郭新月, 張 嵐,2, 張 晴, 左春柳, 李松洋, 嚴新悅, 袁 敏,2

(1.華北理工大學 生命科學學院,河北 唐山 063210； 2.華北理工大學 基因組學與計算生物學研究中心,河北 唐山 063210)

油菜素甾醇(BRs)作為一種植物內源類固醇激素,自從20世紀70年代被科學家們發(fā)現以來,其極強的生理活性激發(fā)了國際生物學和化學等領域科學家們濃厚的研究興趣.從BRs的生物合成與代謝、信號轉導、到生理作用,科學家們對BRs生物學功能的認識越來越深入.

不同于動物甾醇類激素只在特定的組織器官合成,植物體內幾乎所有的組織都具有甾醇類激素的合成能力.BRs合成的關鍵基因突變可導致植株矮化,葉片顏色深綠,葉柄縮短,花期延遲和頂端優(yōu)勢減弱等表型,外源施加BRs能恢復BR合成突變體的表型[1-2].植物體內產生的BRs首先被細胞膜表面的受體BRI1識別,BRs的結合磷酸化并激活BRI1及其共受體BAK1[3-4].活化的BRI1磷酸化并激活下游的激酶BSKs和CDG1,后者進一步磷酸化并激活下游的磷酸酶BSU1[5-6].活化的BSU1去磷酸化并失活下游的激酶BIN2[7].與此同時,磷酸酶PP2A快速地去磷酸化并激活轉錄因子BZR1/BES1[8],去磷酸化后的BZR1/BES1進入細胞核調節(jié)下游基因的表達[9-10],將信號向下傳導,參與調控植物體內多種生理過程的調控,包括促進細胞伸長與生長、暗形態(tài)建成、器官邊界形成,氣孔發(fā)育,性別決定,維管組織分化,雄性繁殖,種子萌發(fā),開花,衰老,以及對各種非生物和生物脅迫的抗性等[11-13].

目前油菜素甾醇類物質已發(fā)現70多種,并實現了大規(guī)模低成本工業(yè)化生產.農業(yè)生產上,BRs對水稻、小麥、玉米、棉花、芹菜、番茄、草莓和葡萄等多種植物表現出增產增收、提高抗逆性或提高果實品質等效果[14-15].隨著研究的深入,人們發(fā)現BRs影響植物生長和發(fā)育與濃度相關,尤其表現在BRs對植物根系的影響,并且不同植物根系對BRs的響應濃度存在差異[16].通常較低濃度的BRs促進植物主根和側根的發(fā)育,較高濃度的BRs促進側根發(fā)育的同時抑制主根的生長,過高濃度的BRs顯著抑制生長,主根和側根發(fā)育均受到顯著抑制[17].但是低濃度BRs促進而高濃度BRs抑制根生長的發(fā)育機制目前還不清楚.本研究利用轉錄組技術分析了不同濃度BRs處理下番茄幼苗根部的基因表達變化,旨在解析BRs調控植物根系發(fā)育的信號轉導途徑,為更加有效地利用BRs激素奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種為Micro-Tom,來源于華北理工大學生命科學學院植物分子生物學實驗室.

1.2 番茄幼苗不同濃度BRs處理及表型觀察

番茄種子用70 %酒精消毒1 min,10 %次氯酸鈉消毒7 min,無菌水沖洗6～8次后置于浸濕的滅菌濾紙上,28 ℃催芽48 h后分別點種于含有0,0.5,1,10和50 nmol/L 表油菜素內脂(eBL，BRs的一種)的1/2 MS固體平板培養(yǎng)基上,25 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下豎直培養(yǎng)4 d后觀察并拍照.Image J軟件測量各組根長,并利用Student′s t-test進行差異分析.

1.3 轉錄組測序分析

1.3.1 樣品收集、RNA提取及測序

將番茄幼苗在0,0.5,10 nmol/L eBL的1/2 MS固體培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)4 d,取根部,液氮凍存后送至上海元莘生物科技有限公司進行轉錄組測序,每組設置三個生物學重復.經RNA提取、質控、文庫構建、文庫質檢步驟后上機進行雙端測序.測序原始數據已上傳至Genome Sequence Archive(GSA,組學原始數據歸檔庫),收錄編號為CRA006812.

