核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾的研究進(jìn)展

楊 雯，李婧影，楊黃浩

（教育部食品安全與生物學(xué)分析科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，能源與環(huán)境光催化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院 福建 福州 350108）

蛋白質(zhì)是細(xì)胞中含量最豐富的生物分子。天然的蛋白質(zhì)翻譯后修飾大大拓展了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性，從而使蛋白質(zhì)的功能增加了兩個(gè)數(shù)量級(jí)［1］。人工蛋白質(zhì)標(biāo)記物對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和許多生物技術(shù)至關(guān)重要，但一個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是合成均質(zhì)和位點(diǎn)特異性的偶聯(lián)物。為此，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了一系列人工蛋白質(zhì)共價(jià)修飾的策略。為了保持蛋白質(zhì)的生物活性，蛋白質(zhì)修飾策略通常需要滿(mǎn)足以下5個(gè)條件［2］：（1）蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)反應(yīng)必須耐受生物環(huán)境條件（pH 6~8，≤37℃，水性溶劑）；（2）不同于有機(jī)合成反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)條件（通常使用數(shù)十或數(shù)百mmol/L濃度的底物），體外和體內(nèi)應(yīng)用時(shí)蛋白質(zhì)濃度通常為μmol/L級(jí)別或以下，這可能造成反應(yīng)動(dòng)力學(xué)障礙；（3）保護(hù)基團(tuán)是傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)中實(shí)現(xiàn)化學(xué)選擇性合成的有力工具，但保護(hù)基團(tuán)可能會(huì)影響蛋白質(zhì)中活性氨基酸的功能，因此不能普遍使用；（4）在許多情況下，需要選擇性地將探針修飾到特定氨基酸上，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)明確的偶聯(lián)物；（5）在復(fù)雜擁擠的生物環(huán)境中修飾蛋白質(zhì)，還必須考慮修飾策略的蛋白質(zhì)選擇性。

最初的蛋白質(zhì)修飾策略是通過(guò)將蛋白質(zhì)暴露于親電試劑中實(shí)現(xiàn)。例如將n-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）酯用于蛋白質(zhì)共價(jià)修飾。NHS酯與蛋白質(zhì)表面不同的親核基團(tuán)反應(yīng)，其中最重要的是賴(lài)氨酸殘基。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)表面賴(lài)氨酸的豐度高，該反應(yīng)通常會(huì)產(chǎn)生異質(zhì)修飾蛋白質(zhì)［1］。因此，為了以可控的方式修飾蛋白質(zhì)以獲得均質(zhì)的蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物，近幾十年開(kāi)展了多種修飾策略。目前的主要策略之一是在蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中引入疊氮化物、烯烴、炔烴等修飾的非天然氨基酸。然而，這類(lèi)策略操作繁瑣，且修飾效果因不同蛋白而異［3］。此外，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)試劑還可實(shí)現(xiàn)選擇性地與蛋白質(zhì)的某個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)，例如磺?；┧徇x擇性靶向單個(gè)賴(lài)氨酸殘基，磺基苯并噻吩靶向半胱氨酸殘基等［4］。

除了蛋白質(zhì)中氨基酸反應(yīng)位點(diǎn)的選擇性，提高復(fù)雜環(huán)境中興趣蛋白（Proteins of interest，POI）的選擇性有助于共價(jià)修飾策略在生物領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。這類(lèi)策略主要依靠POI與配體相互識(shí)別驅(qū)動(dòng)的鄰近效應(yīng)來(lái)提高反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和選擇性（圖1），其分子探針主要包含三部分：用于識(shí)別POI的配體，用于與蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)反應(yīng)的基團(tuán)和用于檢測(cè)或進(jìn)一步調(diào)控蛋白功能的報(bào)告基團(tuán)［5-6］。其中，核酸介導(dǎo)的蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略被廣泛用于POI選擇性修飾，并被應(yīng)用于適配體篩選、藥物篩選、蛋白質(zhì)相互作用研究、蛋白糖基化檢測(cè)等領(lǐng)域。核酸具有易合成、熱穩(wěn)定性好、高度可編程、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，在某些“輔因子”的存在下還可以發(fā)揮催化性能［7］。因此，核酸介導(dǎo)的蛋白質(zhì)共價(jià)標(biāo)記策略近十年來(lái)受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。本文根據(jù)標(biāo)記探針?biāo)玫膶?dǎo)向配體分類(lèi)，綜述了核酸介導(dǎo)的蛋白質(zhì)共價(jià)標(biāo)記策略的發(fā)展及應(yīng)用。

