子部分不被裂解或酶解，藥物內(nèi)化后依賴胞質(zhì)或溶酶體對抗體部分的氨基酸進(jìn)行酶解，釋放出與氨基酸殘基相連的載荷毒素。優(yōu)點(diǎn)在于該類型連接子的ADC 藥物在血液循環(huán)中更穩(wěn)定，缺點(diǎn)在于裂解的載荷結(jié)構(gòu)連有帶電的氨基酸，影響其細(xì)胞的滲透性和活性[24]。采用這種類型連接子的ADC 藥物不具有“旁觀者效應(yīng)”，即帶電荷的載荷毒素?zé)o法進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，無法實(shí)現(xiàn)對靶抗原異質(zhì)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)進(jìn)行殺傷。因此，裂解后的載荷毒素須保持相當(dāng)?shù)目鼓[瘤效力，這對載荷藥物結(jié)構(gòu)的選擇和修飾提出了更高的要求。代表藥物有羅氏公司的Kadcyla?和GSK公司的Blenrep?。

因此，連接子的選擇要兼顧載荷毒素的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，使之利于連接并降低藥物的聚集；平衡親疏水性，保持穩(wěn)定性和釋放效率。此外，酶依賴的連接子殘基單元在不同細(xì)胞或組織中的表達(dá)高低有別，可利用在腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的殘基設(shè)計連接子以進(jìn)一步提高藥物效力。

5 偶聯(lián)方式的選擇

偶聯(lián)方式可分為隨機(jī)偶聯(lián)和定點(diǎn)偶聯(lián)。偶聯(lián)方式不僅會影響DAR，還會影響ADC 藥物的均一性。已上市的ADC 藥物大部分采用隨機(jī)偶聯(lián)的方式，將不同數(shù)量的載荷毒素連接至抗體的不同位點(diǎn)，組成不同DAR 的異構(gòu)混合物。DAR 過高會導(dǎo)致藥物聚集，增加清除率，并可能因藥物在血液循環(huán)中釋放載荷毒素而造成不良反應(yīng)。DAR 分布寬的ADC 混合物因藥代動力學(xué)、活性、安全性各不相同，導(dǎo)致穩(wěn)定性、療效、生產(chǎn)的可重復(fù)性下降。定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)可以決定載荷毒素結(jié)合的位點(diǎn)和數(shù)量，盡管尚未做到DAR 值單一，但使DAR 值分布集中，降低異質(zhì)性水平，提高ADC 藥物的穩(wěn)定性，改善了藥動學(xué)特性，使之更易預(yù)測。目前，對不同性質(zhì)的載荷毒素及抗體類型，選擇何種位點(diǎn)特異性的修飾方法最優(yōu)，尚難以預(yù)測。但隨著新型分析技術(shù)的應(yīng)用，以及ADC 藥物臨床前及臨床數(shù)據(jù)的積累，將會發(fā)展出定點(diǎn)偶聯(lián)的選擇策略。

5.1 隨機(jī)偶聯(lián)

隨機(jī)偶聯(lián)產(chǎn)生的ADC 藥物DAR 值主要受藥物/抗體化學(xué)計量比的控制。

5.1.1 賴氨酸偶聯(lián) 此種偶聯(lián)方式可靠、高產(chǎn)，抗體上約有80 個賴氨酸殘基，具有高豐度的特點(diǎn)，其中有10 個可供連接[25]。缺點(diǎn)是偶聯(lián)后會得到連接在不同位點(diǎn)的不同DAR 值的產(chǎn)物，且有些賴氨酸殘基接近抗體的互補(bǔ)決定區(qū)，會影響抗體的特異性和親和力。DAR 的控制主要依靠載荷藥物/抗體的化學(xué)計量比。代表藥物有羅氏公司的Kadcyla?，輝瑞公司的Mylotarg?和Besponsa?。

5.1.2 半胱氨酸偶聯(lián) 人IgG1 抗體有4 個鏈間二硫鍵和12 個鏈內(nèi)二硫鍵，鏈間二硫鍵不影響抗體穩(wěn)定性，與馬來酰亞胺的連接子反應(yīng)，產(chǎn)生DAR 值為2、4、6、8 的ADC 藥物[25]。由于結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量有限和巰基的獨(dú)特反應(yīng)性，用半胱氨酸作為連接位點(diǎn)有助于控制DAR，降低異質(zhì)性。代表藥物有Seagen 公司的Adcetris?。

5.2 定點(diǎn)偶聯(lián)

