巨桉ARF轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與表達(dá)分析

何春玲，齊 妍，沈 超*

(1.茂名市農(nóng)業(yè)科技推廣中心，廣東茂名 525000；2.廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東茂名 525000)

生長素是在植物的胚胎形成、發(fā)育、葉片成熟和衰老、不定根的形成、果實(shí)發(fā)育等生長過程中起著調(diào)控作用的一種關(guān)鍵的植物激素，能夠促進(jìn)或者抑制靶基因合成產(chǎn)物。生長素響應(yīng)因子(auxin response factor，ARF)是植物中廣泛存在的影響生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其特異性結(jié)合生長素響應(yīng)元件TGTCTC，從而影響基因的表達(dá)，調(diào)控植物的生長發(fā)育。在1997年，Ulmasov等在擬南芥中鑒定出第一個(gè)生物素響應(yīng)因子，將其命名為AtARF1。測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)了基因組測(cè)序的發(fā)展，使越來越多物種的基因家族被鑒定，研究發(fā)現(xiàn)在不同物種間表現(xiàn)出差異化，且以多基因家族的形式存在。目前，除了擬南芥外，水稻、楊樹、番茄，玉米、大豆、葡萄、蘋果、香蕉和柳屬等植物的也陸續(xù)被鑒定出來。此外，miRNA與ta-siRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響基因的表達(dá)。如在擬南芥中，microRNA160對(duì)17的調(diào)控會(huì)對(duì)擬南芥不定根的發(fā)育產(chǎn)生影響。植物種子的萌發(fā)是microRNA160通過調(diào)控10、16和17來完成。TAS3 ta-siRNAs 和2、3 和4結(jié)合，抑制其表達(dá)。

巨桉木材材質(zhì)結(jié)構(gòu)粗、紋理筆直、耐朽性適中、易劈裂，因此在造紙、纖維板、礦柱材原料等方面普遍應(yīng)用，成為一種擁有高商業(yè)價(jià)值的樹種。同時(shí)，巨桉培育面積大，樹干通直，樹冠茂密，抵御外界惡劣環(huán)境能力強(qiáng)，易于生存，且萌芽能力強(qiáng)，一次造林能夠萌芽更新2代，廣泛用于人工造林，經(jīng)濟(jì)效益巨大。巨桉基因組測(cè)序已經(jīng)完成且已更新，極大地促進(jìn)了其分子遺傳學(xué)研究，為巨桉功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。筆者基于巨桉基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定分析了巨桉基因家族的結(jié)構(gòu)特征與組織表達(dá)模式，為后期進(jìn)一步對(duì)巨桉基因進(jìn)行功能解析提供基礎(chǔ)，彌補(bǔ)相關(guān)基因研究的不足。

1 材料與方法

從PlantFTDB(http：//planttfdb.gao-lab.org/family.php?sp=Egr&fam=ARF)數(shù)據(jù)庫中下載巨桉的基因序列信息和蛋白質(zhì)信息。在Pfam蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)下載基因的HMM Profile，并將其作為查詢(<0.001)搜索巨桉蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)。去除所有冗余序列后，將輸出的ARF蛋白序列提交給CDD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)、SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)和Pfam，以確認(rèn)保守的基因結(jié)構(gòu)域。所有非冗余高置信度基因均命名為巨桉基因，在巨桉中共分析和篩選出17個(gè)基因。

使用ExPASy的ProtParam tool(https：//web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行巨桉ARF蛋白理化性質(zhì)分析。利用SOPMA(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。應(yīng)用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行建模，分析ARF蛋白的3級(jí)結(jié)構(gòu)。

利用MEGA(https：//meme-suite.org/meme/index.html)對(duì)巨桉基因序列進(jìn)行分析，使用MEGA打開巨桉基因的fas格式氨基酸序列，用ClustalW算法對(duì)巨桉ARF氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，選擇距離模型p-distance構(gòu)建NJ樹，設(shè)置Bootstrap method值為1 000。

從巨桉數(shù)據(jù)庫(https：//eucgenie.org/)中獲取基因，將巨桉11條染色體上的位置信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mapchart軟件進(jìn)行染色體定位分析圖的繪制。巨桉基因結(jié)構(gòu)以及Motif結(jié)構(gòu)分析使用在線網(wǎng)站MEME(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)，將motif個(gè)數(shù)設(shè)定為10，其余參數(shù)均不變。

從桉樹功能基因組數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析巨桉基因家族成員各組織FPKM數(shù)值，利用TBtools(https：//github.com/CJ-Chen/TBtools)軟件進(jìn)行基因表達(dá)HEATMAP的繪制。

2 結(jié)果與分析

通過轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)CDD、Pfam和SMART保守結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定出17個(gè)巨桉基因，并對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析。根據(jù)理化性質(zhì)分析結(jié)果(表1)得知，巨桉基因的氨基酸數(shù)量為454～1 119個(gè)殘基，其中帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)在52～98，帶正電荷的殘基總數(shù)在56～93，最短的03433由454個(gè)氨基酸殘基組成，最長的03293和02178由1 119個(gè)氨基酸殘基組成。蛋白質(zhì)分子量為50 713.28～124 934.23 Da，其中03293的分子量最大，03433的分子量最小。巨桉ARF蛋白等電點(diǎn)處于5.37～8.38，其中04380、00923、02197 和03433等電點(diǎn)大于7.5，偏向于堿性。不穩(wěn)定系數(shù)在45.96～72.98，均大于40.00，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數(shù)在67.38～77.35，其中02480脂肪族指數(shù)最高，熱穩(wěn)定性最強(qiáng)；03433的脂肪族指數(shù)最低，熱穩(wěn)定性最差。親水性指數(shù)為-0.621～-0.276，親水指數(shù)較低，均小于0，為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位分析表明巨桉ARF均定位于細(xì)胞核中。