圖1 核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略示意圖Fig．1 Scheme of nucleic acid-mediated protein covalent modification

1 小分子作為配體導(dǎo)向的核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略

2013年，Li團(tuán)隊(duì)［8］在核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)標(biāo)記領(lǐng)域做了開(kāi)創(chuàng)性工作，將這種策略命名為“DNA編程的光親和標(biāo)記（DNA-programmed photoaffinity labeling，DPAL）”（圖2A），并在策略?xún)?yōu)化和應(yīng)用方面做了一系列工作。DPAL是一種簡(jiǎn)單、模塊化和多路復(fù)用的方法，通過(guò)DNA模板化學(xué)可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行光親和性反應(yīng)標(biāo)記。這種方法中，特異結(jié)合POI的小分子修飾在模板DNA上組成結(jié)合探針（Binding probe，BP），光交聯(lián)基團(tuán)雙吖丙啶和一個(gè)信號(hào)標(biāo)簽被結(jié)合到互補(bǔ)DNA的兩端，構(gòu)成捕獲探針（Capture probe，CP）。結(jié)合探針首先與POI結(jié)合，隨后加入捕獲探針，結(jié)合探針與捕獲探針互補(bǔ)雜交，在紫外光照射下攜帶光交聯(lián)基團(tuán)的捕獲探針與POI共價(jià)偶聯(lián)。作者以三種POI混合物（親和素、碳酸酐酶和胰蛋白酶以1∶1∶1物質(zhì)的量比混合）和人宮頸癌細(xì)胞系HeLa的細(xì)胞裂解液作為模型，證明了DPAL在復(fù)雜環(huán)境中的靶標(biāo)識(shí)別和修飾能力，為準(zhǔn)確鑒定小分子結(jié)合蛋白提供了一種有價(jià)值的工具［8］。然而，雙吖丙啶與大多數(shù)蛋白的光交聯(lián)效率較低（僅為2%~8%），限制了DPAL在低豐度和低親和力蛋白中的應(yīng)用［9］。為了提高探針交聯(lián)效率，Li團(tuán)隊(duì)［9］在多種基團(tuán)中篩選出疊氮苯作為新的光交聯(lián)基團(tuán)，其交聯(lián)效率可達(dá)18．9%。此外，光交聯(lián)效率可隨著捕獲探針偶聯(lián)的疊氮苯數(shù)量增加而增加，偶聯(lián)疊氮苯數(shù)量為4時(shí)交聯(lián)效率可達(dá)38．3%（圖2B）。值得注意的是，這種多價(jià)的光交聯(lián)探針上疊氮苯數(shù)量不影響DPAL的POI選擇性。

對(duì)于已知的配體和POI，DPAL可應(yīng)用于檢測(cè)僅有一個(gè)結(jié)合表位的蛋白質(zhì)。例如Li團(tuán)隊(duì)［10］在后續(xù)研究中將其用于檢測(cè)親和素，檢出限可達(dá)4 nmol/L，且在復(fù)雜的細(xì)胞裂解液中仍顯示出出色的目標(biāo)特異性。作者還將此方法拓展用于檢測(cè)葉酸受體、血小板生長(zhǎng)因子和凝血酶［10］。該團(tuán)隊(duì)還進(jìn)一步通過(guò)設(shè)計(jì)捕獲探針的DNA序列長(zhǎng)度，將DPAL用于檢測(cè)組蛋白脫乙酰酶（HDAC）的關(guān)聯(lián)蛋白，發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)親和探針無(wú)法獲得的間接HDAC結(jié)合蛋白，并揭示了HDAC相關(guān)蛋白的新的生物學(xué)意義（圖2C和圖2D）［11］。這為表征蛋白質(zhì)之間的相互作用提供了一種廣泛適用的簡(jiǎn)單方法。