5.2.1 對天然抗體的位點(diǎn)特異性修飾 在不改變抗體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用不同方法對抗體的不同位點(diǎn)進(jìn)行修飾：1）化學(xué)法修飾氨基酸：利用可逆分子間反應(yīng)將“化學(xué)關(guān)鍵蛋白”置于抗體的賴氨酸殘基，其官能團(tuán)與賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺，從而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記蛋白的目的。然后，關(guān)鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應(yīng)以調(diào)節(jié)位點(diǎn)的選擇性。最后通過酰胺鍵與連接子及載荷藥物偶聯(lián)[26]。Matos 等[27]采用烯酸磺酰試劑可控地修飾蛋白質(zhì)中最親核（pKa 最低）的賴氨酸殘基，即選擇性地修飾單一賴氨酸殘基，大幅降低異質(zhì)性。也有多項報道利用自降解的馬來酰亞胺，即通過鄰近的官能團(tuán)，如伯胺、聚乙二醇、N-芳烴催化馬來酰亞胺開環(huán)，以實(shí)現(xiàn)與半胱氨酸選擇性的反應(yīng)[28]。2）二硫鍵橋連：ThioBridge?技術(shù)利用雙砜烷基化抗體鏈間還原型二硫鍵的巰基基團(tuán)，從而以共價方式重新連接二硫鍵并和連接子偶聯(lián)，根據(jù)連接子上載荷藥物的數(shù)量，可形成DAR 4、8、16 的偶聯(lián)物，所得的偶聯(lián)物保留了與抗原的親和力，并在血液中穩(wěn)定[29]。成熟的交聯(lián)試劑除雙砜外，還有新型馬來酰亞胺和噠嗪類化合物。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)動力學(xué)和產(chǎn)物均質(zhì)性好，糖基化模式不受影響；缺點(diǎn)是可能形成鏈間錯位橋連。3） 糖基化修飾 IgG 的Fc 片段重鏈的CH2 結(jié)構(gòu)域N297 位置包含1 個N-聚糖，因與可變區(qū)抗原結(jié)合位點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，其修飾幾乎不影響抗體的抗原結(jié)合能力；加上不同抗體類型的糖基化模式保守，簡化了修飾難度，是一個很好的位點(diǎn)特異性修飾連接點(diǎn)[30]。具體的方法為：①糖氧化，氧化聚糖為醛，與酰肼修飾的連接子進(jìn)行偶聯(lián)；為了降低異質(zhì)性，將對氧化劑（如高碘酸鹽）敏感的唾液酸殘基引入抗體N-聚糖，降低氧化劑的濃度，并使氧化只針對該殘基。②內(nèi)切糖苷酶，催化水解非末端糖殘基間的多糖鏈，水解后，糖基被連接到新的末端殘基上，從而功能化糖鏈的核心結(jié)構(gòu)，以便連接子的偶聯(lián)。③糖基轉(zhuǎn)移酶，對抗體進(jìn)行修剪，去除特定的糖殘基，然后通過酶催化，產(chǎn)生疊氮化物或酮的標(biāo)記，以便連接子偶聯(lián)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物均質(zhì)化，不改變氨基酸序列；缺點(diǎn)是糖基化特征在免疫識別中起重要作用，修飾的同時要避免影響。