1.3.2 生物信息學分析

將測序原始數據(raw data)進行質量過濾獲得高質量的質控數據(clean data)并匯總統(tǒng)計.利用HISAT2的算法將質控數據于小番茄ITAG4.0參考基因組進行比對,(https:∥data.jgi.doe.gov/search?q=ITAG4.0&expanded=Phytozome-691),并用Stringtie拼接鑒定新基因和新轉錄本.針對已知和新鑒定的基因和轉錄本,經過質量控質后與NR(非冗余蛋白數據庫,https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)，SwissProt(蛋白質序列數據庫,https:∥www.uniprot.org/)，PFAM(蛋白質家族數據庫,https:∥pfam.xfam.org/)，GO(基因本體數據庫,http:∥geneontology.org/)，KEGG(代謝通路數據庫,https:∥www.kegg.jp/kegg/pathway.html)及STRING(蛋白網絡互作數據庫,https:∥cn.string-db.org/)六大數據庫進行比對注釋,全面獲取基因和轉錄本的功能信息.通過比對計算基因的表達水平.根據Hisat2軟件的比對結果,計算每個基因/轉錄本在樣本中的FPKM(每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的基因片段值)值,作為基因/轉錄本在樣本中的表達量,進而對表達數據進行統(tǒng)計學分析,依據|log2FoldChange|>=1.00為標準篩選不同樣本之間顯著差異表達的基因.針對差異表達基因進行GO與KEGG功能注釋與富集分析.利用GO數據庫可以將基因按照參與的生物學過程、構成細胞的組分、實現的分子功能分類.利用KEGG數據庫可以將基因按照參與的信號通路或行使的功能分類.

表1 引物列表Tab.1 List of Primers

1.4 實時熒光定量PCR( qRT-PCR)檢測候選基因的表達量

將番茄幼苗在0,0.5,和10 nmol/L eBL的1/2 MS固體培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)4 d,提取根部總RNA,反轉錄獲得cDNA.設計候選基因和內參基因(actin)特異性引物,見表1.qRT-PCR程序為：預變性(95 ℃,15 min),變性(95 ℃,10 s),退火延伸(60 ℃,32 s),40個循環(huán).每個樣品設置3次重復.利用單因素方差分析進行表達量的差異顯著性檢驗.

2 結果與分析

2.1 高濃度BRs抑制番茄幼苗主根伸長

為了研究BRs對番茄根系發(fā)育的影響,本研究比較了不同濃度eBL(0.5,1,10，50 nmol/L)處理4 d的番茄幼苗根系的形態(tài)特征.與對照相比,當eBL濃度為0.5 nmol/L時,主根長度增加,但差異不顯著；當eBL濃度升高至1 nmol/L時,主根長度變短,但差異不顯著；當eBL濃度升高至10 nmol/L及更高濃度時,主根伸長被顯著抑制(圖1).

圖1 番茄幼苗主根對不同濃度eBL的響應Fig.1 The Response of Tomato Seedlings Upon Different Concentration of eBL Treatment

表2 六大數據庫注釋結果Tab.2 Annotation Result in Six Different Databases

2.2 基因組比對與注釋

為了解析高濃度BRs抑制番茄幼苗主根伸長的分子機理,本研究對0，0.5，10 nmol/L的eBL培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)4 d的番茄幼苗根組織進行了轉錄組測序.測序共獲得 60.305 Gb質控后測序數據,單個樣品測序數據量均在6.87 Gb以上,各樣品平均數據量為 6.701 Gb,Q30(堿基錯誤識別率為0.1 %稱為Q30)堿基百分比在 93.06 %以上,GC含量為 42.42 %～42.60 %.將各樣品的質控后測序數據與指定的參考基因組進行序列比對,比對率從94.887 %到95.336 %不等,其中唯一比對率為92.530 %～92.950 %.六大數據庫注釋結果如表2所示,NR數據庫注釋率最高,共獲得30 463個基因注釋.