圖2 （A）DPAL示意圖［8］；（B）多價(jià)光交聯(lián)探針用于DPAL示意圖［9］；（C）多個(gè)CP在BP上的不同位點(diǎn)雜交，捕獲蛋白質(zhì)復(fù)合物中的直接和間接偶聯(lián)蛋白［11］；（D）光交聯(lián)劑在CP中可以是突出的（n＞0）或隱性的（n＜0）配置，L：一個(gè)已知的配體；星號(hào)：光交聯(lián)劑［11］Fig．2（A）Scheme of DPAL［8］．（B）Scheme of multivalent photoaffinity probe for DPAL［9］．（C）Multiple CP hybridize at different sites on BP for capturing the direct and indirect binders in protein complex［11］．（D）CP may have a“protruding”（n＞0）or“recessive”（n＜0）configuration．L：a known ligand；star：photo-crosslinker［11］

準(zhǔn)確鑒定具有生物活性的小分子的靶標(biāo)蛋白是生物醫(yī)學(xué)研究中一個(gè)非常重要且具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。許多具有生物活性的小分子往往不止一個(gè)靶點(diǎn)，DPAL方法可作為生物活性小分子靶標(biāo)蛋白鑒定的有效工具。Li團(tuán)隊(duì)［12］采用DPAL方法鑒定一種高度特異性的極光激酶A（Aurora kinase A，AKA）抑制劑Alisertib的靶標(biāo)。其中，Alisertib是一種具有抗癌活性的臨床候選藥物。除了已知的AKA靶標(biāo)外，還證實(shí)Alisertib與p38絲裂原活化蛋白激酶和層粘連蛋白受體具有相互作用，其抗癌活性可能與此有關(guān)。這項(xiàng)工作有助于從分子層面理解Alisertib作為臨床候選藥物的療效和副作用。此外，得益于DPAL在復(fù)雜環(huán)境中的靶點(diǎn)選擇和共價(jià)結(jié)合能力，Li團(tuán)隊(duì)［13-14］將其用于未固定和未純化蛋白質(zhì)配體的篩選，并通過(guò)篩選得到了活細(xì)胞上葉酸受體、碳酸酐酶12和活細(xì)胞上的表皮生長(zhǎng)因子受體的一系列新型配體［15］。這些結(jié)果證明DPAL在活細(xì)胞膜蛋白配體篩選中的廣泛使用性，有助于膜蛋白為靶點(diǎn)時(shí)藥物的發(fā)現(xiàn)。

金屬蛋白占所有天然蛋白的三分之一以上，參與了許多重要的生理功能。為了進(jìn)行金屬蛋白的共價(jià)標(biāo)記，Gothelf團(tuán)隊(duì)［16］開(kāi)發(fā)了一種基于氨三乙酸（Nitrilotriacetic acid，NTA）修飾的DNA模板指導(dǎo)的共價(jià)偶聯(lián)（DNA-templated protein conjugation，DTPC）策略（圖3A）。NTA可為金屬離子提供四個(gè)配位鍵，具有強(qiáng)絡(luò)合能力，能與各種金屬離子形成穩(wěn)定的螯合物。三價(jià)NTA修飾的DNA模板鏈引導(dǎo)活化的NHS酯修飾的互補(bǔ)DNA鏈靠近金屬結(jié)合位點(diǎn)附近的Lys，隨后發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，生成共價(jià)DNA-金屬蛋白產(chǎn)物。DTPC策略成功應(yīng)用于His標(biāo)記的重組綠色熒光蛋白和天然金屬結(jié)合蛋白血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的共價(jià)修飾。作者還利用該策略通過(guò)恒域組氨酸簇標(biāo)記IgG1抗體。然而，由于NHS酯易水解的固有性質(zhì)，標(biāo)記探針的保存和處理?xiàng)l件要求嚴(yán)格。此外，由于NHS的固有反應(yīng)性，需將蛋白控制在低濃度以防止隨機(jī)交聯(lián)。為了解決這些問(wèn)題，Gothelf團(tuán)隊(duì)［17］將互補(bǔ)DNA鏈的共價(jià)反應(yīng)基團(tuán)改為醛基，從而允許在更高濃度下進(jìn)行目標(biāo)蛋白的標(biāo)記。