表1 巨桉ARF蛋白的理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of Eucalyptus grandis ARF protein

根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(表2)可知，巨桉ARF蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)卷曲組成。其中，無規(guī)卷曲占比最多，為44.41%～66.11%，其中02178占比最少，00588中占比最多。β-轉(zhuǎn)角占比最少，為2.57%～7.77%，04380中β-轉(zhuǎn)角占比最少，03293和02178中β-轉(zhuǎn)角占比最多。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)所示，巨桉ARF蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，主要以無規(guī)則卷曲為主(圖1)。

進(jìn)化樹聚類分析結(jié)果顯示，17個(gè)巨桉基因可分為4個(gè)亞群，其中第1亞群含有2個(gè)(00588、02480)，第2亞群含有4個(gè)(02838、04380、01240、00923)，第3亞群含有5個(gè)(02090、00264、02065、02178、03293)，第4亞群含有6個(gè)(02197、03551、01764、00888、00076、03433)成員(圖2)。親緣關(guān)系越近，基因的結(jié)構(gòu)越相似。

該研究發(fā)現(xiàn)，基因在巨桉染色體上的分布不均勻(圖3)。其中，染色體Chr8和Chr9上不含基因，Chr4和Chr11上含有3個(gè)基因，Chr2、Chr3、 Chr6和Chr7號(hào)染色體上有2個(gè)基因，Chr1、Chr5和Chr10號(hào)染色體上含有1個(gè)基因。

表2 ARF蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 2 Secondary structure of ARF proteins

圖1 巨桉ARF蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Tertiary structure of Eucalyptus grandis ARF protein

圖2 巨桉ARF基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ARF gene family of Eucalyptus grandis

圖3 巨桉ARF基因在染色體上的分布Fig.3 Chromosome distribution of ARF gene in Eucalyptus grandis

根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)04380、03433、00588、02838、00923和01240不含AUX_IAA結(jié)構(gòu)域(圖4)。且這6個(gè)ARF蛋白氨基酸殘基總數(shù)偏低(表1)。巨桉的基因Motif分析表明，17個(gè)基因中都存在Motif 1，02065、02480、03551、02178、03293、00264、00076含有的Motif最多共10個(gè)保守基序，04380含有的Motif最少只有Motif1、2、3、7共4個(gè)保守基序?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，巨桉均含有外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，但不同基因所含有的外顯子數(shù)目存在很大差異，其中04380最少為2個(gè)(圖4)。這些結(jié)果暗示不同基因結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)基因的功能產(chǎn)生不同的影響。

利用巨桉基因家族成員的不成熟木質(zhì)部、成熟葉片、韌皮部、樹根、莖尖、3個(gè)花期和幼葉中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明(圖5)，巨桉基因存在組織表達(dá)特異性。其中，01764和00888在幼葉中表現(xiàn)出組織特異性，能夠調(diào)控幼葉的成熟和發(fā)育。00076和02178在未成熟木質(zhì)部高量表達(dá)。02178、02090、02197、04380、00264、00588、00923、01240、02838、03293、02065和02480在開花的3個(gè)花期表達(dá)量高，其中04380、00264和00588在花部為特異性表達(dá)，暗示其可能調(diào)控花的生長發(fā)育。02090、03551、00923、01240和02838在根部高量表達(dá)，可能參與根部生長的調(diào)控。03433在幼葉和莖尖特異性表達(dá)，暗示其可能影響分生組織的發(fā)育。00076、02178、00923和02065在未成熟的木質(zhì)部大量表達(dá)，可能影響植物對(duì)無機(jī)鹽和水分的吸收。

圖4 巨桉ARF基因的特征分析Fig.4 Characterization of ARF gene in Eucalyptus grandis

圖5 巨桉ARF基因組織特異性表達(dá)分析Fig.5 Analysis of tissue-specific expression of ARF gene in Eucalyptus grandis

3 討論

測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了生物學(xué)在基因組層面解析基因家族特征和功能解析中的應(yīng)用。研究表明，基因具有重要的生物學(xué)功能，參與調(diào)控植物生長發(fā)育各個(gè)階段。該研究對(duì)巨桉基因進(jìn)行鑒定分析，共篩選出17個(gè)基因，大多數(shù)含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，且每個(gè)巨桉基因都含有B3結(jié)構(gòu)域。根據(jù)理化性質(zhì)分析屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，均定位于細(xì)胞核。巨桉基因在染色體上分布并不均勻，其中Chr8和Chr9染色體上不含基因。根據(jù)構(gòu)建NJ樹所得的結(jié)果，將17個(gè)巨桉基因劃分成4個(gè)亞族，與對(duì)葡萄和梨等的研究結(jié)果一致。該研究表明，基因在巨桉不同組織中均有表達(dá)，且存在組織特異性。例如02197在花發(fā)育的3個(gè)時(shí)期特異高量表達(dá)，預(yù)示著其可能影響巨桉的花期。00888和01764在幼葉特異性表達(dá)。03433在幼葉和莖尖特異性表達(dá)，暗示其能夠調(diào)控植物的分生組織發(fā)育。

4 結(jié)論

該研究利用生物信息學(xué)分析在巨桉中鑒定出17個(gè)，并進(jìn)一步綜合分析其理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、染色體定位、基因的結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)進(jìn)化和組織表達(dá)，發(fā)現(xiàn)巨桉相對(duì)保守且表達(dá)模式存在組織特異性，為深入探究巨桉各個(gè)成員之間的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。00076 和02178在未成熟木質(zhì)部呈現(xiàn)高表達(dá)，推測(cè)其可能在巨桉木材形成過程中發(fā)揮重要作用，這是后續(xù)研究的重點(diǎn)。