5.2.2 工程化抗體的位點(diǎn)特異性修飾 利用不同的方法在抗體結(jié)構(gòu)上引入天然或非天然的氨基酸：1）化學(xué)法引入工程化氨基酸 THIOMAB?技術(shù)在抗體兩個重鏈上引入新的半胱氨酸殘基，經(jīng)部分還原暴露反應(yīng)性的硫醇，用于連接子偶聯(lián)。經(jīng)過改造的半胱氨酸技術(shù)能夠穩(wěn)定生成DAR 為2 的高度同質(zhì)ADC（占比高達(dá)92.1%）。在此基礎(chǔ)上，新方法不斷提升DAR，包括通過將半胱氨酸殘基進(jìn)行硫醇芳基化和使用二溴重新橋接二硫鍵，這兩種方法將得到DAR 值分別為4.4 和4 的ADC[31]。在抗體的不同位置工程化半胱氨酸改造，產(chǎn)物的抗原結(jié)合、內(nèi)源穩(wěn)定性和效力不同，具有低溶劑可及性和局部正電荷的半胱氨酸殘基在血漿中更穩(wěn)定。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物均質(zhì)化，通過修飾可調(diào)反應(yīng)性和穩(wěn)定性；缺點(diǎn)是需進(jìn)行基因工程。2）酶法插入工程化氨基酸：采用特定的酶，識別特定的氨基酸序列，經(jīng)修飾暴露出反應(yīng)基團(tuán)，與相應(yīng)的連接子進(jìn)行偶聯(lián)。如SMARTag 技術(shù)，創(chuàng)建了特定氨基酸序列標(biāo)簽Cys-X-Pro-X-Arg，利用甲酰甘氨酸生成酶（FGE）識別其中的半胱氨酸，并氧化位甲酰甘氨酸，修飾后的抗體可與醛基特異性的連接子進(jìn)行偶聯(lián)[32]。再如利用微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG），催化去糖基化抗體的295位谷氨酰胺側(cè)鏈與伯胺之間形成共價鍵。單抗的重鏈Fc 段均含有谷氨酰胺殘基，只要?；荏w含有伯胺，就可以進(jìn)行偶聯(lián)，并產(chǎn)生均一的DAR 值為2 的偶聯(lián)物[33]。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是酶法反應(yīng)條件溫和，特異性高，產(chǎn)物均質(zhì)化，可改變DAR；缺點(diǎn)是需進(jìn)行基因工程。3）引入非天然氨基酸：利用定位突變方法在克隆基因上產(chǎn)生1 個終止密碼，由tRNA/氨酰tRNA 合成酶在轉(zhuǎn)錄mRNA 上識別，再經(jīng)肽酰轉(zhuǎn)移酶及延伸因子的催化將非天然氨基酸（ncAA）引入肽鏈的特定位置。從而使非天然氨基酸整合到抗體序列中，形成定點(diǎn)修飾。引入的位置要遠(yuǎn)離抗原結(jié)合區(qū)，鉸鏈區(qū)以及已知對Fc 受體重要的殘基，位點(diǎn)可暴露于溶劑且易于偶聯(lián)。引入的ncAA 不能引起免疫原性，能充分進(jìn)行共軛反應(yīng)，目前成熟的有酮類、疊氮類、環(huán)丙烯類或二烯類官能團(tuán)[34]。如通過在抗體中引入β-乙酰苯丙氨酸（pAcPhe），含有天然氨基酸中沒有的酮，酮官能團(tuán)與烷氧基胺間可形成肟鍵，該鍵在生理條件下非常穩(wěn)定[35]。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物均質(zhì)化，通過修飾可調(diào)反應(yīng)性和穩(wěn)定性；缺點(diǎn)是需進(jìn)行基因工程。

6 結(jié)語

ADC 藥物的作用機(jī)制獨(dú)特，經(jīng)過三代技術(shù)的發(fā)展，其穩(wěn)定性，DAR 值均一性和抗腫瘤活性均得到提升，治療窗也得以拓寬，對其作用機(jī)制的深入理解使其在抗原選擇、抗體修飾、載荷藥物篩選、連接子的構(gòu)建和偶聯(lián)方式的改進(jìn)及工藝標(biāo)準(zhǔn)的提高上均有突破，這使更多的ADC 藥物能夠上市，并讓患者獲益。但同時也應(yīng)注意，ADC 藥物的已知架構(gòu)與臨床獲益、不良反應(yīng)及耐藥間的聯(lián)系仍需進(jìn)行探索。目前，多個候選藥物和ADC 創(chuàng)新療法處于研究階段，該類藥物在腫瘤微環(huán)境中的影響也在探索中，其安全和廣泛使用還需要進(jìn)行藥效學(xué)和安全性生物標(biāo)志物的研究。隨著臨床試驗(yàn)的深入，僅適用于化療藥物或抗體藥物的研究方法可能無法預(yù)測ADC 藥物的臨床表現(xiàn)，因此還需開展一系列的臨床和基礎(chǔ)研究解決各種問題。

此外，ADC 藥物構(gòu)成元素多樣，使其技術(shù)平臺的應(yīng)用潛力巨大：1）替換抗體部分可以構(gòu)成多肽偶聯(lián)藥物，核酸適體偶聯(lián)藥物等，而替換載荷細(xì)胞毒藥物部分可以構(gòu)成抗體免疫刺激偶聯(lián)藥物，抗體寡核苷酸偶聯(lián)藥物等。2）該類藥物及技術(shù)平臺針對的疾病不局限于腫瘤，通過拓展至抗體+抗菌藥，抗體+Toll 樣受體激動劑等，已形成多樣化的藥物創(chuàng)新模式。