隨后，Gothelf團(tuán)隊(duì)［18］將DTPC策略應(yīng)用于制備抗體-藥物的偶聯(lián)物，并用于抗癌藥物在活細(xì)胞中的靶向遞送。首先將表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體西妥昔單抗偶聯(lián)到DNA上，隨后通過(guò)雙鏈DNA與阿霉素（DOX）的相互作用形成抗體-化學(xué)藥物偶聯(lián)物（圖3B）。偶聯(lián)物中的DNA雙鏈作為阿霉素的載體，西妥昔單抗作為靶向劑，提高阿霉素對(duì)癌細(xì)胞的遞送效率并降低其全身毒性。作者通過(guò)對(duì)比兩株EGFR+細(xì)胞株（人口腔表皮樣癌細(xì)胞系KB和人乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231）和一株EGFR-細(xì)胞株（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH-3T3），研究了偶聯(lián)物的體外細(xì)胞毒性和選擇性殺傷癌細(xì)胞的能力。結(jié)果顯示在EGFR過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中，抗體-化學(xué)藥物偶聯(lián)物比游離阿霉素的細(xì)胞毒性更強(qiáng)，這表明偶聯(lián)物具有良好的靶細(xì)胞選擇性。DTPC策略為DNA-蛋白質(zhì)偶聯(lián)提供了一種便捷有效的途徑，并為抗體-化學(xué)藥物的開(kāi)發(fā)提供了新思路。

圖3 （A）DTPC策略介導(dǎo)修飾His6標(biāo)記的綠色熒光蛋白［16］；（B）通過(guò)DTPC制備西妥昔單抗-DNA偶聯(lián)物，并將DOX嵌入偶聯(lián)物的示意圖［18］Fig．3（A）DTPC mediated coupling of an activated ester to His6-tagged green fluorescent proteins［16］．（B）Schematic illustration of preparation of the cetuximab-DNA conjugate by DTPC and intercalation of DOX into the complex［18］

2 多肽作為配體導(dǎo)向的核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略

根據(jù)類(lèi)似的原理，多肽也被用于輔助核酸介導(dǎo)的蛋白質(zhì)共價(jià)修飾。組蛋白翻譯后修飾（Histone posttranslational modifications，HPTMs）是染色質(zhì)基因表達(dá)的遺傳和表觀遺傳調(diào)控的關(guān)鍵決定因素。因此，鑒定這些組蛋白的相互作用蛋白對(duì)于理解潛在的基因表達(dá)和表觀遺傳的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。然而，由于與HPTMs的相互作用短暫、親和力低，分析這些相互作用蛋白仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。Zhang團(tuán)隊(duì)［19-20］報(bào)道了利用DPAL標(biāo)記和富集組蛋白相互作用蛋白的雙探針（圖4A）。通過(guò)使用包含HPTMs的多肽修飾的結(jié)合探針和雙吖丙啶修飾的捕獲探針，將低親和力和動(dòng)態(tài)的HPTMs相互作用轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的共價(jià)相互作用，為HPTMs圖譜分析提供了一種新的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具。此外，Gothelf團(tuán)隊(duì)［21］開(kāi)發(fā)了一種肽引導(dǎo)靶向識(shí)別的核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)標(biāo)記策略，用于組裝人造免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）。在這項(xiàng)工作中，小FC-III K肽與結(jié)合探針結(jié)合，引導(dǎo)捕獲探針接近POI并共價(jià)偶聯(lián)。該反應(yīng)可以在復(fù)雜的生物環(huán)境如細(xì)胞裂解液中成功執(zhí)行。作者進(jìn)一步設(shè)計(jì)和制備了由5個(gè)DNA-利妥昔單抗偶聯(lián)物構(gòu)建的星形五聚DNA抗體納米結(jié)構(gòu)。透射電鏡分析表明其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和尺寸與天然IgM相似（圖4B），從而為人造IgM提供了新思路。然而，可能是受限于多肽-蛋白質(zhì)配對(duì)的種類(lèi)和數(shù)量，截止目前，利用多肽作為配體導(dǎo)向的核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略的研究較少。

圖4 （A）DPAL用于HPTM相互作用蛋白的鑒定［19］；（B）典型的單一偽IgM結(jié)構(gòu)（i）及野生型IgM結(jié)構(gòu)（ii）的透射電鏡圖［21］Fig．4（A）Identification of HPTM reader proteins by DPAL［19］．（B）TEM images of representative single pseudo IgM structures（i）and wildtype IgM（ii）［21］