2.3 差異基因的鑒定

為了分析比較eBL處理組與對照組基因表達的差異,本研究對34 075個基因進行了表達量分析,基于基因表達量定量結果,進行組間差異分析,獲得組間差異表達的基因.0.5 nmol/L eBL處理組與對照相比,差異基因數較少,只有56個,包括46個上調和10個下調基因.這一結果與0.5 nmol/L eBL促進主根伸長不明顯相吻合.10 nmol/L eBL處理組與對照相比,主根伸長被顯著抑制,測序獲得的差異基因數也較多,共585個,包括271個上調和314個下調基因(表3).

表3 不同濃度eBL處理獲得的差異表達基因統(tǒng)計Tab.3 Summary of the Number of DEGs Detected Under Different Concentration of eBL Treatment

2.4 差異基因GO富集分析

為了進一步獲得差異表達基因的功能信息,本研究分別對上調和下調基因進行了GO富集分析,將基因按照參與的生物學過程、構成細胞的組分,實現的分子功能等進行分類,同時對GO富集最顯著性的前10位GO條目繪制網絡圖.0.5 nmol/L eBL處理與對照相比獲得的差異基因數目太少,未得到GO富集結果.10 nmol/L eBL處理產生的差異表達基因GO富集分析表明,上調基因主要富集在乙烯合成(ethylene biosynthetic process)和代謝(ethylene metabolic process),烯烴合成(alkene biosynthetic process,olefin biosynthetic process)和代謝(cellular alkene metabolic process,olefin metabolic process)2個方面.

橙黃節(jié)點代表GO條目；其他顏色的節(jié)點代表是富集到每個GO條目中的差異基因；橙黃節(jié)點的大小與富集到該通路中的差異基因個數成正比.圖2 10 nmol/L eBL處理上調基因的GO富集網絡圖Fig.2 GO Enrichment Network Diagram of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

2.4 差異基因KEGG富集分析

KEGG數據庫提供了整合代謝途徑查詢,系統(tǒng)分析基因功能和基因組信息,有助于把基因及表達信息作為一個整體網絡進行研究.為了獲得10 nmol/L eBL處理的差異基因參與的信號通路信息,本研究分別對上調和下調基因進行了KEGG富集分析,同時對KEGG富集最顯著性的前10位KEGG條目繪制網絡圖.結果如圖3和表4所示,上調基因在乙烯合成通路(cysteine and methionine metabolism),植物激素信號轉導(plant hormone signal transduction),植物MAPK信號轉導(MAPK signaling pathway-plant)和次級代謝產物的合成與代謝(biosynthesis of secondary metabolites)這幾方面有明顯的富集.

橙黃節(jié)點代表KEGG條目;其他顏色的節(jié)點代表是富集到每個KEGG條目中的差異基因;橙黃節(jié)點的大小與富集到該通路中的差異基因個數成正比.圖3 10 nmol/L eBL處理上調表達基因KEGG富集網絡圖Fig.3 KEGG Enrichment Network Diagram of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

表4 10 nmol/L eBL處理上調表達基因KEGG富集結果列表Tab.4 KEGG Enrichment List of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

2.5 乙烯合成相關差異表達基因的qRT-PCR驗證

轉錄組測序結果顯示eBL處理后番茄幼苗根中乙烯合成關鍵基因ACO(ACC氧化酶)和ACS(ACC合成酶)出現了明顯的表達上調.為了進一步證實該結果的準確性,本研究利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術驗證了0.5，10 nmol/L eBL處理后番茄幼苗根中ACO和ACS的表達量.結果顯示,與對照相比,0.5，10 nmol/L eBL處理均顯著促進了ACO和ACS的表達,且10 nmol/L eBL處理產生的促進效果更明顯(圖4).

誤差線代表3次生物學重復間的標準誤差; a,b,c代表顯著性差異p<0.05.圖4 qRT-PCR檢測含有不同濃度eBL的1/2 MS培養(yǎng)基上生長4 d的番茄幼苗根中ACO和ACS的表達量Fig.4 qRT-PCR Analysis of ACO and ACS Expression in the Tomato Roots of 4-day-old Seedlings Grown in 1/2 MS Medium Containing Different Concentrations of eBL

3 討論與結論

根系在植物的整個生命周期中發(fā)揮非常重要的作用,除了固著支持植株地上部分,還負責從土壤中吸收供植株生長發(fā)育所需的水分、無機鹽和礦物質等營養(yǎng)元素,合成并貯存有機物質.根深才葉茂,根系與地上部在代謝上緊密相聯,因此,對根系及其生長發(fā)育調控機理的研究,有助于農業(yè)上提高作物抗逆性，保證作物產量和品質.