3 適配體作為配體導(dǎo)向的核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略

適配體是具有特殊分子、細(xì)胞甚至組織選擇性的單鏈DNA或RNA序列，主要通過(guò)非共價(jià)相互作用識(shí)別各種靶點(diǎn)。它通常由配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）方法篩選得到，可用于生物傳感、生物成像、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)制、疾病診斷和治療［22］。然而，由于適配體與靶標(biāo)之間不穩(wěn)定的非共價(jià)相互作用，脫靶效應(yīng)時(shí)有發(fā)生，這使得在復(fù)雜環(huán)境下的適配體-靶標(biāo)復(fù)合物純化和提取變得困難。為了克服這一瓶頸，F(xiàn)amulok團(tuán)隊(duì)［23］開(kāi)創(chuàng)了一種通用策略，命名為基于適配體的親和標(biāo)記（Aptamer-based affinity labeling，ABAL），用于復(fù)雜樣本中適配體目標(biāo)的識(shí)別（圖5A）。在ABAL中，光反應(yīng)性疊氮苯基和生物素共同修飾在適配體序列的5′端，其中疊氮苯基起交聯(lián)劑作用，生物素標(biāo)記作為信號(hào)基團(tuán)標(biāo)記適配體-蛋白質(zhì)綴合物。適配體識(shí)別POI后，疊氮苯基在紫外光照射下與蛋白發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，從而使適配體和POI穩(wěn)定結(jié)合。作者分別在血液、細(xì)胞裂解液和活細(xì)胞中采用三種不同的適配體-蛋白對(duì)驗(yàn)證了ABAL的可行性。Yang團(tuán)隊(duì)［24］開(kāi)發(fā)了一種類(lèi)似的光親和探針策略，利用雙吖丙啶作為交聯(lián)劑，用于目標(biāo)蛋白-適配體特異性偶聯(lián)。類(lèi)似地，Tan團(tuán)隊(duì)［25］以氟修飾羧基作為交聯(lián)劑成功進(jìn)行了適配體和特異性蛋白的偶聯(lián)。基于此，Zhang團(tuán)隊(duì)［26］開(kāi)發(fā)了一種適配體探針?lè)治鼋M蛋白H4適配體結(jié)合域。該探針包含組蛋白H4特異性識(shí)別的DNA序列、用于光交聯(lián)的疊氮苯基、用于親和富集交聯(lián)產(chǎn)物的生物素標(biāo)簽，以及用于從交聯(lián)產(chǎn)物中分離組蛋白的可切割二硫基。作者成功地實(shí)現(xiàn)了組蛋白H4的特異性富集，并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了一種新的組蛋白適配體相互作用的分析策略，首次對(duì)組蛋白H4與適配體的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行了研究和討論。該策略顯示出巨大的潛力，可有助于理解組蛋白與DNA的相互作用模式。

此外，Bertozzi團(tuán)隊(duì)［27］開(kāi)發(fā)了一種基于適配體鄰近增強(qiáng)生物正交反應(yīng)的活細(xì)胞特定蛋白糖基化類(lèi)型檢測(cè)策略（圖5B）。在這一策略中，細(xì)胞預(yù)先通過(guò)糖代謝標(biāo)記使蛋白上的特定糖基攜帶疊氮基團(tuán)，隨后進(jìn)行二苯并環(huán)辛（DBCO）修飾的適配體偶聯(lián)。通過(guò)質(zhì)譜、蛋白免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了酪氨酸蛋白激酶-7受體和B細(xì)胞受體的重鏈的糖基類(lèi)型，并首次證明酪氨酸蛋白激酶-7含有唾液酸化類(lèi)型的糖基。此策略為驗(yàn)證特定蛋白的糖基化提供了一種有力的工具。隨后，Tan團(tuán)隊(duì)［28］在適配體和DBCO之間引入一個(gè)光可裂解的鄰硝基芐苯基團(tuán)，通過(guò)紫外照射裂解鄰硝基芐苯基團(tuán)，隨后通過(guò)互補(bǔ)DNA雜交去除適配體，并重復(fù)此過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白的多色成像和細(xì)胞表面納米工程的多重修飾。除了用于檢測(cè)和成像，Tan團(tuán)隊(duì)［29］還在活癌細(xì)胞上選擇性識(shí)別和偶聯(lián)治療性適配體，以提高抗癌治療的效率和準(zhǔn)確性。該工作將免疫檢查點(diǎn)拮抗適配體共價(jià)結(jié)合在癌細(xì)胞表面，實(shí)現(xiàn)有效和持續(xù)的免疫檢查點(diǎn)封鎖治療，顯著延長(zhǎng)了小鼠的整體生存時(shí)間。

圖5 （A）基于適配體的親和標(biāo)記原理示意圖：與靶蛋白孵育后，紫外光照使適配體與靶蛋白交聯(lián)。隨后，用鏈霉親和素修飾的磁珠孵育，得到純化適配體蛋白復(fù)合物［23］；（B）在活細(xì)胞表面特定蛋白糖基化類(lèi)型檢測(cè)的示意圖：用5′端和3′端分別帶有DBCO和報(bào)告基團(tuán)的適配體處理細(xì)胞。核酸適配體結(jié)合使DBCO優(yōu)先結(jié)合到同一糖蛋白上鄰近的疊氮標(biāo)記的唾液酸殘基［27］Fig．5（A）Principle of aptamer-based affinity labeling．After incubation with its target protein，UV light is used to cross-link the aptamer to its target．Subsequent incubation with streptavidin-coated magnetic beads allows purification of the aptamer-protein complex［23］．（B）A chemical strategy for the selective labeling of protein glycoforms on live cell surfaces．Azide group labeled cells are treated with a functionalized aptamer bearing a DBCO and a reporter group on the 5′and 3′termini，respectively．Aptamer binding positions the DBCO to ligate preferentially to SiaNAz residues in proximity on the same glycoprotein［27］

不同于直接在適配體上修飾交聯(lián)劑的蛋白修飾策略，Zhang團(tuán)隊(duì)［30］開(kāi)發(fā)了一種以DNA為模板的適配體探針，用于鑒定適配體的靶標(biāo)蛋白（圖6A）。與DPAL類(lèi)似，該探針由包含適配體的結(jié)合探針和含雙吖丙啶的捕獲探針組成。這類(lèi)探針的交聯(lián)劑不直接修飾在適配體序列上，從而降低了對(duì)適配體構(gòu)型的影響。作者以溶菌酶作為模型，證明該策略可用于復(fù)雜和真實(shí)環(huán)境下目標(biāo)蛋白的精確識(shí)別。無(wú)獨(dú)有偶，Tan團(tuán)隊(duì)［31］選擇NHS脂作為反應(yīng)基團(tuán)構(gòu)建了相似的探針，并證明了這種探針可用于活細(xì)胞膜蛋白共價(jià)標(biāo)記。本課題組結(jié)合DNA為模板的適配體探針和糖代謝標(biāo)記，開(kāi)發(fā)了一種DNA為模板的糖基標(biāo)記策略，并將其應(yīng)用于活細(xì)胞膜受體的空間分布成像（圖6B）［32］。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果說(shuō)明DNA探針共價(jià)標(biāo)記在目標(biāo)受體的糖基上，最大限度地減少了對(duì)內(nèi)源性受體固有結(jié)構(gòu)和功能的干擾。由于寡核苷酸具有精確的可編程性和功能靈活性，選擇性DNA標(biāo)記可直接應(yīng)用于其他場(chǎng)景，如操縱受體空間分布和生物功能?？傊?，這種受體特異性結(jié)合策略將極大地推動(dòng)受體的動(dòng)態(tài)和功能研究，并有助于理解受體在其自然環(huán)境中的生物學(xué)機(jī)制。