根發(fā)育過程主要包括胚發(fā)育、分生區(qū)細胞的分裂和分化、伸長區(qū)細胞的伸長、成熟區(qū)根毛的形成與側根的起始和形成等.這一系列生長發(fā)育過程受到自身發(fā)育年齡,環(huán)境和激素等多種因素的影響,而根系的發(fā)育具有很大的可塑性,奠定了植物適應外界復雜多變環(huán)境的基礎[16-17].已有研究表明生長素在植物根生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用,外源施加生長素抑制主根的伸長而促進側根的產生.進一步研究發(fā)現生長素在分生區(qū)靜止中心區(qū)域積累,誘導PLT(plethora)基因的表達.外源施加乙烯合成前體ACC抑制主根伸長,并激活了AUX1和PIN2的表達.鉻通過激活生長素轉運蛋白基因AUX1導致生長素在根尖積累,進而抑制主根伸長,并且乙烯在此過程中起到協同作用[18-20].以上均表明生長素和乙烯交互調節(jié)根的發(fā)育.BRs被認為是一種新型的植物生長促進類激素,源于20世紀70年代Michell等發(fā)現它能夠使豌豆幼苗節(jié)間伸長.越來越多的證據表明BRs最典型的就是作用于細胞的伸長和分裂,并且在根細胞伸長、側根起始以及大豆根瘤發(fā)育中發(fā)揮重要作用[21-22].Chaiwanon等[17]發(fā)現低濃度的BRs促進擬南芥根的伸長,而高濃度的BRs會抑制擬南芥根的伸長.不同濃度BRs處理小麥幼苗,主根和側根均表現出低促高抑的現象,BRs濃度越高,抑制越嚴重.但是目前存在很多懸而未決的問題,如低濃度BRs促進而高濃度BRs抑制根生長的發(fā)育機制是什么；植物如何感知不同的BRs濃度；根中是否存在不同親和力的BRs受體.

BRs調控植物生長發(fā)育和代謝往往是與其他信號通路中的組分交互作用.已有研究表明BRs促進乙烯的生物合成而誘導氣孔關閉[23].BRs信號轉導通路的轉錄因子BZR1和乙烯信號通路的轉錄因子EIN3相互作用,協同調控基因表達,在暗中促進頂端彎鉤的發(fā)育,在光下協同促進細胞伸長,進一步豐富和完善了植物激素BRs和乙烯交叉互作的分子調控網絡[24-25].本研究中不同濃度BRs處理番茄幼苗,同樣發(fā)現高濃度BRs顯著抑制了番茄幼苗主根伸長.轉錄組分析表明,高濃度BRs處理引起乙烯合成通路,植物激素信號轉導,植物MAPK信號轉導和次級代謝產物的合成與代謝等途徑的基因明顯上調,進一步熒光定量PCR檢測證實0.5，10 nmol/L eBL處理均顯著促進了乙烯合成相關基因ACO和ACS的表達.結果暗示BRs和乙烯可能交叉互作調控高濃度BRs對植物主根生長的抑制,但是,二者交互影響的下游組分仍需進一步研究.

番茄營養(yǎng)豐富,既是蔬菜也是水果,是人們日常生活中不可或缺的果蔬之一,在中國南北方均廣泛種植.高產優(yōu)質番茄的培育對我國農業(yè)生產具有十分重要的意義.目前,番茄中有關BRs方面的研究還較少,限制了這一重要激素在番茄生產種植中的應用,本研究分析了不同濃度BRs處理對番茄幼苗根系的影響,研究結果不僅可為BRs在番茄生產中的科學正確使用提供理論基礎,也對BRs在植物根系發(fā)育的作用機制研究提供了支撐.