圖6 （A）基于DNA模板化學(xué)和光交聯(lián)技術(shù)的適配體探針用于溶菌酶檢測(cè)示意圖［30］。步驟1：結(jié)合探針與溶菌酶共孵育；步驟2：加入捕獲探針使其與結(jié)合雜交形成復(fù)合物；步驟3：紫外光照射引發(fā)光交聯(lián)反應(yīng)；步驟4：標(biāo)記熒光基團(tuán)或生物素用于凝膠成像或產(chǎn)物富集；步驟5：質(zhì)譜分析；（B）用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中特定受體空間分布的DNA模板化糖基標(biāo)記策略示意圖［32］。步驟1：糖代謝標(biāo)記細(xì)胞；步驟2：結(jié)合模塊（Binding moiety，BM）：操作模塊（Handle moiety，HM）識(shí)別特定受體并共價(jià)偶聯(lián)；步驟3：加入CDNA通過(guò)鏈置換反應(yīng)將BM從特定受體移除Fig．6（A）Schematic representation of aptamer probe for lysozyme detection based on DNA templated chemistry and photo crosslinking technology［31］．Step 1：incubation of aptamer with lysozyme．Step 2：the addition of CP probe to initiate BP/CP hybridization．Step 3：UV-irradiation to initiate photo-crosslinking．Step 4：the labeling with a fluorophore or biotin for in-gel imaging or enrichment．Step 5：MS analysis；（B）Schematic illustration of a DNA-templated glycan labeling strategy for monitoring specific receptor spatial distribution in living cells［32］．Step 1：metabolic oligosaccharide engineering of cells．step 2：BM∶HM recognition then conjugation．Step 3：BM removing via strand displacement reaction with the CDNA

除了作為POI的靶向配體和引導(dǎo)共價(jià)交聯(lián)的模板，核酸還可與輔因子結(jié)合作為共價(jià)標(biāo)記反應(yīng)的催化劑。G-四聯(lián)體/氯高鐵血紅素（Gq/h）是一種核酸結(jié)構(gòu)增強(qiáng)的氧化物酶模擬物，近兩年被應(yīng)用于蛋白質(zhì)催化標(biāo)記。Oyoshi課題組［33］開(kāi)發(fā)了一種以Gq/h作為模擬酶、n-甲基魯米諾衍生物作為底物，對(duì)G-四聯(lián)體結(jié)合蛋白進(jìn)行鄰近標(biāo)記的技術(shù)（圖7A）。作者證明可在牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）的干擾下特異性標(biāo)記RNA G-四聯(lián)體TERRA的結(jié)合蛋白UP1，并確定標(biāo)記位點(diǎn)是結(jié)合位點(diǎn)附近的Y167酪氨酸殘基。此外，作者還對(duì)HeLa細(xì)胞裂解液進(jìn)行標(biāo)記和nanoLC-MS/MS分析，表明RNA結(jié)合蛋白得到顯著的富集，并鑒定出一些此前未報(bào)道的G-四聯(lián)體結(jié)合蛋白。這些結(jié)果表明，該G-四聯(lián)體蛋白鄰近標(biāo)記技術(shù)有望用于識(shí)別未知的G-四聯(lián)體結(jié)合蛋白。此外，Albada課題組［34］觀察到G-四聯(lián)體序列和折疊構(gòu)象與蛋白質(zhì)修飾效率的相關(guān)性，其中氯高鐵血紅素與平行的G-四聯(lián)體序列結(jié)合比與反平行的G-四聯(lián)體序列結(jié)合具有更高的催化活性。作者還通過(guò)結(jié)合DNA鏈置換反應(yīng)賦予Gq/h的蛋白催化標(biāo)記反應(yīng)可編程和可操控的性質(zhì)。

不同于直接利用Gq/h標(biāo)記G-四聯(lián)體的結(jié)合蛋白，本團(tuán)隊(duì)發(fā)展了一種以適配體和Gq/h為基礎(chǔ)的非基因工程探針Apt-Gq/h，并用于在活細(xì)胞中標(biāo)記POI的潛在相互作用蛋白（圖7B）［35］。在Apt-Gq/h中，核酸適配體作為將探針特異性結(jié)合到目標(biāo)蛋白的“錨”，從而使Gq/h鄰近催化標(biāo)記反應(yīng)的POI范圍大大拓展。同時(shí)，Gq/h作為催化劑，在H2O2活化下快速氧化帶生物素標(biāo)簽的苯酚底物轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)活性的苯氧基自由基。苯氧基自由基的半衰期短（＜1 ms）、擴(kuò)散半徑?。ǎ?0 nm），僅與目標(biāo)蛋白附近20 nm內(nèi)蛋白質(zhì)上的富電子氨基酸發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，從而使?jié)撛诘南嗷プ饔玫鞍讕仙锼貥?biāo)簽。收集這些標(biāo)記的蛋白并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，即可得到關(guān)于POI的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。作者利用這種探針研究了間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)換因子受體的蛋白微環(huán)境，為蛋白質(zhì)相互作用研究提供了一種有潛力的工具。

圖7 （A）（i）具有過(guò)氧化物酶活性的氯高血紅素催化標(biāo)記血紅素蛋白示意圖［33］；（ii）平行構(gòu)象的G-四聯(lián)體與氯高血紅素結(jié)合，使其過(guò)氧化物酶活性增強(qiáng)，G-四聯(lián)體氯高血紅素復(fù)合物能選擇性標(biāo)記G-四聯(lián)體結(jié)合蛋白［33］；（B）核酸探針用于鄰近標(biāo)記示意圖Fig．7（A）（i）Hemin-catalyzed protein labeling hemeprotein based on peroxidase activity of hemin［33］．（ii）Peroxidase activity of hemin is increased by the binding with parallel G-quadruplex structural DNA or RNA．Proximity labeling around the G4-hemin complex enables selective labeling of G4-binding proteins［33］．（B）Schematic illustration of the nucleic acid tool for proximity labeling［35］

4 結(jié)論

蛋白質(zhì)是自然界中重要的生物分子，選擇性的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾為從分子層面研究生理機(jī)制和靶向藥物開(kāi)發(fā)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。我們以導(dǎo)向的配體分類(lèi)，回顧了核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾的各種策略。這些策略的成功，得益于核酸固有的特性：（i）核酸作為天然存在的生物大分子，其生物相容性佳；（ii）核酸探針通過(guò)固相合成法制備，易于添加修飾基團(tuán)，便于商業(yè)化銷(xiāo)售；（iii）具有可精準(zhǔn)設(shè)計(jì)和編程的特性，可以靈活設(shè)計(jì)多種探針；（iv）特殊序列的功能核酸具有特異性識(shí)別或催化的特性。因此，核酸在這類(lèi)策略中可作為配體實(shí)現(xiàn)共價(jià)修飾的選擇性，作為模板輔助反應(yīng)基團(tuán)與蛋白質(zhì)靠近，還可作為催化劑增強(qiáng)鄰近區(qū)域的蛋白質(zhì)修飾反應(yīng)。

一方面，核酸介導(dǎo)的蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略的應(yīng)用方向受導(dǎo)向的配體種類(lèi)影響。共價(jià)修飾策略將不穩(wěn)定和動(dòng)態(tài)的配體-靶標(biāo)相互作用改變?yōu)榉€(wěn)定的共價(jià)結(jié)合作用，大大降低了POI本身的復(fù)雜性、動(dòng)態(tài)特性以及生物系統(tǒng)的復(fù)雜性。因此，小分子和核酸適配體作為配體導(dǎo)向的修飾策略用于鑒定各自的作用靶點(diǎn)，或篩選針對(duì)特定POI的小分子藥物或適配體。如何發(fā)現(xiàn)有效和特定的配體結(jié)合的生物靶標(biāo)是化學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，這與藥物開(kāi)發(fā)密切相關(guān)，因此也是未來(lái)核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略的重點(diǎn)應(yīng)用方向之一。另一方面，核酸介導(dǎo)的蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略用于豐富POI的可操縱性，例如構(gòu)建人造IgM、抗體-化學(xué)藥物和研究生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的相互作用等。生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的相互作用研究有助于從分子水平理解各種疾病的發(fā)生和發(fā)展，照亮藥物開(kāi)發(fā)中尋找POI的道路。然而，不論是哪種配體導(dǎo)向的核酸介導(dǎo)蛋白質(zhì)共價(jià)修飾策略，都基于配體-蛋白質(zhì)識(shí)別從而拉近反應(yīng)基團(tuán)距離，提高有效反應(yīng)濃度這一基本原理，并不能完全杜絕非特異性蛋白的共價(jià)修飾。因此，共價(jià)反應(yīng)基團(tuán)是影響修飾策略POI選擇性的重要因素，也是未來(lái)發(fā)展修飾策略的重點(diǎn)研究方向。我們相信，隨著蛋白質(zhì)選擇性修飾策略的發(fā)展，必將產(chǎn)生新的基礎(chǔ)生物學(xué)知識(shí)和和治療應(yīng)用。